Protease tinh sạch từ tôm sú Penaeus monodon và một số tính chất cơ bản

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2015 32 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG PROTEASE TINH SẠCH TỪ TÔM SÚ Penaeus monodon VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT CƠ BẢN PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF PROTEASE FROM BLACK TIGER SHRIMP Penaeus monodon Nguyễn Lệ Hà1 Ngày nhận bài: 14/5/2014; Ngày phản biện thông qua: 18/8/2014; Ngày duyệt đăng: 10/6/2015 TÓM TẮT Nghiên cứu đã thực hiện tinh sạch protease từ gan tụy tôm sú và sử dụng để xác định một số tính chất cơ bản. Hệ protease tôm gồm ít nhất năm loại khác nhau, với ba loại chính quyết định hoạt tính của chúng có phân tử lượng từ 20.200 - 25.000 Da. Protease gan tụy tôm thuộc nhóm protease serine, trong đó các enzyme tựa trypsin đóng vai trò chủ đạo hoạt động. Từ khóa: Tôm sú, protease, enzyme tiêu hóa, trypsin, chymotrypsin ABSTRACT Proteases were purifi ed from hepatopancreas of Black Tiger Shrimp Penaeus monodon. Protease fraction in shrimp consisted of at least fi ve different proteases, three of them (with molecular weights from 20.200 - 25.00 Da) were mainly responsible for the fraction activity. Protease from shrimp Penaeus monodon belonged to serine proteases with trypsin-like responsible for the main activity. Key words: Black Tiger shrimp, protease, digestive enzyme, trypsin, chymotrypsin 1 TS. Nguyễn Lệ Hà: Trường Đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC I. ĐẶT VẤN ĐỀ Protease là nhóm enzyme phổ biến trong nguyên liệu thủy sản, chịu trách nhiệm chính trong quá trình tự phân giải của các protein mô cơ sau khi động vật chết, chúng cũng đóng vai trò gián tiếp trong hiện tượng biến đen của tôm. Nhiều sản phẩm lên men truyền thống như nước mắm, cá ủ chua được sản xuất dựa trên hoạt động của hệ enzyme có sẵn trong nguyên liệu. Protease cũng đã được tách chiết hoặc tinh chế và sử dụng như phương tiện trợ giúp hiệu quả ở rất nhiều lĩnh vực sản xuất và ngày càng đóng vai trò quan trọng hơn trong công nghệ thực phẩm. Tiềm năng ứng dụng của protease là vô cùng to lớn, vì vậy, nhiều nhà nghiên cứu đã thực hiện tách chiết chúng từ các nguyên liệu khác nhau và xác định tính chất để ứng dụng vào thực tế sản xuất. Cho tới thời điểm hiện tại, chúng ta đã có khá nhiều thông tin về các protease trong dạ dày, ruột và gan tụy của nhiều động vật thủy sản ở các vùng nước lạnh (Haard, 1994), tuy nhiên, thông tin về protease của các thủy sản nuôi trồng trên địa phận Việt nam vẫn còn rất ít. Nghiên cứu này hướng tới mục đích tinh sạch protease từ tôm sú nuôi ở biển Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh và xác định một số tính chất của chúng. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu: Tôm sú sống (cỡ 40-50 con/kg) được vận chuyển từ ao nuôi về phòng thí nghiệm trong bình sục khí, giết chết bằng cách trộn với đá lạnh sau đó tách nội tạng để riêng trong túi PE, bảo quản ở -20oC và lấy ra khi cần nghiên cứu, thời gian bảo quản không quá bốn tuần. Tinh sạch protease: Toà n bộ quá trì nh tá ch chiế t và tinh sạch enzyme đượ c thự c hiệ n ở nhiệ t độ 0-4oC. Nộ i tạ ng tôm được nghiề n nhỏ và chiết rút Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 33 bằng Tris-HCl 0,05M pH7,5 theo tỉ lệ nguyên liệu: dung môi 1: 3(w/v) trong 60 phút sau đó ly tâm (6000 vò