Tính đa hình thái đơn nucleotid 309 gen MDM2 và nguy cơ ung thư tế bào gan nguyên phát ở Việt Nam

TCNCYH 94 (2) - 2015 9 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 TÍNH ðA HÌNH THÁI ðƠN NUCLEOTID 309 GEN MDM2 VÀ NGUY CƠ UNG THƯ TẾ BÀO GAN NGUYÊN PHÁT Ở VIỆT NAM Trịnh Quốc ðạt, Phạm Lê Anh Tuấn, Nguyễn Thị Vân Hồng, Nguyễn ðức Hinh, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn, Trần Huy Thịnh Trường ðại học Y Hà Nội MDM2 là gen ñiều hòa ngược âm tính của gen ức chế khối u p53. Sự tăng cường biểu hiện của MDM2 sẽ ức chế sao chép, phiên mã, cũng như hoạt ñộng chức năng của gen p53. ða hình thái ñơn của gen MDM2 tại vị trí SNP309, rs2279744 (MDM2 - SNP309), với sự b iến ñổi từ T thành G trên intron 1 tăng cường biểu hiện MDM2 và ñã ñược chứng minh có sự liên quan ñến nguy cơ phát triển một số loại hình ung thư. Nghiên cứu này ñược thực hiện nhằm mục tiêu ñánh giá nguy cơ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát liên quan ñến kiểu gen MDM2 - SNP309 trên 167 bệnh nhân ung thư gan và 81 mẫu ñối chứng Việt Nam. Kết quả cho thấy: kiểu gen G/G có nguy cơ mắc bệnh cao hơn kiểu gen T/T (OR = 1,97; 95%, Cl = 0,92 - 4,21); sự khác biệt về ñộ tuổi mắc ung thư gan của kiểu gen G/G sớm hơn 8,83 năm (p = 0,03; 95%) so với kiểu gen T/T. Từ khóa: gen MDM2, SNP 309, ung thư tế bào gan nguyên phát ðịa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường ðại học Y Hà Nội Email: huythinhda@yahoo.com Ngày nhận: 25/3/2015 Ngày ñược chấp thuận: 31/5/2015 I. ðẶT VẤN ðỀ Trong con ñường tín hiệu p53, MDM2 là gen ñiều hòa ngược âm tính của gen ức chế ung thư p53. Vùng N - tận của phân tử MDM2 gắn kết với vùng hoạt hóa sao chép của gen p53 làm ức chế quá trình sao chép gen và biểu hiện của protein p53. ðây là protein có vai trò quan trọng trong kiểm soát sự phân chia và chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Khi các tổn thương gen xảy ra, protein p53 sẽ ñược hoạt hóa gây dừng chu kỳ phân bào cho ñến khi DNA ñược sửa chữa hoặc thúc ñẩy quá trình apoptosis nếu DNA tổn thương không sửa chữa ñược [1; 2]. Sự khiếm khuyết hay giảm biểu hiện của protein p53 sẽ gây hiện tượng tăng sinh tế bào bất thường, dẫn ñến sự hình thành và tiến triển của ung thư. Chính vì vậy, mỗi thay ñổi trên gen MDM2 ñều có thể làm thay ñổi sự phân bố và giáng hoá của p53 dẫn ñến những rối loạn trong quá trình sinh lý tế bào và biến các tế bào lành trở thành các tế bào ung thư. Các nghiên cứu gần ñây ñã chứng minh tính ña hình thái ñơn của gen MDM2 tại vị trí SNP309, rs2279744 (MDM2 - SNP309), với sự biến ñổi từ T thành G (MDM2 - SNP309 T > G) trên intron 1 gia tăng sự biểu hiện của MDM2 [3]. ðiều này làm gen p53 bị ức chế và là ñiều kiện cho các tế bào ung thư hình thành và tiến triển. Các nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng, MDM2 - SNP309 T > G có mối liên quan chặt chẽ ñến nguy cơ phát triển một số loại hình ung thư như ung thư phổi, ung thư vú, ung thư gan... Những người mang kiểu gen G/G có nguy cơ mắc ung thư cao hơn từ 2,5 ñến 6 lần và kiểu gen này có khả năng phát triển ung thư sớm hơn khoảng 10 năm so với kiểu gen nguyên thuỷ T/T [4; 6]. Tại Việt Nam chưa có một nghiên cứu nào xác ñịnh t ính ña hình thái gen MDM2-SNP309 trên bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát (UTTBGNP) cũng như ñánh giá mối tương 10 TCNCYH 94 (2) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC quan giữa t ính ña hình thái gen MDM2 với ung thư tế bào gan nguyên phát ñể từ ñó có thể sàng lọc, cảnh báo nguy cơ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát trong cộng ñồng. