Xác định thời gian khai thác huyết thanh ngựa chửa thích hợp nhờ phương pháp định lượng hormone EIA

Nguyễn Mạnh Hà Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 62(13): 106 - 110 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 106 XÁC ĐỊNH THỜI GIAN KHAI THÁC HUYẾT THANH NGỰA CHỬA THÍCH HỢP NHỜ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG HORMONE EIA Nguyễn Mạnh Hà Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Đề tài tiến hành định lƣợng hàm lƣợng progesterone trong máu ngựa cái ở các ngày 7, 14, 21sau phối giống và và ngựa cái ở các ngày mang thai thứ 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120. Hàm lƣợng progesterone ở ngựa sau phối giống tăng và đạt giá trị cao ở 7 ngày sau phối giống (2,64  0,17ng/ml ở nhóm II đến 2,70  0,26 ng/ml ở nhóm I) và tăng nhƣng không đáng kể cho tới ngày thứ 14 sau phối giống (2,66  0,29 ng/ml ở nhóm II và 2,73  0,24 ng/ml ở nhóm I). Hàm lƣợng progesterone đạt giá trị 4,05  0,23ng/ml ở ngày chửa thứ 40, tăng nhanh đến ngày chửa thứ 60 đạt giá trị 7,11  0,32ng/ml. Hàm lƣợng progesterone tiếp tục tăng nhƣng không đáng kể cho tới ngày chửa thứ 90, (7,42  0,19ng/ml) sau đó giảm dần và đạt giá trị 4,28  0,16ng/ml ở ngày chửa thứ 120. Từ khóa: Nồng độ, progesterone, ngựa cái, huyết thanh, phối MỞ ĐẦU Kích dục tố huyết thanh ngựa chửa (Pregnant Mare Serum Gonadotropin viết tắt là PMSG) là chế phẩm sinh học đƣợc chiết xuất từ huyết thanh ngựa trong thời gian ngựa mang thai. Trong chăn nuôi, PMSG đƣợc sử dụng chủ yếu để kích thích nhằm nâng cao khả năng sinh sản đối với gia súc cái. Để sản xuất PMSG, một trong những yêu cầu đầu tiên là phải khai thác đƣợc huyết thanh ngựa chửa có hoạt tính hormone cao, nghĩa là phải xác định đƣợc hoạt tính hormone có trong huyết thanh và thời gian khai thác phù hợp. Phƣơng pháp xác định mức độ hoạt tính hormone có trong huyết thanh ngựa chửa hiện nay đƣợc sử dụng một cách phổ biến là thử phản ứng và kiểm tra mức độ sƣng tử cung của chuột nhắt trắng. Phƣơng pháp này cho độ chính xác tƣơng đối cao nhƣng mất nhiều thời gian, kinh phí và mức độ chính xác phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của ngƣời làm thí nghiệm. Để khắc phục những hạn chế của phƣơng pháp sinh học đồng thời có thêm cơ sở khoa học giúp cho việc xác định thời gian hormone trong huyết thanh ngựa chửa có hoạt tính cao, đề tài tiến hành định lƣợng progesterone có trong huyết thanh ngựa sau phối giống và ngựa chửa bằng kỹ thuật EIA-Progesterone. Nguyên tắc của phƣơng pháp định lƣợng  Tel: 0912 004 814, E.mail: anhnguyenha@yahoo.com đƣợc tiến hành trong đề tài này là xác định gián tiếp mức hoạt tính của PMSG có trong huyết thanh ngựa sau phối giống và trong thời gian mang thai. Trên cơ sở sự biến đổi về nồng độ của hormone progesterone ở ngựa sau phối giống và ngựa chửa là cơ sở xác định thời điểm khai thác huyết thanh phù hợp để sản xuất PMSG. