Hoạt tính kháng khuẩn của một chủng vi
khuẩn có thể do sinh ra kháng sinh, axit hữu
cơ, bacteriocin và H2O2 hoặc kết hợp các
hoạt tính trên (Gillor et al., 2008). Đối với các
chủng T8 và T13 sử dụng trong nghiên cứu
này, trước đây chúng đã được chứng minh
có hoạt tính kháng phổ rộng đối với các vi
khuẩn Gram âm (bao gồm một số chủng Vibrio
spp.) và Gram dương bằng cách sinh axit và
bacteriocin (Nguyen et al., 2014b). Kết quả
tương tự cũng được Aroutcheva và cộng sự
(2001) tìm thấy ở các chủng Lactobacillus spp.
228, 345, 431 với khả năng sinh axit lactic và
bacteriocin. Mặc dù chúng cũng sinh H2O2
nhưng không có bất kì tác dụng ức chế nào lên
vi khuẩn đích thử nghiệm.
An toàn là tiêu chuẩn rất quan trọng
trong bốn tiêu chuẩn tuyển chọn vi sinh vật
probiotic (Nguyễn Văn Duy et al., 2015).
Điều thú vị là cả 2 chủng T8 và T13 đã được
định danh trước đây thuộc loài Lactobacillus
plantarum (Nguyen et al., 2014b). Đây là loài
vi khuẩn probiotic an toàn dựa theo các chứng
nhận GRAS của FDA (Mỹ) và QPS của EFSA
(châu Âu) (Nguyễn Văn Duy et al., 2015). Điều
này mở ra triển vọng sử dụng 2 chủng vi khuẩn
này trong thực tế nuôi tôm.
8 trang |
Chia sẻ: linhmy2pp | Ngày: 24/03/2022 | Lượt xem: 208 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn chịu muối mật, chịu axit và đối kháng với vibrio parahaemolyticus gây bệnh chết sớm ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
34 • NHA TRANG UNIVERSITY
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016
TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CHỊU MUỐI MẬT,
CHỊU AXIT VÀ ĐỐI KHÁNG VỚI VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
GÂY BỆNH CHẾT SỚM Ở TÔM THẺ CHÂN TRẮ NG (LITOPENAEUS VANNAMEI)
SELECTION OF SOME BACTERIAL STRAINS WITH BILE SALT AND ACID TOLERANCE
AS WELL AS ANTIMICROBIAL ACTIVITY AGAINST EMS - CAUSING
Vibrio parahaemolyticus IN WHITELEG SHRIMP (Litopenaeus vannamei)
Nguyễn Thị Chính1, Phạm Thu Thủy1, Nguyễn Văn Duy1*
Ngày nhận bài: 25/11/2015; Ngày phản biện thông qua: 29/6/2016; Ngày duyệt đăng: 15/12/2016
TÓM TẮT
Bệnh chết sớm (EMS) hay còn gọi là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) xảy ra trên tôm nuôi nước
lợ đã gây ra những thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm ở Việt Nam và một số nước châu Á khác như
Trung Quốc, Thái Lan và Malaysia. Tác nhân chính gây bệnh được cho là do Vibrio parahaemolyticus. Hiện
nay chưa có biện pháp trị bệnh EMS hiệu quả, vì vậy, việc tuyển chọn các chủng probiotic trong phòng trị bệnh
EMS là hướng đi có nhiều triển vọng nhằm phát triển bền vững nghề nuôi tôm. Mục tiêu của nghiên cứu này
là tiếp tục tuyển chọn khả năng chịu muối mật, chịu axit và hoạt tính đối kháng với tác nhân gây bệnh EMS
của 27 chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn trước đó có phổ kháng khuẩn rộng với các vi khuẩn Gram âm và
Gram dương. Kết quả cho thấy trong số này có 17 chủng chịu được muối mật 0,1%; 2 chủng (Lactobacillus
plantarum T8 và T13) chịu được pH 2 trong 1 h và pH 3 - 4 trong 2 h; và 2 chủng này cũng có hoạt tính đối
kháng với Vibrio parahaemolyticus XN9 gây bệnh EMS phân lập tại Ninh Thuận. Các kết quả này mở ra triển
vọng sử dụng các chủng T8 và T13 trong điều chế chế phẩm probiotic nhằm quản lý bệnh EMS trên tôm thẻ
chân trắng ở Việt Nam.