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu: Xác ñịnh tỷ lệ phân bố kiểu gen MDM2 - SNP309 t rên bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát Việt Nam và ñánh giá nguy cơ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát liên quan ñến các kiểu gen của MDM2. II. ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. ðối tượng - Nhóm nghiên cứu: 167 bệnh nhân ñược chẩn ñoán xác ñinh ung thư tế bào gan nguyên phát và ñược ñiều trị tại trung tâm Ung Bướu bệnh viện ða Khoa Thanh Hóa từ tháng 11 năm 2013 ñến tháng 8 năm 2014. - Nhóm chứng: 81 người bình thường ñược xác ñịnh không mắc ung thư gan hay bất kỳ loại hình ung thư nào khác. Nghiên cứu ñược thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường ðại học Y Hà Nội. 2. Phương pháp 2.1. Quy trình nghiên c1u - Thu thập mẫu máu của bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát và mẫu chứng. - Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử xác ñịnh kiểu gen của MDM2 - SNP309. - Sử dụng phần mềm thống kê ñể phân tích và xử lý kết quả. 2.2. Tách chi4t DNA - DNA ñược tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát và người lành ñối chứng. - Kiểm tra ñộ tinh sạch và ño nồng ñộ của DNA ñược tách chiết bằng phương pháp ño quang, dựa vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0. 2.3. Xác ñ;nh ki=u gen MDM2 SNP309 bEng kF thuGt PCR - RELP - Khuếch ñại vùng gen chứa SNP309 của gen MDM2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ñặc hiệu [7]: F: 5’-CGCGGGAGTTCAGGGTAAAG-3’ R: 5’-CTGAGTCAACCTGCCCACTG-3’ - Phân tích RFLP: Sản phẩm PCR ñược ủ với enzym cắt giới hạn MspA I ở ñiều kiện 37oC từ 18 ñến 22 giờ. Sản phẩm cắt ñược ñiện di t rên gel agarose 2% cùng với thang chuẩn 100bp. Các băng DNA ñược nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh bằng hệ thống máy EC3 Imaging system. ðoạn gen ñược nghiên cứu chứa trình tự nhận biết của enzym MspA I (TG!TG) tại vị trí codon 309. Khi MspA I cắt ñoạn gen sẽ tạo ra các ñoạn DNA có k ích thước 109 bp và 48 bp, tương ứng với kiểu gen GG. Khi base G bị thay thế bởi base T sẽ làm mất trình tự nhận biết của enzym MspAI, do ñó ñoạn gen sẽ không bị cắt, tương ứng với kiểu gen TT có kích thước 157bp. Nếu hình ảnh ñiện di có cả hai ñoạn gen cắt và ñoạn gen không bị cắt thì kết quả tương ứng với kiểu gen dị hợp GT. 3. ðạo ñức nghiên cứu Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không ñồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Các thông tin cá nhân sẽ ñược ñảm bảo bí mật. TCNCYH 94 (2) - 2015 11 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 III. KẾT QUẢ 1. Các ñặc ñiểm của nhóm ñối tượng nghiên cứu Bảng 1. ðặc ñiểm nhóm nghiên cứu ðặc ñiểm Nhóm bệnh Nhóm chứng p (95%) n % n % Giới Nam 128 76,2 61 75,3 0,816 Nữ 39 23,4 20 23,7 Tuổi (năm) 54,75 ± 11,14 56,42 ± 10,55 0,138 Nghiện rượu 55 32,9 15 18,5 Nhiễm HBV 109 65,3 74 91,7 Xơ gan 34 20,3 0 0 Trong 248 ñối tượng nghiên cứu có 167 bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát và 81 người bình thường ñối chứng. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p = 0,816; 0,138) về ñộ tuổi và giới tính giữa hai nhóm mắc ung thư tế bào gan nguyên phát và không mắc bệnh. Tỷ lệ nam mắc bệnh ung thư gan cao hơn nữ, (p < 0,01). 2. Kết quả phân tích các kiểu gen của MDM2 SNP309 K4t quO khu4ch ñPi vùng SNP 309 cSa gen MDM2 Hình 1. Hình ảnh ñiện di sản phẩm khuếch ñại ñoạn gen chứa SNP309 của gen MDM2 M: Thang chuẩn 100 bp. Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm PCR tốt, kết quả cho một băng rõ nét, kích thước tương ñương với ñoạn gen cần tìm. 12 TCNCYH 94 (2) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC K4t quO xác ñ;nh ki=u gen MDM2 SNP309 bEng kF thuGt PCR - RFLP 157 bp 109 bp 48 bp Hình 2. Hình ảnh ñiện di sản phẩm cắt enzym của gen MDM2 SNP 309 M: Thang chuẩn 100 bp; 1, 4, 7: Kiểu gen ñồng hợp tử T/T; 2 ,3 ,5, 6, 9, 10: Kiểu gen ñồng hợp tử G/G; 8: Kiểu gen dị hợp tử T/G. Sản phẩm cắt bằng enzym MspAI gồm các ñoạn DNA có kích thước khác nhau, phù hợp với tính toán lý thuyết. Mẫu mang kiểu gen T/T không có vị t rí cắt nên chỉ có 1 băng DNA có kích thước 157bp (giếng 1, 4, 7). Mẫu mang kiểu gen G/G bị cắt thành 2 băng DNA có kích thước 109 bp và 48 bp (giếng 2, 3, 5, 6, 9, 10 ). Mẫu mang kiểu gen dị hợp tử T/G có cả 3 băng DNA 157 bp, 109 bp và 48 bp (giếng 8). Sau khi phân t ích kiểu gen MDM2 - SNP 309 ở tất cả ñối tượng nghiên cứu, chúng tôi thấy có 68 mẫu kiểu gen T/T chiếm 27,4%, 114 mẫu kiểu gen dị hợp T/G chiếm 46,0%, kiểu gen ñồng hợp tử G/G là 66 người chiếm 26,6%. Như vậy tỷ lệ kiểu gen G/G và kiểu gen T/T trong quần thể nghiên cứu là tương ñối cân bằng. Khi phân t ích sự khác biệt tỷ lệ các kiểu gen theo giới t ính chúng tôi thấy không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê giữa hai giới (p = 0,7) ở mức tin cậy 95%. Bảng 2. Tần số kiểu gen MDM2 SNP 309 và tỷ số nguy cơ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát ða hình thái Nhóm bệnh Nhóm chứng Tỷ số nguy cơ (OR) (95% Cl) n1 % n2 % Kiểu gen T/T 43 25,7 25 30,9 1,00 T/G 73 43,7 41 50,6 1,035 (0,55 - 1,93) G/G 51 30,6 15 16,5 1,97 (0,92 - 4,21) Kiểu gen kết hợp T/T + T/G 116 69,4 66 81,5 1,00 G/G 51 30,6 15 16,5 1,93 (1,01- 3,70) TCNCYH 94 (2) - 2015 13 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 Kết quả phân tích kiểu gen MDM2 - SNP 309 theo hai nhóm ung thư gan và không ung thư gan ñược sử dụng tỷ suất chênh hay tỷ số nguy cơ (OR) ñể xác ñịnh nguy cơ mắc bệnh của kiểu gen G/G so với kiểu gen T/T. Kết quả cho thấy kiểu gen G/G có nguy cơ mắc ung thư gan cao gấp 1,97 lần kiểu gen T/T ở mức tin cậy 95%. Trong khi kiểu gen dị hợp tử T/G có nguy cơ mắc ung thư cao hơn kiểu gen T/T là 1,035 lần. ðể phân t ích sâu hơn chúng tôi kết hợp các kiểu gen lại và kết quả là kiểu gen G/G có OR 1,93 (Cl 95) so với T/T + T/G. 3. Kết quả phân tích sự khác biệt về ñộ tuổi phát hiện bệnh của các kiểu gen Bảng 3. ðộ tuổi trung bình phát hiện mắc ung thư tế bào gan nguyên phát của các kiểu gen MDM2 SNP 309 ðộ tuổi trung bình Mean ± SD p (95%) Kiểu gen T/T 60,3 ± 11,79 T/G 54,5 ± 9,22 0,7 G/G 51,9 ± 11,36 0,03 Kiểu gen kết hợp T/T + T/G 56,5 ± 10,58 0,15 T/G + G/G 53,5 ± 10,10 0,09 Theo kết quả ở bảng trên ta thấy ñộ tuổi phát hiện bệnh ở kiểu gen T/T là cao nhất 60,3 tuổi. Trong khi ñộ tuổi phát hiện bệnh ở kiểu gen ñột biến G/G là sớm nhất 51,9 tuổi. Sự chênh lệch về ñộ tuổi phát hiện bệnh giữa hai kiểu gen là 8,82 năm (p = 0,03; 95%). IV. BÀN LUẬN MDM2 có chức năng ñiều hòa ngược âm tính hoạt ñộng của p53. Sự biểu hiện quá mức của MDM2 làm ức chế khả năng kiểm soát tế bào của p53 dẫn ñến mất kiểm soát các chu trình phân bào, khả năng tự sửa chữa DNA, và chương trình chết tế bào. Kết quả này là nguyên nhân ñể hình thành nên các tế bào ung thư. Nghiên cứu của Bond và cộng sự năm 2004 ñã chỉ ra MDM2 SNP 309 T > G có thể làm tăng cường tổng hợp protein MDM2 ở những kiểu gen ñột biến [2]. Cụ thể kiểu gen G/G tăng hơn kiểu gen