ng/ph, 15 phú t) thu dị ch chiế t, kế t tủ a dị ch chiế t vớ i (NH4)2SO4 70% trong 70 phút rồi ly tâm (tương tự như trên) sau đó loại muối qua đêm bằng màng thẩm tích. Cặ n thu được hòa tan trong đệm photphat pH7 rồi đem tách trên sắc ký lọc gel Bio-Gel P-100 sử dụng cột 50x1,5cm của Bio- Rad. Tốc độ dòng 0,14 ml/ phút, thu phân đoạn (2ml/phân đoạn). Xác định trọng lượng phân tử của protease: Dùng phương pháp điện di Zymogram trên điện di đứng Bio-Rad với gel gom 4%, gel phân tán 12% có bổ sung cơ chất casein 0,1% ở hiệu điện thế 110V, cường độ dòng điện 30A trong thời gian hai giờ. Xác định hàm lượng protein: Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford (Bradford, 1976) dùng albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn. Xác định hoạt độ protease: thực hiện theo phương phá p Amano (Amano, 2002) dù ng casein từ sữ a (Merck) là m cơ chấ t. Mộ t đơn vị hoạ t độ protease (U) đượ c đị nh nghĩ a là lượ ng enzyme để tạ o ra lượ ng amino acid tương đương vớ i 100µg tyrosine trong 60 phú t ở điề u kiệ n nhiệ t độ 37±0,5 oC. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ muối NaCl đến hoạt độ protease: được xác định bằng cách cho enzyme tác dụng với cơ chất casein ở các pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl quan tâm khi xác định hoạt độ. Độ bền nhiệt của protease: khảo sát bằng cách ủ enzyme ở nhiệt độ quan tâm 30 phút, sau đó đo hoạt tính còn lại bằng phương pháp Amano. Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ protease: nghiên cứu bằng cách bổ sung chất định thử với nồng độ 0,001M vào phản ứng xác định hoạt tính enzyme. Ảnh hưởng của một số chất ức chế đặc hiệu đến hoạt độ protease: xác định bằng cách ủ chất định thử với cùng thể tích enzyme sao cho đảm bảo đúng nồng độ thích hợp cần thiết, giữ ở 250C trong 15 phút (Garcia-Carreno, 1992), sau đó xác định hoạt tính protease còn lại. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Tinh sạch protease từ tôm sú Hình 1. Sắc ký đồ lọc gel tinh sạch chế phẩm enzyme CPE protease nội tạng tôm Quá trình tinh sạch protease tôm được tóm tắt trong bảng 1. Sắc ký lọc gel thực hiện trên protease tôm sú ghi nhận một đỉnh hoạt độ chủ yếu duy nhất (hình 1) không hề trùng lắp với đỉnh protein ở phía sau cho thấy hiệu quả cao của công đoạn tinh sạch: phần lớn protein có hoạt tính thấp được loại bỏ, nhờ vậy, protease thu nhận có hoạt tính riêng cao và độ tinh sạch tăng lên 16,27 lần. Bảng 1. Tóm tắt quá trình tinh sạch protease Bước tinh sạch Tổng hàm lượng protein (mg) Tổng đơn vị hoạt độ protease (U) Hoạt độ riêng (U/mg protein) Hiệu suất (%) Độ tinh sạch (lần) Dịch chiết 655,78 16132,50 24,60 1,00 1,00 Chế phẩm enzyme 169,72 10025,86 59,07 62,15 2,40 Lọc gel 9,75 3902,40 400,25 24,19 16,27 2. Trọng lượng phân tử của protease Điện di đồ protease tôm sú có năm vạch, với ba vạch rõ ràng tương ứng với ba protease A, B, C có phân tử lượng 20.200, 22.000 và 25.000 Da. Dựa vào độ lớn và rõ ràng của vạch có thể suy ra đây là ba protease chủ yếu trong nội tạng tôm, trong đó loại B tỏ ra chiếm ưu thế hơn cả, sau đó là C và cuối cùng là A. Hai vạch protease D, E ở phía trên có phân tử lượng lần lượt là 35.000 và 40.200 Da. Sự mờ nhạt của các vạch này chứng tỏ chúng tồn tại trong hệ protease tôm nhưng hoạt tính thật sự rất nhỏ, gần như không đáng kể. Nếu so sánh hệ protease trong nội tạng tôm sú Việt Nam với