Từ khóa: EMS; Litopenaeus vannamei, probiotic, Vibrio parahaemolyticus
ABSTRACT
Early Mortality Syndrome (EMS), also named Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND), which
recently occurs in penaeid shrimp, is now causing signifi cant losses to the shrimp farming industry in Vietnam,
China, Thailand and Malaysia. Vibrio parahaemolyticus is considered as a major pathogen. No effective treatment
has currently been reported; hence screening of probiotics against EMS is a promising approach for the sustainable
development of shrimp culture. The aim of the study is to further screen probiotic activities including bile salt
tolerance, acid tolerance and antimicrobial activity against EMS/AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus of 27
bacterial strains which have expressed antimicrobial activity against a wide range of Gram-positiv and -negative
bacteria in previous studies. The results showed that there were 17 strains resistant to the bile salt at the
concentration of 0,1%; 2 strains (Lactobacillus plantarum T8 and T13) resistant to pH 2 for 2 h and pH 3
- 4 for 2 h; and these two strains also indicated antibacterial activity against EMS/AHPND-causing Vibrio
parahaemolyticus XN9 isolated in Ninh Thuan province. These results open the prospect of using the T8 and T13
strains for the development of probiotic products in order to manage EMS in Litopenaeus vannamei in Vietnam.
Keywords: EMS, Litopenaeus vannamei, probiotics, Vibrio parahaemolyticus
1 Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang
* Email: duynv@ntu.edu.vn
THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016
NHA TRANG UNIVERSITY • 35
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tôm thẻ chân trắng được đưa vào Việt
Nam năm 2001. Từ năm 2008, diện tích và sản
lượng tôm thẻ chân trắng không ngừng được
tăng lên. Cùng với tăng nhanh về diện tích và
sản lượng thì môi trường ngày càng bị ô nhiễm
dẫn đến tình hình dịch bệnh xảy ra nhiều hơn.
Đặc biệt vấn đề dịch bệnh do vi sinh vật gây
ra ảnh hưởng rất lớn đến tính ổn định và năng
suất nuôi tôm. Một trong những bệnh gây ảnh
hưởng nghiêm trọng tới nghề nuôi tôm hiện
nay là bệnh chết sớm. Bệnh chết sớm (Early
Mortality Syndrome, EMS) hay còn gọi là bệnh
hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) xảy ra trên
tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân
trắng (Litopenaeus vannamei), đã được báo
cáo lần đầu tiên tại Trung Quốc vào năm 2009
và sau đó lan rộng ra các nước Việt Nam, Thái
Lan và Malaysia (FAO, 2013).
Tác nhân chính của bệnh EMS được cho
là Vibrio parahaemolyticus gây ra (Tran et al.,
2013). Vi khuẩn này phát triển trong đường
tiêu hóa của tôm, tạo ra độc tố làm mất chức
năng và phá hủy mô của các cơ quan tiêu hóa
của tôm như gan tụy. Bệnh lây truyền qua
đường miệng nhưng không ảnh hưởng đến
con người. Hơn nữa, hiện nay các nghiên
cứu tập trung mô tả nguyên nhân của bệnh
EMS. Các chiến lược để điều trị bệnh này rất
cần thiết và cấp bách nhưng còn ít thấy được
công bố.
Hiện nay các phương pháp chẩn đoán
tác nhân gây bệnh EMS đang được tập trung
nghiên cứu trong khi đó chưa có biện pháp trị
bệnh EMS hiệu quả được đưa ra (Sirikharin et
al., 2015). Chiến lược chủ yếu tập trung vào
việc kiểm soát sự có mặt hoặc hoạt động của
vi khuẩn Vibrio nhằm giảm nguy cơ bùng phát
của EMS. FAO (2013) khuyến cáo tẩy uế toàn
bộ nền đáy ao nuôi và nguồn nước để tiêu diệt
mầm bệnh EMS. Các chiến lược quản lí hệ vi
sinh vật có thể là chìa khóa để giảm thiểu nguy
cơ của sự bùng phát EMS. Chẳng hạn, FAO
khuyến nghị nuôi tôm postlarvae trong các hệ
thống với hệ vi sinh vật điều chỉnh (như các
hệ thống nước sạch giàu vi tảo và các hệ
thống nước được điều chỉnh vi sinh vật), đó
là những môi trường sơ cấp làm giảm sự phát
sinh của EMS. Sử dụng công nghệ greenwater
(“nước xanh”) cũng liên quan đến việc giảm
EMS trong thực tế. Các hệ thống greenwater
(khác với các hệ thống nước sạch) được đặc
trưng bở i một lượng vi tảo trưở ng thành và
quần xã vi khuẩn và có tác dụng làm giảm
Vibrio và giảm tỷ lệ chết ở động vật (Lio et al.,
2005; Tendencia et al., 2010).