T/T 4 lần và kiểu gen T/G tăng hơn 1,9 lần so với kiểu gen T/T. Các nghiên cứu khác cũng ñánh giá sự khác biệt tỷ lệ các kiểu gen MDM2 SNP309 trong một số loại hình ung thư như ung thư phổi, ung thư vú, ung thư ñại tràng, ung thư tế bào vẩy, hội chứng Li-Fraumeni. Nghiên cứu ñánh giá nguy cơ ung thư tế bào gan nguyên phát của các kiểu gen thay thế T thành G của MDM2 -SNP309 so với kiểu gen không thay thế T (wild type) trên bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát Việt Nam. Với 167 bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát và 81 người bình thường ñã ñược phân tích gen tại Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường ðại học Y Hà Nội. Kết quả cho thấy kiểu gen G/G của MDM2 NP309 tăng nguy cơ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát so với kiểu gen T/T (OR = 1,97, 95%, Cl = 0,92 - 4,21) so kết quả của Y.J. Yoon và 14 TCNCYH 94 (2) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC cộng sự [10] nghiên cứu trên người Hàn Quốc bị ung thư gan (OR = 2,67, 95%, Cl = 1,68 - 4,22), thì nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn nghiên cứu tại Hàn quốc về tỷ số OR (1,97/2,67). Tuy nhiên kết quả vẫn cho thấy một sự ñồng nhất. Theo nghiên cứu khác trên ung thư phổi của Zhang và cộng sự trên người Trung Quốc, tỷ số nguy cơ thấp hơn của chúng tôi nhưng không ñáng kể (OR = 1,27; 95% Cl = 1,12 - 1,44) [11]. Chúng tôi ñặt vấn ñề về sự tương ñồng các chủng tộc tại vùng ðông Á như Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, ðài Loan là ñáng kể vì cũng nghiên cứu MDM2 trên ung thư vú nhưng ở người Mỹ gốc Phi thì kết quả là (0,8; 95% và 0,4 – 1,6), người Mỹ da trắng là (0,9; 95% và 0,7 - 1,1). Phân tích sâu hơn chúng tôi cũng tổ hợp hai kiểu gen lại ñể so sánh các allen G với T thì kết quả cũng cho thấy những kiểu gen có chứa allen G thì nguy cơ mắc bệnh là cao hơn so với những kiểu gen có chứa allen T (OR = 1,93; 1,287). Trong một số nghiên cứu về MDM2 SNP309 trên bệnh nhân ung thư các tác giả ñã chú ý ñến khía cạnh tuổi mắc bệnh của các kiểu gen. Kết quả tại một số nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt về ñộ tuổi mắc bệnh giữa các kiểu gen. Nghiên cứu của chúng tôi (bảng 3) cho thấy, ñộ tuổi phát hiện bệnh ở kiểu gen T/T là cao nhất 60,3 tuổi. Trong khi ñộ tuổi trung bình phát hiện bệnh ở kiểu gen G/G là sớm nhất 53,5 tuổi. Sự chênh lệch về ñộ tuổi phát hiện bệnh giữa hai kiểu gen là 8,8 năm (p = 0,03; 95%). So sánh với nghiên cứu của Y.J. Yoon và cộng sự [10] kiểu gen TT là 55,1 còn G/G là 50,9 (p = 0,018). ðộ tuổi trung bình mắc bệnh của kiểu gen chứa allen G cũng sớm hơn các kiểu gen chứa allen T. ðộ tuổi trung bình mắc bệnh sớm hơn ở kiểu gen G/G không những minh chứng cho lý thuyết về sự ức chế p53 của MDM2 mà còn ñặt vấn ñề bản thân MDM2 tự nó cũng là một yếu tố liên quan ñến hình thành khối u. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi ñã cho thấy một thực tế là kiểu gen ñồng hợp tử thay thế T thành G (G/G) của MDM2 - SNP309 có nguy cơ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát cao hơn kiểu gen T/T và tuổi mắc bệnh ở kiểu gen này cũng sớm hơn. Những kết quả này mở ra khả năng phát triển MDM2 thành marker sàng lọc các quần thể có nguy cơ cao mắc ung thư gan tại Việt Nam. V. KẾT LUẬN - Kiểu gen G/G của gen MDM2 tại nucleo- tid 309 có nguy cơ mắc ung thư tế bào gan nguyên phát cao hơn kiểu gen TT là 1,97 lần. - Có sự khác biệt về ñộ tuổi trung bình mắc ung thư tế bào gan nguyên phát giữa các kiểu gen MDM2 - SNP 309. Trong ñó người mang kiểu gen G/G có thể phát bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát sớm hơn khoảng 8,83 năm (p < 0,05). Lời cám ơn Nghiên cứu ñược thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của ñề tài nhánh cấp nhà nước “ðánh giá sự phân bố kiểu gen của một số gen liên quan ñến ung thư phổi và ung thư gan” thuộc ñề tài nhiệm vụ Quỹ gen “ðánh giá ñặc ñiểm di truyền người Việt Nam”. Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Khoa Tiêu hóa Bệnh viện Bạch Mai, ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ trong quá trình nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Momand, J (1992). The mdm-2 onco- gene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactiva- tion. Cell, 69, 1237 - 1245. 2. Dharel et al (2006). MDM2 promoter SNP 309 is associated with the risk of hepato- TCNCYH 94 (2) - 2015 15 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 cellular carcinoma in patients with chronic hepatis C. Clin. Cancer Res., 12, 4687-4871. 3. Bond,G.L (2004). A single nucleotid polymorphism in the MDM2 promoter attenu- ates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell, 119, 591 - 602. 4. Li,G (2006). MDM2 gene promoter polymorphisms and risk of lung cancer: a case-control analysis. Carcinogenesis, 27, 2008 - 2033. 5. Ohmiya, N (2006). MDM2 promoter polymorphism is associated with both an in- creased susceptibility to gastric carcinoma and poor pro-nosis. J. Clin. Oncol, 24, 4434 - 4440. 6. Hu, W (2007). A single nucleotide poly- morphism in the MDM2 gene disrupts the oscillation of p53 and MDM2 levels in cells. Cancer Res, 67, 2757 - 2765. 7. Park,S.H (2006). MDM2 309 T > G poly morphism and risk of lung cancer in a Korean population. Lung cancer, 54, 1539 - 1558. 8. Bond,G.L (2006). MDM2 SNP309 accel- erates tumor formation in a gender - specific and hormon-dependent manner. Cancer Res, 66, 5104 - 5110. 9. Cample, I.G (2006). No association of the MDM2 SNP 309 polymorphism with risk of breast or ovarian cancer. Cancer Lett, 240, 195 - 197. 10. Young, J.Y (2008). MDM2 and poly- morphisms are associated with the develop- ment of hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis B virus infection. Carcinogenesis, 29, 1192 - 1196. 11. Zhang, X (2006). Genetic polymor- phisms in cell cycle regulatory genes MDM2 and TP53 are associated with susceptibility to lung cancer. Hum. Mutat, 27, 110-117. Summary MDM2 SNP309 T > G POLYMOPHISM AND RISK OF HEPATOCELLULAR CARCIMOMA IN A VIETNAMESE POPULATION MDM2 gene is a negative regulator of tumor suppressor gene p53. Over-expression of MDM2 can result in inactivation of p53 and diminish its suppressor function. In this case, cells can be damaged to escape the cell-cycle check-point control and become carcinogenic. Recently, the SNP309 T > G, rs 2279744 (MDM2 - SNP309), in intron 1 was found to increased the MDM2 level. A number of studies have explored whether SNP309 was associated with the risk of different types of cancer. In this study, we examined the genotypes distribution of MDM2 SNP309 in 167 hepatocellular carcinoma and 81 noncancer controls of Vietnam by RFLP - PCR method. The result showed that G/G genotype has a higher risk of developping hepatocellular carcinoma than T/T genotype (OR = 1.97, 95%, Cl = 0.92 - 4.21). The mean age of tumor onset in patients with G/G genotype was 8.83 years earlier than the T/T wild type genotype (p < 0.05; 95%). Key words: MDM2 gene, SNP309, Hepatocellular carcinoma