hệ protease trong bộ phận tiêu hóa ở tôm sú Đài Loan (Jiang, 1991) ta sẽ thấy một số khác biệt: Protease trong tôm Việt nam có năm loại so với bốn ở tôm Đài Loan. Tuy nhiên điểm đáng chú ý là ở cả hai loại tôm đều có ba protease chủ yếu với trọng lượng phân tử tương đối thấp và gần nhau, mặc dù protease trong tôm Việt Nam đang được nghiên cứu Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2015 34 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG có phân tử lượng hơi cao hơn một chút (20.200, 22.000, 25.000 Da) so với 18.500, 20.900 và 23.300 Da (bao gồm hai trypsin và một chymotrypsin). Điều này khá tương đồng với kết luận được rút ra khi nghiên cứu về protease trên bốn loài tôm P. vannamei, P. monodon, P. stylirostris và P. californiensis của Albuquerque-Cavalcanti (2001), các protease chính (được xác định là trypsin) có trọng lượng phân tử trong khoảng 17.000-22.000 Da. Nghiên cứu trên cá chỉ vàng Pricanthus macracanthus đánh bắt ở Thái Lan (Pham, 2006) cũng xác định loại trypsin trong ruột cá này có phân tử lượng 23.800 Da, Simpson (1984) thì lại chỉ ra phân tử lượng của trypsin ở cá tuyết Atlantic, cá tuyết Greenland lần lượt là 24.000 và 23.500 Da. duy trì hoạt độ tốt (hơn 80% so với cực đại) khi tăng nhiệt độ lên tới 670C. Việc tiếp tục tăng nhiệt độ lên cao nữa có tác dụng làm giảm hoạt tính của protease nhanh và gần như bị vô hoạt tại 870C. Nhiệ t độ tố i thí ch củ a protease từ nội tạng và đầu tôm sú 620C thấ p hơn so vớ i protease từ nộ i tạ ng tôm P. orientalis (Oh và cộng sự, 2000) là 700C và cao hơn so với tôm P. kerathurus và P. japonicus là 500C (Galgani, 1984). So với tôm sú P. monodon của Đài loan với nhiệt độ tối thích là 55 và 650C (Jiang, 1991) và tôm bộp, tôm rảo đánh bắt từ biển (Nguyễn Văn Lệ, 1996) hoạt động thích hợp nhất ở 550 và 600C, tôm sú Việt Nam chỉ thể hiện hoạt tính tối đa ở một nhiệt độ là 620C. Protease trong tôm sú nuôi cũng có nhiệt độ tối thích cao hơn so với của protease thịt tôm là 500C theo công bố của Nguyễn Việt Dũng (1999), điều này cho thấy hệ protease trong nội tạng và thịt tôm không giống nhau. Protease nôi tạng cá thu, cá ngừ và gan mực ống đánh bắt ở biển Việt Nam cũng có nhiệt độ tối thích khá cao là 550C (Đỗ Văn Ninh, 2004). Như vậy, protease tôm sú nuôi Việt Nam có nhiệt độ tối thích khá cao và đây chính là một lợi thế lớn cho ứng dụng vào sản xuất vì sẽ khống chế được khá nhiều vi sinh vật gây thối. 4. Độ bền nhiệt của protease sau tinh sạch Trong hình 4 là đồ thị thể hiện độ bền nhiệt của protease tôm sú ở các nhiệt độ khác nhau. Chúng tỏ ra bền với nhiệt độ trong khoảng 37-520C, thậm chí ở 520C, protease còn hơn 90% hoạt độ, chỉ từ nhiệt độ 570C trở đi, con số này mới giảm nhanh và bị vô hoạt gần như hoàn toàn sau 30 phút ủ ở 770C. Nghiên cứu trên protease nội tạng tôm Penaeus orientalis của Oh và cộng sự (2000) về độ bền nhiệt có khá nhiều điểm tương đồng với tôm sú Penaeus monodon đang thực hiện (mặc dù tôm sú tỏ ra bền nhiệt hơn một chút). Với cùng thời gian ủ 30 phút ở nhiệt độ quan tâm sau đó xác định hoạt tính còn lại bằng cơ chất casein, protease nội tạng tôm Penaeus orientalis cũng hầu như không giảm hoạt tính trong khoảng 40 - 500C, hoạt động rất tốt ở 550C (còn hơn 80% hoạt tính) và chỉ giảm mạnh khi tăng nhiệt độ lên hơn 60oC và gần như mất hoạt tính ở 700C. Nghiên cứu của Đỗ Văn Ninh (2004) trên protease