Ngoài các giải pháp trên, gần đây người
ta quan tâm đến việc áp dụng các chế phẩm
probiotic. Nhữ ng cơ chế liên quan bao gồm:
sản xuất các hợp chất ức chế, cạnh tranh
chất dinh dưỡng, cạnh tranh vị trí bám dính
trong ruột, tăng cường đáp ứng miễn dịch và
sản xuất các chất dinh dưỡng thiết yếu như
vitamin và acid béo (Verschuere et al., 2000).
Do đó, việc nghiên cứu tuyển chọn một số
chủng probiotic tiềm năng có hoạt tính đối
kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh
EMS ở tôm thẻ chân trắng là rất cấp thiết, có ý
nghĩa khoa học và thực tiễn.
Các vi sinh vật được lựa chọn làm probiotic
phải đáp ứng bốn tiêu chuẩn: (i) tiêu chuẩn sức
sống và chiếm lĩnh ruột, (ii) tiêu chuẩn tác động
có lợi đến sức khỏe vật chủ, (iii) tiêu chuẩn sản
xuất và (iv) tiêu chuẩn an toàn (Nguyễn Văn
Duy et al., 2015). Để sống và chiếm lĩnh ruột,
các vi khuẩn probiotic phải vượt qua được
những phần khác nhau của hệ tiêu hóa, trong
đó quan trọng nhất là môi trường acid của dạ
dày và sự có mặt của acid mật trong dịch tụy.
Vì vậy, khi tuyển chọn các chủng probiotic tiềm
năng, người ta thường tiến hành thử nghiệm
khả năng chịu muối mật và chịu pH thấp của
các chủng vi sinh vật quan tâm (Buntin et al.,
2008; Talpur et al., 2012).
Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã
tuyển chọn 27 chủng probiotic tiềm năng từ
các nghiên cứu trước đây đã thể hiện hoạt tính
kháng khuẩn rộng với nhiều chủng vi khuẩn
đích (Nguyen và et al., 2014ab; Pham et al.,
2014). Các chủng được tuyển chọn thông qua
36 • NHA TRANG UNIVERSITY
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016
các hoạt tính kháng muối mật, kháng pH thấp
và kháng khuẩn nhằm tìm kiếm các ứng cử
viên phù hợp để sử dụng trong quản lý dịch
bệnh EMS trên tôm thẻ. Điều này giúp cung
cấp dữ liệu khoa học về các hoạt tính sinh
học của vi khuẩn probiotic dùng cho động vật
thủy sản, mở ra tiềm năng sử dụng công nghệ
probiotic trong quản lý bệnh EMS ở tôm, góp
phần dần thay thế sử dụng kháng sinh và các
hóa chất bị cấm hoặc hạn chế sử dụng trong
nuôi trồng thủy sản.
II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Chủng vi khuẩn nghiên cứu
Tổng số 27 chủng vi khuẩn (Bảng 1) có
hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng lấy từ bộ sưu
tập chủng của Viện Công nghệ sinh học và Môi
trường, Trường Đại học Nha Trang (Nguyen
et al., 2014ab; Pham et al., 2014). Các chủng
T8 và T13 được nuôi trong môi trường MRS
(de Man – Rogosa – Sharpe, Difco, Mỹ) trong
khi các chủng còn lại được nuôi cấy trên môi
trường MB (Marine Broth, Difco, Mỹ).