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu - Huyết thanh ngựa cái ở các ngày thứ 7, 14 và 21 sau phối giống: 12 con chia thành 2 nhóm: nhóm I có 9 con, nhóm II có 3 con. - Huyết thanh ngựa chửa ở các ngày 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 và 110 (8 con). - Các hóa chất phục vụ kỹ thuật định lƣợng EIA-Progesterone Phƣơng pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu huyết thanh: Huyết thanh đƣợc lấy từ máu ở tĩnh mạch cổ của ngựa. Máu đƣợc lấy vào buổi sáng sớm, mỗi lần lấy khoảng 10ml/mẫu/con. Sau khi lấy đƣợc máu, để ống nghiệm nằm im, hơi nghiêng theo phƣơng thẳng đứng, đợi cho phần máu đông chìm xuống dƣới, phần huyết thanh màu vàng nổi lên trên thì chắt huyết thanh ra một ống nghiệm khác. Huyết thanh lấy đƣợc đem phân tích ngay, nếu chƣa phân Nguyễn Mạnh Hà Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 62(13): 106 - 110 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 107 tích ngay đƣợc thì phải bảo quản ở nhiệt độ lạnh sâu –200C. - Phương pháp định lượng hormone: Sử dụng phƣơng pháp định lƣợng miễn dịch enzym ELISA với kỹ thuật EIA-Progesterone [2] phân tích hàm lƣợng progesterone trong máu ngựa. Nồng độ progesteron đƣợc đánh giá theo đơn vị quốc tế ng/ml, theo chƣơng trình phần mềm đã đƣợc cài đặt sẵn trong máy tính. Các chỉ tiêu nghiên cứu: +. Hàm lƣợng progesterone trong huyết thanh ngựa ở các ngày 7, 14, 21 sau phối giống (ng/ml) +. Hàm lƣợng progesterone trong huyết thanh ngựa ở các ngày chửa 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 (ng/ml) - Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thu đƣợc sử lý trên máy vi tính theo phƣơng pháp thống kê sinh vật học của Nguyễn Văn Thiện và cs (2002) [1] và trên phần mềm máy tính. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hàm lƣợng progesterone ở ngựa sau phối giống Phân tích hàm lƣợng progesterone của 12 ngựa sau phối giống chúng tôi thu đƣợc kết quả ở bảng 1 và đồ thị hình 1. Kết quả ở bảng 1 và đồ thị hình 1 cho thấy: - Hàm lƣợng progesterone ở ngựa sau phối giống tăng và đạt giá trị cao ở 7 ngày sau phối giống (2,64  0,17ng/ml ở nhóm II đến 2,70  0,26 ng/ml ở nhóm I). Nhƣ vậy ở tất cả ngựa theo dõi trong thí nghiệm đều đã có hoạt động của thể vàng sau rụng trứng. - Hàm lƣợng progesterone trong máu tăng nhƣng không đáng kể ở ngựa cho tới ngày thứ 14 sau phối giống (2,66  0,29 ng/ml ở nhóm II và 2,73  0,24 ng/ml ở nhóm I). So sánh hàm lƣợng progesterone giữa 2 nhóm ngựa ở các ngày 7 và 14 sau phối giống chúng tôi nhận thấy mặc dù hàm lƣợng progesterone có sự khác nhau giữa 2 nhóm: ở 7 ngày ngày nhóm I đạt 2,70  0,26ng/ml, nhóm II đạt 2,64  0,17 ng/ml, còn ở 14 ngày nhóm I đạt 2,73  0,24 ng/ml, nhóm II đạt 2,66  0,29 ng/ml, nhƣng sự sai khác này không rõ rệt và hoàn toàn do ngẫu nhiên sinh ra với P > 0,05. Từ kết quả này chúng tôi nhận thấy progesterone trong máu ngựa đạt đỉnh cao của sự phân tiết và giữ ổn định trong máu ở mức 2,64  0,17 đến 2,70  0,26 ng/ml ở ngày thứ 7, và ở mức 2,66  0,29 đến 2,73  0,24 ở ngày thứ 14 sau phối giống. Các kết quả nghiên cứu của Nagy P và cs (2001) [5], Patricia Sertich (2002) [7] đều xác nhận: Hàm lƣợng progesterone sau phối giống ở ngựa cái tăng nhanh và đạt đỉnh cao của sự phân tiết từ ngày thứ 5 (đến ngày thứ 7) sau phối giống. Hàm lƣợng progesterone giữ thăng bằng ở đỉnh cao phân tiết cho đến kết thúc pha thể vàng. Hàm lượng progesterone (ng/ml) Hình 1. Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng progesterone ở ngựa sau phối giống Bảng 1. Hàm lƣợng progesterone ở ngựa sau phối giống Nhóm ngựa Hàm lƣợng progesterone ở ngựa các ngày sau phối (ng/ml) Kết quả khám thai qua trực tràng 7 ngày 14 ngày 21 ngày KQ % Nhóm I (n = 9) 2,70a  0,26 2,73b  0,24 3,04  0,29 8/9 ngựa có thai 88,88 Nhóm II (n = 3) 2,64a  0,17 2,66b  0,29 0,92  0,10 3/3 không có thai 100,0 Ghi chú: So sánh trong cùng cột dọc, các chữ cái giống nhau thì không có ý nghĩa thống kê với P> 0,05 Nguyễn Mạnh Hà Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 62(13): 106 - 110 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 108 Kết quả nghiên cứu để chẩn đoán có thai sớm trên bò của Nakao.T và cs (1983) [6] cũng khẳng định hàm lƣợng progesterone đo đƣợc trong sữa gầy tăng từ ngày chửa thứ 2 đến 3 sau phối giống. Vì điều kiện chƣa xác định đƣợc biến động về hàm lƣợng progesterone theo từng ngày trong giai đoạn này, nên trong phạm vi của kết quả thí nghiệm chúng tôi có thể kết luận progesterone đạt đỉnh cao phân tiết ở ngày thứ 7 sau phối giống với hàm lƣợng > 2,64 ng/ml, tuy nhiên chúng tôi cũng đề nghị cần tiến hành nghiên cứu thêm ở mức chi tiết hơn để xác định ngày và giờ cụ thể khi progesterone đạt đỉnh cao phân tiết trong máu. Kết quả phân tích ở 21 ngày sau phối giống đã hình thành 2 nhóm ngựa có hàm lƣợng progesterone khác nhau rõ rệt: - Nhóm I (n = 9) có hàm lƣợng progesterone trong máu vẫn duy trì ở mức cao và có xu hƣớng tiếp tục tăng hơn so với giai đoạn 14 ngày sau phối giống (3,04  0,29 ng/ml) - Nhóm II (n = 3) có hàm lƣợng progesterone trong máu giảm thấp hơn rất nhiều so với nồng độ đo đƣợc ở 14 ngày sau phối giống (0,92  0,10 ng/ml). Với kết quả thu đƣợc, chúng tôi nhận thấy: Ở nhóm I thể vàng vẫn duy trì hoạt động và tiết progesterone nên hàm lƣợng đo đƣợc của hormone này trong máu cao, còn ở nhóm II chắc chắn thể vàng đã bị phân giải nên hàm lƣợng progesterone trong máu giảm thấp. Từ kết quả này chúng tôi cho rằng 3 ngựa thuộc nhóm II không có chửa. Khám thai cho ngựa ở các thời gian sau đều xác nhận 3 ngựa thuộc nhóm II không có chửa, còn ở nhóm I có 8/9 ngựa (88,88%) đƣợc xác định là có thai. Nhƣ vậy việc phân tích hàm lƣợng progesterone trong máu ngựa sau phối giống 21 ngày có thể sơ bộ chẩn đoán sự mang thai sớm ở ngựa, điều quan trọng hơn là có thể xác định đƣợc sớm những cá thể ngựa đã phối giống nhƣng không thụ thai ở chu kỳ trƣớc để có kế hoạch gây động dục và phối giống lại ở chu kỳ tiếp theo. Chẩn đoán có thai sớm đối với ngựa sau phối 21 ngày trong thí nghiệm của chúng tôi đạt 88,88% (8 con có chửa trong số 9 ngựa có hàm lƣợng progesteron cao ở ngày thứ 21 sau phối giống), có 1 con kiểm tra sau đó xác định không có chửa mặc dù hàm lƣợng progesterone tƣơng đƣơng so với 8 con còn lại. Có thể trong trƣờng hợp này do phôi bị chết