nội tạng cá thu, cá ngừ và gan mực ống sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel cho kết quả hoạt độ còn lại sau khi ủ 30 phút ở nhiệt độ 600C khoảng 50%, cao hơn không nhiều so với protease trong đầu tôm bộp và tôm rảo (Nguyễn Văn Lệ, 1996). So với hai nghiên cứu trên, protease tôm sú tỏ ra bền nhiệt hơn khi ở 620C vẫn còn gần 70% hoạt tính. Tuy nhiên, Hình 2. Điện di đồ Zymogram protease tôm sú (Độ pha loãng protease sau tinh sạch đưa vào giếng 1:5 lần, giếng 2: 25 lần, giếng 3: 50 lần, giếng 4: 100 lần, giếng 5: 500 lần) 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease tinh sạch được biểu diễn trên đồ thị trong hình 3. Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease Protease tôm sú thể hiện hoạt tính tốt ở vùng nhiệt độ cao 47 - 670C, đạt giá trị tối đa ở 620C. Chúng hầu như không hoạt động tại khoảng gần 00C và trên đó, tăng rất ít ở nhiệt độ dần đạt tới 120C (chỉ thể hiện 2,71% hoạt tính so với cực đại), ngay cả khi tăng lên thành 270C thì chúng cũng chỉ đạt được chưa tới 17% hoạt tính. Hoạt độ protease sau đó tăng đều và mạnh hơn, đạ t giá trị cự c đạ i tạ i 620C, Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 35 có vẻ như môi trường sống đã ảnh hưởng lớn đến đặc điểm sinh lý và sinh hoá của các quần thể sống trong đó, các loài thủy sản nuôi trồng và đánh bắt ở vùng biển nước ta có cùng chung đặc điểm nhiệt độ môi trường sống là vùng nước ấm nên ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của hệ enzyme cũng khá tương đồng: nhiệt độ tối thích và khoảng nhiệt độ thích hợp cho các enzyme này hoạt động thường khá giống nhau, dao động trong khoảng 55 - 650C, độ bền nhiệt của chúng dù có khác biệt nhưng chung một đặc điểm là bền hơn hẳn so với các protease của sinh vật sinh trưởng nơi nước lạnh. Nếu so với nghiên cứ u củ a Oh và cộ ng sự (2000) về tí nh chấ t củ a protease từ nộ i tạ ng tôm Penaeus orientalis hoạ t độ ng tố t trong môi trườ ng pH 6-9 thì protease nội tạng tôm sú Penaeus monodon có điểm tương đồng là chúng cũng hoạt động tốt ở vùng trung tính đến kiềm nhẹ pH 6 - 9 (hoạt tính đạt được từ khoảng 50% trở lên). Tuy nhiên, protease tôm sú nhạy cảm với pH hơn nhiều, ở pH 7,5 chúng hoạt động tốt nhất nhưng hoạt tính này giảm nhanh khi giá trị pH thay đổi từ trị số tối ưu về cả hai phía kiềm và acid. Kết quả của nghiên cứu này có sự khác biệt so với công trình của tác giả Phạm Thị Trân Châu cùng cộng sự: pH tối ưu CPE protease từ đầu tôm biển là pH 8,5. Nghiên cứu của Nguyễn Việt Dũng (1999) về protease cơ thịt tôm sú cho thấy enzyme này hoạt động tốt nhất ở pH 6,6 hơi thấp hơn so với pH tối ưu của protease từ nội tạng tôm. Có một điểm cầ n nhấ n mạ nh là , protease nộ i tạ ng tôm tỏ ra rất nhạ y cả m vớ i pH trong môi trường trung tính đến kiềm pH 6-9, việ c tăng hoặc giảm nhẹ pH từ giá trị tối ưu có tác dụng là m hoạ t tí nh protease giả m đá ng kể . Đây sẽ là lưu ý cần ghi nhớ khi ứng dụng enzyme này vào quá trình thủy phân protein để tạo điều kiện thuận lợi nhất cho protease hoạt động và đạt kết quả mong muốn. 6. Ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt độ protease sau tinh sạch Kết quả xác định hoạt tính protease nội tạng tôm ở các nồng độ muối ăn khác nhau được trình bày trong đồ thị ở hình 6. Kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ muối ăn ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính protease của tôm. Nồng độ muối 0 - 1% cho kết quả hoạt tính protease tôm đạt cực đại. Hoạt tính này giảm khá đều khi nồng độ muối tiếp tục tăng lên. Hình 5. Ảnh hưởng của pH đến độ hoạt động của protease thu nhận từ nội tạng và đầu tôm sú Hình 4. Độ bền nhiệt của protease ở các nhiệt độ khác nhau Như vậy, protease tôm sú có độ bền nhiệt tốt so với các loại thủy sản khác đã được nghiên cứu. Đây thật sự là lợi thế đáng kể khi áp dụng vào thủy phân protein và chế biến thực phẩm nói chung để điều khiển phản ứng thuận lợi, bởi vì hầu hết các vi sinh vật gây thối không phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ cao mà ở đó protease tôm sú vẫn hoạt động tốt 37 - 570C, thậm chí 620C. 5. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease Đồ thị trong hình 5 thể hiện mối quan hệ giữa độ pH và khả năng hoạt động của protease nội tạng tôm sú. Kế t quả nghiên cứ u cho thấ y protease từ nộ i tạ ng và đầ u tôm đề u thể hiệ n hoạ t tí nh rất yế u ở vù ng axit pH từ 1 đến 5, tăng nhanh ở pH 6 trở lên, đạ t cự c đạ i tại pH 7,5 rồi giả m nhanh khi pH tăng trong vù ng kiề m, điề u nà y phù hợ p vớ i đặ c điể m hệ enzyme củ a tôm là không có pepsin hoạ t độ ng trong môi trườ ng axit (Haard, 1994). Hình 6. Ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến độ hoạt động của protease từ nội tạng và đầu tôm So sánh với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt tính protease có nguồn gốc thực vật như bromelin, papain thì protease của tôm chịu muối tốt hơn nhiều. Các enzyme này thậm chí còn giữ được hoạt tính tốt hơn so với protease từ Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2015 36 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG nội tạng cá thu, cá ngừ và gan mực ống. Kết quả nghiên cứu của Đỗ Văn Ninh (2004) trên protease nội tạng cá và gan mực cho thấy, các protease này có thể duy trì hoạt động ở mức 50 - 60% so với cực đại tại nồng độ muối 6 - 7%, tuy nhiên các protease tôm sú còn tỏ ra ưu việt hơn vì giữ được cùng mức 50 - 60% khi nồng độ muối trong môi trường là 13%. Hoạt độ tốt của protease nội tạng tôm giúp giải thích hiện tượng “chín” của mắm tôm ở nồng độ muối cao nhanh hơn so với mắm cá sản xuất theo phương pháp cổ truyền. 7. Ảnh hưởng của một số kim loại đến hoạt độ protease tôm sú Một số nghiên cứu của tác giả trong và ngoài nước cho thấy, muối kim loại có thể ảnh hưởng đến hoạt độ protease. Nghiên cứu đã thử xem xét ảnh hưởng của một số kim loại thường có vai trò quan trọng tới hoạt độ protease nội tạng tôm sú, kết quả thể hiện ở hình 7. Kết quả thực nghiệm cho thấy, các kim loại Cu2+, Mn2+ và Fe2+ có tác dụng hoạt hóa protease tôm sú, trong đó đáng kể nhất là Mn2+, hoạt độ tăng lên 169,6 %, kế tiếp là Cu2+ 180,9%. Fe2+ cũng có tác dụng làm tăng hoạt độ protease nhưng không đáng kể bằng hai trường hợp Cu2+ và Mn2+ (106,9%). enzyme tựa trypsin và tựa chymotrypsin ở tôm sú Đài Loan (Jiang, 1991). Roy và cộng sự (1996) cũng cho biết hiện tượng tương tự quan sát được đối với collagenase thuộc nhóm protease serin trên đối tượng cua Carcinus maenas. Tất cả những điều này cho phép suy luận, liên kết sulfi t đóng vai trò quan trọng tạo nên cấu trúc đặc trưng để protease thể hiện được đầy đủ chức năng của mình. 8. Ảnh hưởng của một số chất ức chế đến hoạt độ protease tôm sú Để tìm hiểu cụ thể hơn về các enzyme có mặt trong hệ protease nội tạng