Bảng 1. Danh sách các chủng vi khuẩn nghiên cứu với khả năng chịu muối mật
STT Chủng Nguồn phân lập Loài Tài liệu
Nồng độ muối mật
0,1% 0,2% 0,3%
1 T8 Nước dưa muối Lactobacillus plantarum Nguyen et
al., 2014b
+ - -
2 T13 Nước dưa muối Lactobacillus plantarum + - -
3 B3.10.2B Ruột tôm sú Bacillus pumilus
Nguyen et
al., 2014a
- - -
4 D9 Ruột cá chim vây vàng Bacillus cereus + + +
5 B1.1 Ruột tôm sú Enterococcus faecalis - - -
6 B3.10B Ruột tôm sú Proteus mirabilis + + +
7 D15 Ruột cá chim vây vàng Proteus sp. + + -
8 D10 Ruột cá chim vây vàng Proteus sp. - - -
9 T14 ruột tôm hùm bông Proteus sp. + + +
10 CT1.1 Ruột cá giò Proteus sp. + + +
11 G1 Ruột tôm hùm bông Proteus sp. + + +
12 B3.7A Ruột tôm sú Proteus sp. + + +
13 B3.10.2 Ruột tôm sú Proteus sp. - - -
14 N1.4 Ruột tôm hùm bông Proteus sp. + + +
15 T9 Ruột tôm hùm bông Proteus sp. + + +
16 B3.10A Ruột tôm sú Proteus sp. + + +
17 B3.7.1 Ruột tôm sú Proteus sp. - - -
18 B3.7.4 Ruột tôm sú Providencia stuartii - - -
19 M2 Ruột tôm hùm bông Klebsiella sp. - - -
20 L5 Ruột tôm hùm bông Klebsiella sp. - - -
21 V1.1 Ruột tôm sú Klebsiella pneumoniae - - -
22 D16 Ruột cá chim vây vàng Alcaligenes faecalis + + +
23 D18 Ruột cá chim vây vàng Alcaligenes faecalis + + +
24 H77 Cơ thịt tu hài Enterobacter cloacae
Pham et
al., 2014
- - -
25 H9 Cơ thịt tu hài Cronobacter sakazakii + + +
26 H51 Cơ thịt tu hài Cronobacter sakazakii + + +
27 H61 Cơ thịt tu hài Cronobacter sakazakii + + +
(+: có khuẩn lạc, -: không có khuẩn lạc)
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016
NHA TRANG UNIVERSITY • 37
2. Chủng vi khuẩn chỉ thị
Tổng số 12 chủng vi khuẩn chỉ thị gây
bệnh EMS được phân lập từ mẫu tôm bị bệnh
EMS nuôi ở Ninh Thuận năm 2015, do Nhóm
nghiên cứu Bệnh học thủy sản, Viện Nuôi
trồng thủy sản, Trường Đại học Nha Trang
cung cấp. Các chủng được ký hiệu như sau:
NH0906C3, HH4/1, PT250964P, HH07044/6,
XN9, H2509E1B, PT2509E1W, C2, XN8,
PT2509E1V, NH0906C4 và TH1006C1. Tất
cả các chủng này được nuôi trên môi trường
TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose,
Difco, Mỹ). Các chủng này đã được Nhóm
nghiên cứu Bệnh học thủy sản thử nghiệm
cảm nhiễm chứng minh là tác nhân gây bệnh
EMS và sơ bộ định danh thuộc chi Vibrio (kết
quả chưa công bố). Trong số này, chủng XN9
đã được xác định có độc lực mạnh nhất và đã
sơ bộ định danh là V. parahaemolyticus nhờ
sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc
hiệu AP3, AP4 (kết quả chưa công bố). Kết quả
định danh chủng XN9 bằng kit API 20E của
chúng tôi cho thấy có 18/20 thử nghiệm sinh
hóa giống với V. parahaemolyticus, ngoại trừ
các thử nghiệm TDA và IND (Bảng 2). Kết quả
này một lần nữa xác nhận kết quả do Nhóm
nghiên cứu Bệnh học thủy sản cung cấp.
Bảng 2. Kết quả định danh chủng XN9 theo kit API 20E
Tên thử nghiệm XN9 V.parahaemolyticus (theo API)
Tên thử
nghiệm XN9
V. parahaemolyticus
(theo API)
ONPG - - GEL + +
ADH - - GLU + +
LDC + + MAN + +
ODC + + INO - -
CIT + + SOR - -
H2S - - RHA - -
URE - - SAC - -
TDA + - MEL - -
IND - + AMY - -
VP - - ARA + +
3. Xác định khả năng sinh trưởng
Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được
xác định bằng phương pháp đo mật độ quang
ở bước sóng 600 nm (OD600).
4. Xác định khả năng chịu muối mật
Các chủng được nuôi cấy trong môi trường
tương ứng và không có muối mật ở 30°C trong
24 h. Cấy trang 1 ml canh trường nuôi cấy (ở
mật độ 108 CFU/ml) của chủng T8 hoặc T13
vào đĩa thạch MRS agar, những chủng còn
lại được nuôi cấy trên môi trường MA (Marine
Agar, Difco, Mỹ). Các đĩa MRS agar/MA có
chứa nồng độ muối mật 0,1%, 0,2% và 0,3%
(Buntin et al., 2008; Talpur et al., 2012). Khả
năng chịu muối mật được xác định bằng khả
năng mọc khuẩn lạc trong điều kiện trên ở
30°C trong 48 h. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
5. Xác định khả năng chịu axit
Sau khi hoạt hóa qua đêm ở 32°C trong
môi trường MRS/MB mật độ vi khuẩn đạt 108
CFU/ml, chuyển 100 µl dịch vi khuẩn sang các
bình tam giác chứa 10 ml môi trường MRS/MB
có pH = 1, 2, 3, 4 và 6,5 (điều chỉnh bằng HCl
1M). Tất cả các bình tam giác trên được nuôi
lắc 180 rpm ở 32°C trong 1 – 2 h. Khả năng
chịu axit được xác định bằng mật độ vi khuẩn
sống theo phương pháp đếm khuẩn lạc. Mỗi
thí nghiệm lặp lại 3 lần.
6. Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên
môi trường thích hợp nhằm thu dịch nổi. Dịch
nổi sẽ được lọc vô trùng bằng màng lọc 0,45
µm nhằm loại bỏ tế bào vi khuẩn (Nguyen
et al., 2014b). Các đĩ a thạch MA 1,5% agar
38 • NHA TRANG UNIVERSITY
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016
sẽ được đổ thêm một lớp ở trên bằng thạch
mềm MB 0,75% agar có chứa 105 CFU/ml vi
khuẩn chỉ thị. Các lỗ thạch được tạo ra bằng
đầu tip vô trùng và nhỏ vào 100 µl dịch nổi
được xử lí ở trên. Hoạt tính kháng khuẩn được
xác định bằng cách đo đường kính vòng kháng
khuẩn sau khi ủ ở 30°C sau 24 h theo phương
pháp khuếch tán trên thạch đĩ a. Mỗi thí nghiệm
lặp lại 3 lần.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Khả năng chịu muối mật của các chủng
vi khuẩn nghiên cứu
Sống và chiếm lĩ nh trong hệ đường ruột
của động vật chủ là tiêu chuẩn đầu tiên trong
tuyển chọn các chủng probiotic (Nguyễn Văn
Duy et al., 2015). Havenaar et al. (1992) đã chỉ
ra rằng probiotic chỉ phát huy tác dụng có lợi
lên vật chủ khi chúng định cư và tồn tại trong
ruột non (Zhou et al., 2007). Điều quan trọng
nhất ở đây là các vi sinh vật probiotic phải trải
qua điều kiện pH thấp từ 1,5 – 3 của dạ dày,
cũng như sự có mặt của axit mật ở nồng độ
0,1 - 0,3% trong ruột (Gilliland et al., 1984;
Talpur et al., 2012; Ilavenil et al., 2015). Vì vậy,
nồng độ muối mật 0,1 - 0,3% và pH 1 - 4 được
chúng tôi lựa chọn để kiểm tra khả năng chịu
muối mật và pH thấp của các chủng vi khuẩn
nghiên cứu.
Kết quả từ Bảng 1 cho thấy, trong tổng số
27 chủng vi khuẩn ban đầu đã xác định được
14 chủng chịu muối mật đến nồng độ 0,3%;
15 chủng chịu được nồng độ muối mật ít nhất
đến 0,2%; 17 chủng chịu được muối mật ít
nhất đến 0,1%. Cho đến nay, nhiều chủng vi
khuẩn phân lập từ các nguồn khác nhau đã
được chứng minh có hoạt tính chịu muối mật
này (Begley et al., 2006; Ilavenil et al., 2015).
Ngoài ra, có 10 chủng vi khuẩn khác trong
nghiên cứu này không chịu được muối mật
0,1%. Mặc dù đây chỉ là kết quả định tính nhưng
có ý nghĩa để tuyển chọn được 17 chủng chịu
muối mật 0,1% cho các thử nghiệm tiếp theo.
2. Khả năng chịu axit của các chủng vi
khuẩn nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành phân tích định lượng
mật độ tế bào vi khuẩn sống trong môi trường
có pH 1 – 4 của 17 chủng vi sinh vật chịu muối
mật ít nhất 0,1%. Kết quả từ Bảng 3 cho thấy
không có chủng nào sống được trong môi
trường có pH 1. Chỉ có 2 chủng (T8 và T13)
chịu được khi nuôi ở pH 2 – 4 sau 1 h với mật
độ tế bào đạt từ 1,17 – 1,61 × 107 CFU/ml. Tiếp
tục thí nghiệm khả năng chịu axit của 2 chủng
này với thời gian nuôi 2 h, cho thấy cả 2 chủng
T13 và T8 đều có khả năng sống trong điều
kiện pH 3 và 4 nhưng không chịu được trong
điều kiện pH 2. Trong khi đó, ở mẫu đối chứng
được thử nghiệm trong môi trường MRS ở pH
6,5 đã thể hiện khả năng sinh trưởng tốt, sau
2 h nuôi mật độ tăng lên đạt 5,19 – 5,63 × 107
CFU/ml.