sớm sau 2 tuần. Kết quả định lượng hàm lượng progesterone trong huyết thanh ngựa chửa Theo dõi diễn biến về hàm lƣợng progesterone trong thời gian mang thai của 8 ngựa từ ngày chửa thứ 40 đến ngày chửa thứ 120 ở bảng 2 và đồ thị hình 2 chúng tôi nhận thấy: Bảng 2. Hàm lƣợng progesterone trong huyết thanh ngựa giai đoạn có chửa từ 40-120 ngày Ngày chửa Số con (n) Hàm lƣợng Progesterone (ng/ml) 40 8 4,05 0,23 50 8 4,34 0,24 60 8 7,11 0,32 70 8 7,25 0,28 80 8 7,37 0,22 90 8 7,42 0,19 100 8 5,91 0,25 110 8 5,30 0,32 120 8 4.28  0.16 Ở ngày chửa thứ 40 hàm lƣợng progesterone đạt giá trị 4,05  0,23ng/ml tăng lên 4,34  0,24 ng/ml ở ngày chửa thứ 50. Sau 50 ngày chửa, hàm lƣợng progesterone bắt đầu tăng nhanh đến ngày chửa thứ 60 đạt giá trị 7,11  0,32ng/ml. Hàm lƣợng progesterone tiếp tục tăng nhƣng không đáng kể cho tới ngày chửa thứ 90, (7,42  0,19ng/ml) sau đó giảm dần và đạt giá trị 4,28  0,16ng/ml ở ngày chửa thứ 120. Các kết quả nghiên cứu về hàm lƣợng progesterone trong thời gian sau phối giống ở ngựa của một số tác giả: Hammond và cs (1975) [3] đều cho thấy: hàm lƣợng progesterone do thể vàng buồng trứng phân tiết trong máu bắt đầu tăng cao từ ngày chửa thứ 30, đạt giá trị cao nhất trong khoảng thời gian Nguyễn Mạnh Hà Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 62(13): 106 - 110 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 109 từ khoảng 60-120 ngày chửa sau đó giảm dần đạt giá trị thấp từ ngày chửa thứ 180 trở đi. Hàm lượng progesterone (ng/ml) Hình 2. Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng progesterone trong huyết thanh ngựa giai đoạn có chửa từ 40 - 120 ngày Các kết quả nghiên cứu về kích dục tố trong huyết thanh ngựa chửa của Lars-Eric Edqvist và cs (1980) [4] đã khẳng định kích dục tố trong huyết thanh ngựa chửa (PMSG) bắt đầu xuất hiện từ ngày chửa thứ 40 sau đó tăng nhanh và đạt mức hoạt tính cao nhất từ ngày chửa thứ 60-90. Hoạt tính PMSG giảm dần tới ngày chửa 120 và sau 180 ngày không thấy xuất hiện trong máu nữa. Từ kết quả nghiên cứu của đề tài và so sánh kết quả nghiên cứu về thời gian xuất hiện hoạt tính và có hoạt tính cao của PMSG trong huyết thanh ngựa chửa của một số tác giả đã nghiên cứu chúng tôi nhận thấy: từ ngày chửa thứ 40 hàm lƣợng progesterone tăng cao tƣơng ứng với sự xuất hiện hoạt tính của PMSG. Giai đoạn từ ngày chửa tứ 60-90 hàm lƣợng progesterone trong máu đạt giá trị cao nhất tƣơng ứng với thời gian hoạt tính hormone trong máu đạt giá trị cao nhất (Hoạt tính PMSG đạt giá trị cao khi hàm lƣợng progesterone trong máu lớn hơn 7ng/ml) và từ ngày chửa thứ 90 hàm lƣợng progesterone và hoạt tính hormone trong máu đều giảm dần. Từ kết quả thí nghiệm chúng tôi nhận thấy khai thác huyết thanh ngựa chửa có thể tiến hành trong thời gian ngựa có chửa từ 40-120 ngày nhƣng để có hoạt tính cao thì chỉ nên khai thác trong khoảng thời gian có chửa từ 60-90 ngày. KẾT LUẬN Nếu ở ngày thứ 21 sau khi phối giống hàm lƣợng progesterone thấp dƣới 1ng/ml có thể khẳng định ngựa không có chửa, nếu đạt trên 3ng/ml thì ngựa có chửa với tỷ lệ cao (trong thí nghiệm của chúng tôi đạt 88,88%).Hàm lƣợng progesterone ở ngày chửa thứ 40 đạt giá trị 4,05  0,23ng/ml, bắt đầu tăng nhanh đến ngày chửa thứ 60 đạt giá trị 7,11  0,32 ng/ml. Hàm lƣợng progesterone tiếp tục tăng nhƣng không đáng kể cho tới ngày chửa thứ 90 (7,42  0,19 ng/ml) sau đó giảm dần và đạt giá trị 4,28  0,16 ng/ml ở ngày chửa thứ 120. Khai thác huyết thanh ngựa chửa có thể tiến hành trong thời gian ngựa có chửa từ ngày thứ 40 đến ngày 120, tuy nhiên chỉ nên khai thác trong thời gian từ ngày chửa thứ 60-90. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Văn Thiện, Nguyễn Khánh Quắc, Nguyễn Duy Hoan (2002), Phương pháp nghiên cứu trong chăn nuôi, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội [2]. Viện Chăn nuôi (2002), Phương pháp ELISA để kiểm tra progesterone, Dự án nâng cao kỹ thuật thụ tinh nhân tạo bò, cơ quan hợp tác quốc tế Nhật Bản (JICA)-Viện chăn nuôi, Hà Nội. [3]. Hammond. J; Johansson. I; Haring. F (1975), Nguyên lý sinh học của năng suất động vật, Nxb khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 116 [4]. Lars-Eric Edqvit and Geoge.H. Stabenfeldt (1980), "Reproduction Hormone" Clinical Bio- Chemistry of Domestic Animals, Academic Press, New York, USA, Third edition, p.525. [5]. Nagy. P; Gy. Huszenicza; Reiczigel.J; Juhỏsz; Kulcsỏr; Abvỏry.K and Guillaume.D (2001),"Factors affecting plasma progesterone concentration and the retrospective determination of time of ovulation in cyclic mares", Theriogenology, Elsevier, 61, p. 203-214. [6]. Nakao.T; Sugihashi.A; Saga.N; Kawata.K and Tsunoda.N (1983),"Milk progesterone level in cows with normal or prolonged estrus, cycle, referened to early pregnancy diagnosis", Japennes Journal Veterinary Science, 45, p. 495-499. [7]. Patricia Sertich (2002), "Pregnancy Evaluation in the mare", Theriogenology, p 103- 111, Elsevier. Trần Công Quân và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 62(13): 3 - 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 110 SUMMARY DETERMINING THE SUITABLE TIME TO EXPLOIT PREGNANT MARE SERUM BY EIA METHOD Nguyen Manh Hà  College of Agriculture and Forestry – Thai Nguyen University The progesterone concentration of mare obtaine highe value at day 7th (2,64  0,17ng/ml at group II and 2,70  0,26 ng/ml at group I) and insrease continuously to day 14th ( 2,66  0,29 ng/ml at group II to and 2,73  0,24 ng/ml at group I) affter insemination. The progesterone concentration in blood increase quickly affter mare conception. The progesterone concentration reach 4,05  0,23ng/ml at day 40th of pregnant and increase quickly at 7,11  0,32ng/ml in day 60th. The progesterone concentration increase continuously at day 90th (7,42  0,19ng/ml) and then reduce to 4,28  0,16ng/ml at day 120th of pregnant. Base on of progesterone concentration in blood of pregnant mare, the pregnant mare serum suit be exploited from day 60th to day 90th of pregnant. Key words: progesterone, concentration, mare, pregnant, determining  Tel: 0912 004 814, E.mail: manhnguyenha@yahoo.com