tôm, nghiên cứu đã thử hoạt tính protease khi có mặt các chất ức chế đặc hiệu, kết quả được trình bày trong bảng 2. Bảng 2. Hoạt tính còn lại (%) của protease nội tạng tôm sú khi có mặt một số chất ức chế đặc hiệu Hợp chất thêm vào phản ứng Nồng độ chất thêm vào Hoạt độ còn lại (%) Đối chứng PMSF SBTI TLCK TPCK EDTA 1,10-phenanthroline Iodoacetate - 0,1mM 10mg/ml 0,1mM 0,1mM 1 mM 1 mM 1 mM 100 15 32 39 81 98 98 97 Hoạt tính protease tôm sú bị giảm mạnh (chỉ còn 15%) khi có mặt PMSF, chất ức chế đặc hiệu của nhóm protease serin, là bằng chứng cho biết protease tôm sú là thành viên của nhóm này. Đây là điều được khẳng định lại qua kết quả xác định hoạt độ khi thêm SBTI vào phản ứng, hoạt độ còn lại lần lượt là 32 và 33% đối với nội tạng và đầu tôm. SBTI là chất ức chế các protease serin, nó kìm hãm trypsin, ít nhạy hơn một chút với chymotrypsin. Khi có mặt TLCK (chất ức chế trypsin), hoạt độ protease còn lại chỉ đạt con số 39%, như vậy, các protease chủ yếu trong tôm sú thuộc về loại enzyme tựa trypsin. Ngoài ra, trong tôm sú còn các enzyme tựa chymotrypsin vì TPCK làm giảm nhẹ hoạt tính protease, chỉ còn lại khoảng 80%. EDTA (chất kìm hãm các metalloprotease), 1, 10-phenanthroline (đặc hiệu cao đối với kẽm trong trung tâm hoạt động của metalloprotease) và iodoacetic acid hầu như không ảnh hưởng đến hoạt tính protease, cho thấy rằng, trong nội tạng tôm sú có lẽ không có metalloprotease (như collagenase chẳng hạn) hoặc tồn tại nhưng với hoạt tính rất thấp. Điều khẳng định ở trên xác nhận lại một số điểm đã được các nhà khoa học ghi nhận. Các nghiên cứu Hình 7. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ protease tôm sú Các ion kim loại Mo2+, Pb2+, Mg2+, Ba2+, Co2+ hầu như không gây ảnh hưởng đáng kể đến hoạt độ protease. Điều này cho phép suy luận chúng không hề liên kết với các protease trong tôm. Hg2+ thì lại có tác dụng ức chế protease khá rõ, hoạt độ còn lại là 53,66%. Tác dụng ức chế của Zn2+ cũng đáng ghi nhận, tuy nhiên hoạt độ còn lại lớn hơn trường hợp của Hg2+. Klee (1998) thông báo rằng, hai kim loại Hg2+ và Zn2+ có thể tạo ra liên kết với nhóm -SH của enzyme và do đó làm giảm hoạt tính protease. Như vậy, rất có thể, tác dụng ức chế của Hg2+ và Zn2+ đối với protease đầu tôm là do chúng liên kết với một trung tâm hoạt động không đặc hiệu của enzyme này. Báo cáo về tác dụng ức chế của hai kim loại Hg2+ và Zn2+ cũng được ghi nhận trên một Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 37 thực hiện rải rác ở khắp thế giới trên 50 loài giáp xác cung cấp thông tin thú vị là hệ tiêu hóa của các động vật này có hoạt tính proteolytic vô cùng cao (Tsai, 1991), có lẽ do tập quán tiêu thụ thức ăn rất giàu protein (thức ăn nuôi tôm công nghiệp thường chứa 40-50% chất đạm), trong đó, loại protease chính là trypsin và chymotrypsin, với hoạt tính của trypsin chiếm hơn nửa tổng hoạt tính protease (Ezquerra, 1997). IV. KẾT LUẬN Protease từ nội tạng tôm sú có ít nhất năm loại protease khác nhau, trong đó, ba protease chiếm vai trò hoạt động chủ đạo có phân tử lượng 20.200 đến 25.000 Da. Protease nội tạng tôm sú bền nhiệt, hoạt động tốt nhất ở 620C. Đây là một lợi thế lớn cho việc ứng dụng protease này vào chế biến thực phẩm vì ức chế được nhiều vi sinh vật gây thối, giúp tăng nhanh vận tốc phản ứng thủy phân và gìn giữ chất lượng thực phẩm. Hoạt tính protease thể hiện tốt nhất ở pH 7,5, nồ ng độ muố i ăn NaCl 1%. Hoạt độ protease giảm khi có mặt của một số ion kim loại, đặc biệt là Hg2+. Ion Mn2+ làm tăng hoạt tính của protease tôm sú. Kết quả hoạt tính còn lại khi phản ứng với chất ức chế đặc hiệu cho phép khẳng định, protease nội tạng tôm thuộc nhóm protease serine, trong đó các enzyme tựa trypsin đóng vai trò chủ đạo hoạt động. Trong nội tạng tôm sú cũng có mặt các enzyme tựa chymotrypsin và hầu như không có metalloprotease. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Việt Dũng (1999), Nghiên cứu sự biến đổi của tôm sau khi chết và phương pháp bảo quản nguyên liệu, Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật, Trường Đại học Thủy sản Nha Trang. 2. Nguyễn Văn Lệ (1996), Nghiên cứu và sử dụng proteinaza đầu tôm trong chế biến thuỷ sản, Luận án Phó tiến sĩ khoa học sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. 3. Đỗ Văn Ninh, (2004), Tối ưu hóa quá trình phân giải protein của proteza trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phân, Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật, Trường Đại học Thủy sản Nha Trang. Tiếng Anh 4. Amano, (2002), Protease N “Amano” - Assay method for Protease activity (Amano method). 5. Bradford, M.M., (1976), A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical Biochemistry 72: 248-254. 6. Cano-Lopez,A., Simpson, B.K., & Haard,N.F., (1987), Extraction of carotenoprotein from shrimp process wastes with the aid of trypsin from Atlantic cod, J. Food Science, 52, 503-504, 506. 7. Ezquerra, J.M., Garcia-Carreno, F.L. & Haard, N.F., 1997, Effect of feed diets in digestive protease from the hepatopancreas of white shrimp (Penaeus vannamei), J. Food Biochem, 21, 401-419. 8. Garcia-Carreno, F.L., & Haard, N.F.,(1992), Characterization of proteinase classes in Langostilla (Pleuroncodes planipes) and crayfi sh (Pacifastacus astacus) extracts, J. of Food Biochemistry, 17,97-113. 9. Haard, N.F., (1986), Atlantic cod protease, Characterization with casein and milk substrate and infl uence of separose immobilization on salt activation, temperature characteristics and milk clotting reaction, Journal of Food Science, 51, 316-326. 10. Jiang, S.T., Moody, M.W. & Chen, H.C., (1991), Purifi cation and characterization of proteases from digestive tract of grass shrimp (Penaeus monodon), J. Food. Sci. 56, 322-326. 11. Oh, E.S., Kim, D.S., Kim, J.H. & Kim, H.R., (2000), Enzymatic properties of a protease from the hepatopancrease of shrimp, Penaeus orientalis, J. Food Biochem, 24, 251-264 12. Shamsuzzaman, K., & Haard N. F. (1984), Purifi cation and characterization of a chymotripsin-like protease from gastric mucosa of harp seal (Paophilus groelandicus), Canadian Journal of Biochemistry and Cell Biology, 62, 699-708. 13. Stefansson, G., & Steingrimsdottir, U. (1990), Application of enzymes for fi sh processing in Iceland - present and future aspects, In M. N. Voigt & J. R. Botta (Eds.), Advances in fi sheries technology for increased profi tability (pp. 237-250). Lancaster, PA: Technomic Publication. 14. Strom, T., & Raa, J. (1982), A newprocessing method for small pelagic fi shes. Infofi sh Marketing Digest, 3, 24–27. 15. Tsai I.H., Lu P.J and Chuang J.L. (1991), The midgut chymotrypsins of shrimps (Penaeus monodon, Penaeus japonicas and Penaeus penicillatus), Biochimica et Biophysica Acta 1080: 59-67.