Bảng 3. Khả năng chịu axit của Lactobacillus plantarum T8 và T13
Chủng vi khuẩn Thời gian
Mật độ tế bào sống (× 107 CFU/ml)
Đối chứng (pH 6,5) pH 1 pH 2 pH 3 pH 4
Lactobacillus
plantarum T13
1 h 1,32 ± 0,17 0 1,26 ± 0,30 1,65 ± 0,04 2,50 ± 0,28
2 h 5,63 ± 1,65 0 0 1,95 ± 0,29 3,05 ± 0,01
Lactobacillus
plantarum T8
1 h 1,41 ±0,21 0 1,17 ± 0,23 1,70 ± 0,08 2,61 ± 0,17
2 h 5,19 ± 0,13 0 0 1,98 ± 0,25 3,2 ± 0,31
Kết quả nghiên cứu này phù hợp với
những kết quả nghiên cứu trước đây. Chẳng
hạn, Tapur và cộng sự (2011) khi khảo sát
khả năng chịu axit của 5 chủng vi khuẩn lactic
gồm L. plantarum, L. salivarius, L. rhamnosus,
Weisella confusa, Weisella cibaria phân lập từ
ruột của loài ghẹ xanh cũng cho thấy tất cả
đều không sống được ở pH 1 sau thời gian
1 h, trong khi đó ở pH 2; 2,5 và 3 chúng đều sinh
trưởng. Mật độ vi khuẩn tăng dần theo giá trị pH
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016
NHA TRANG UNIVERSITY • 39
nói trên. Ngoài ra, nghiên cứu của Pundir và
cộng sự (2013) khi tiến hành khảo sát khả
năng chịu axit của 8 chủng vi khuẩn lactic phân
lập từ rau quả và đồ ăn sẵn cũng không thể
sinh trưởng ở pH 3,0; 2,0; và 1,0 nhưng có thể
phát triển ở pH 3,7; 4,0; 5,0; 6,0 và 7,0. Ahmed
và cộng sự (2013) khi tiến hành thử nghiệm
khả năng chịu axit của 4 chủng Lactobacillus
phân lập từ sữa chua bằng cách nuôi cấy các
chủng này trong môi trường MRS có pH 7, 4
và 2 trong 2 h cũng thấy rằng có 3/4 chủng
phát triển ở pH 4 với mật độ vi khuẩn tăng so
với ban đầu, tuy nhiên ở pH 2 mật độ tế bào vi
khuẩn giảm.
Zhou và cs (2007) cho rằng giá trị pH 2 và
pH 3 được xem là giới hạn quyết định trong
sàng lọc các chủng vi sinh vật có tiềm năng sử
dụng làm probiotic. Các chủng vi khuẩn sống
trong điều kiện in vitro có muối mật và pH thấp
là một dấu hiệu thể hiện khả năng vượt qua
dạ dày để lưu trú và chiếm lĩnh trong đường
ruột. Như vậy, có thể thấy rằng các chủng T8
và T13 trong nghiên cứu này có khả năng sống
vượt qua môi trường axit của dạ dày và sống
trong ruột, nên tiếp tục được sử dụng cho các
nghiên cứu tiếp theo.
3. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi
khuẩn nghiên cứu
Kết quả thí nghiệm tiến hành với 2 chủng
vi khuẩn T8 và T13 chịu được muối mật đến
0,1% và chịu được pH 2 – 4 sau 1 h cho thấy
cả 2 chủng này đều có hoạt tính đối kháng
với 12 chủng vi khuẩn chỉ thị gây bệnh EMS
phân lập tại Ninh Thuận (Hình 1 - 3). Đặc biệt
kết quả từ Hình 1 cho thấy cả 2 chủng T8 và
T13 đều thể hiện hoạt tính kháng với chủng
vi khuẩn gây bệnh XN9, là chủng có độc lực
mạnh nhất trong số 12 chủng vi khuẩn chỉ thị.
Trong đó, chủng T13 thể hiện hoạt tính kháng
mạnh hơn so với chủng T8 (Hình 2).
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của
Tapur và cộng sự (2012) khi tiến hành xác
định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi
khuẩn lactic phân lập từ ruột loài ghẹ xanh
Portunus pelagicus. Trong nghiên cứu đó, tất
cả 5 chủng vi khuẩn lactic đều có khả năng
ức chế sinh trưở ng của các chủng chỉ thị bao
gồm Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus và
Pfi esteria piscicida. Ngoài ra, nghiên cứu của
Sivakuma và cộng sự (2012) khi tiến hành
xác định hoạt tính kháng khuẩn của chủng
L. acidophilus 04 phân lập từ sữa chua cũng
thể hiện hoạt tính kháng với 4 chủng Vibrio
bao gồm V. parahaemolyticus, V. harveyi, V.
cholera, V. alginolyticus với đường kính vòng
kháng từ 8 – 15 mm.
Hoạt tính kháng khuẩn của một chủng vi
khuẩn có thể do sinh ra kháng sinh, axit hữu
cơ, bacteriocin và H2O2 hoặc kết hợp các
hoạt tính trên (Gillor et al., 2008). Đối với các
chủng T8 và T13 sử dụng trong nghiên cứu
này, trước đây chúng đã được chứng minh
có hoạt tính kháng phổ rộng đối với các vi
khuẩn Gram âm (bao gồm một số chủng Vibrio
spp.) và Gram dương bằng cách sinh axit và
bacteriocin (Nguyen et al., 2014b). Kết quả
tương tự cũng được Aroutcheva và cộng sự
(2001) tìm thấy ở các chủng Lactobacillus spp.
228, 345, 431 với khả năng sinh axit lactic và
bacteriocin. Mặc dù chúng cũng sinh H2O2
nhưng không có bất kì tác dụng ức chế nào lên
vi khuẩn đích thử nghiệm.
An toàn là tiêu chuẩn rất quan trọng
trong bốn tiêu chuẩn tuyển chọn vi sinh vật
probiotic (Nguyễn Văn Duy et al., 2015).
Điều thú vị là cả 2 chủng T8 và T13 đã được
định danh trước đây thuộc loài Lactobacillus
plantarum (Nguyen et al., 2014b). Đây là loài
vi khuẩn probiotic an toàn dựa theo các chứng
nhận GRAS của FDA (Mỹ) và QPS của EFSA
(châu Âu) (Nguyễn Văn Duy et al., 2015). Điều
này mở ra triển vọng sử dụng 2 chủng vi khuẩn
này trong thực tế nuôi tôm.
40 • NHA TRANG UNIVERSITY
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016
IV. KẾT LUẬN
Kết quả tuyển chọn in vitro từ 27 chủng vi
khuẩn nghiên cứu cho thấy có 17 chủng chịu
được muối mật 0,1%; 2 chủng (Lactobacillus
plantarum T8 và T13) chịu được pH 2 trong 1 h
và pH 3 - 4 trong 2 h; và 2 chủng này cũng có
hoạt tính đối kháng với các chủng Vibrio gây
bệnh EMS phân lập tại Việt Nam.
Hình 1. Hình ảnh vòng kháng khuẩn của các chủng
T8 và T13 với V. parahaemolyticus XN9
Hình 2. Đường kính vòng kháng khuẩn của
L. plantarum T8 và T13 với V. parahaemolyticus XN9
Hình 3. Hình ảnh vòng kháng khuẩn của các chủng T8 và T13 với một số chủng vi khuẩn chỉ thị khác
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Văn Duy (chủ biên), Lê Đình Đức, Nguyễn Thị Kim Cúc, Phạm Thu Thủy, Lê Phương Chung, 2015.
Công nghệ probiotic. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 229 trang.
Tiếng Anh
2. Ahmed, Z., Wang, Y., Anjum, N., Ahmad, A., Khan, S.T., 2013. Characterization of exopolysaccharide produced
by Lactobacillus kefi ranofaciens ZW3 isolated from Tibet kefi r – Part II. Food Hydrocoll 30, 343–350.
3. Begley, M., Hill, C., Gahan, C.G., 2006. Bile salt hydrolase activity in probiotics. Applied Environmental
Microbiology. 72(3): 1729-38.
4. Buntin, N., Chanthachum, S. and Hongpattarakere, T., 2008. Screening of lactic acid bacteria from gastrointestinal
tracts of marine fi sh for their potential use as probiotics. Songklanakarin Journal of Science and Technology.
30, 141-148.
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016
NHA TRANG UNIVERSITY • 41
5. FAO, 2013. Report of the FAO/MARD Technical Workshop on Early Mortality Syndrome (EMS) or Acute
Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPND) of Cultured Shrimp (under TCP/VIE/3304). Hanoi, Viet Nam,
FAO Fisheries and Aquaculture Report No. 1053. Rome. 54 pp.
6. Gilliland S.E., Staley T.E., Bush L.J., 1984. Importance in bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as a
dietery adjunct. J. Dairy Sci, 67(12), 3045-3051.
7. Gillor, O., Etzion, A., Riley, M.A., 2008. The dual role of bacteriocins as anti- and probiotics. Applied Microbiology
and Biotechnology. 81(4):591-606.
8. Ilavenil, S., Park, H.S., Vijayakumar, M., Arasu, M.V., Kim da, H., Ravikumar, S., Choi, K.C., 2015. Probiotic
Potential of Lactobacillus Strains with Antifungal Activity Isolated from Animal Manure. Scientifi c World
Journal.2015:802570.
9. Lio, P.O.G.D., Leano, E.M.D., Penaranda, M.A.M., Villa, F.A.U., Sombito, C.D., Guanzon, J.R.N.G., 2005.
Anti-luminous Vibrio factors associated with the ‘green water” grow-out culture of the tiger shrimp Penaeus
monodon. Aquaculture. 250(1) 1-7.
10. Nguyen, V.D., Pham, T.T., Nguyen, T.H.T., Nguyen, T.T.X., Hoj, L., 2014a. Screening of marine bacteria with
bacteriocin-like activities and probiotic potential for ornate spiny lobster (Panulirus ornatus) juvenile. Fish and
Shellfi sh Immunology. 40(1): 49-60.
11. Nguyen, V.D., Pham, T.T., Pham, N.M.Q., 2014b. Two novel strains of bacteriocin-producing Lactobacillus
plantarum and their application as biopreservative in chill-stored fresh cobia meat. Journal of Pure and
Applied Microbiology. 8(2): 1547-1557.
12. Pham, T.T., Ho, T.H.N., Nguyen, V.D., 2014. Screening for bacteriocin-like antimicrobial activity against shrimp
pathogenic vibrios and molecular identifi cation of marine bacteria from otter clam Lutraria philippinarum. Thai
Journal of Veterinary Medicine. 44(3): 345-353.
13. Pundir, R.K., Rana, S., Kashyap, N., Kaur, A., 2013. Probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from food
samples: an in vitro study. Journal of Applied Pharmaceutical Science 3 (03):085-093.
14. Sirikharin, R., Taengchaiyaphum, S., Sanguanrut, P., Chi, T.D., Mavichak, R., Proespraiwong, P., Nuangsaeng,
B., Thitamadee, S., Flegel, T.W., Sritunyalucksana, K., 2015. Characterization and PCR detection of binary,
Pir-Like toxins from Vibrio parahaemolyticus isolates that Cause Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease
(AHPND) in Shrimp. PLoS One. 10(5):e0126987.
15. Sivakumar, N., Sundararaman, M., Selvakumar, G., 2012. Probiotic effect of Lactobacillus acidophilus against
vibriosis in juvenile shrimp (Penaeus monodon). African Journal of Biotechnology 11(91):15811-15818.
16. Talpur, A. D., Memon, A. J., Khan, M. I., Ikhwanuddin, M., Danish Daniel, M. M. and AbolMunafi , A. B., 2011.
Isolation and Screening of Lactic Acid Bacteria from the Gut of Blue Swimming Brab, P. pelagicus, an in vitro
Inhibition Assay and Small Scale in vivo Model for Validation of Isolates as Probiotics. Journal of Fisheries and
Aquatic Science. 7: 1-28.
17. Tendencia, E.A., Pena, M., 2003. Investigation of some components of the green water system which makes it
effective in the initial control of luminous bacteria. Aquaculture 218(1):115–119.
18. Tran, L., Nunan, L., Redman, R. M., Mohney, L.L., Pantoja, C. R., et al. 2013. Determination of the infectious
nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Diseases of Aquatic
Organisms. 105: 45–55.
19. Verschuere, L., 2000. Probiotic bacteria as biocontrol agents in aquaculture microbiol. Mol. Biol. Rev
64:655–671.
20. Zhou, X., Pan, Y., Wang, Y., Li, W., 2007. In vitro assessment of gastrointestinal viability of two photosynthetic
bacteria, Rhodopseudomonas palustris and Rhodobacter sphaeroides. J. Zhejiang Univ Sci B, 8(9), 686-692.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- tuyen_chon_mot_so_chung_vi_khuan_chiu_muoi_mat_chiu_axit_va.pdf