Tối ưu hóa sự chuyển nạp gen ở lan dendrobium sonia qua trung gian vi khuẩn agrobacterium tumefaciens - Nguyễn Xuân Dũng

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 257-265 257 TỐI ƯU HÓA SỰ CHUYỂN NẠP GEN Ở LAN Dendrobium Sonia QUA TRUNG GIAN VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Nguyễn Xuân Dũng1*, Dương Hoa Xô1, Chu Hoàng Hà2 1Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh, *nguyenxuandung294@gmail.com 2Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam TÓM TẮT: Trong nghiên cứu này, sự chuyển nạp gen được thiết lập trên protocorm like bodies (PLBs) ở hoa lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa vector pCambia 1301 có mang gen GUS và gen kháng kanamycin. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự chuyển nạp gen bao gồm môi trường tái sinh và tăng trưởng PLBs, nồng độ acetosyringone (AS); thời gian đồng nuôi cấy; chủng Agrobacterium; nồng độ kháng sinh diệt khuẩn (cefotaxime) và sàng lọc mô chuyển gen (hygromycin) đã được khảo sát. Kết quả cho thấy, môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l NAA kết hợp với 0,5 mg/l hay 0,3 mg/l BA thích hợp cho sự tái sinh PLBs từ lát cắt mô thân. Hiệu quả chuyển gen (tỷ lệ PLBs biểu hiện gen GUS) cao nhất đạt được khi PLBs được lây nhiễm và đồng nuôi cấy với Agrobacterium trên môi trường chứa 100 µM AS trong 3 ngày (với chủng EHA105 và C58) hay 4 ngày (với chủng LBA4404). Cefotaxime 300 mg/l và hygromycin 7-15 mg/l thích hợp cho sự diệt khuẩn và sàng lọc PLBs chuyển gen. Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Dendrobium Sonia, chuyển nạp gen, tái sinh PLBs. MỞ ĐẦU Lan Dendrobium Sonia, một dòng lai giữa lan Dendrobium Caesar và Dendrobium Tomie Drake [14], được trồng phổ biến ở Việt Nam cho mục đích sản xuất hoa cắt cành. Cho đến nay, nhu cầu của thị trường đối với hoa lan Dendrobium Sonia vẫn không ngừng gia tăng, vì vậy, việc nghiên cứu chuyển gen nhằm cải thiện chất lượng loài lan này là một vấn đề có ý nghĩa quan trọng. Có hai phương pháp chuyển gen thường được sử dụng trên hoa lan đó là sử dụng súng bắn gen và vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, phương pháp chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium hiện đang được quan tâm do tính hiệu quả của nó. Đã có nhiều nghiên cứu chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium trên lan Dendrobium [1, 2, 3, 8, 15], và một số loài lan khác như Hồ điệp [6, 9, 12], Vanda [12], Cattleya [16], Oncidium [7, 11], Cymbidium [4] được công bố trên thế giới. Tuy nhiên, các nghiên cứu chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium trên lan Dendrobium Sonia hầu như chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam. Việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen vào loài lan này là thật sự cần thiết, tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. Nghiên cứu này tiến hành tối ưu hóa một số nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium trên lan Dendrobium Sonia như môi trường tái sinh và tăng trưởng PLBs, nồng độ AS, thời gian đồng nuôi cấy, chủng vi khuẩn, nồng độ kháng sinh diệt khuẩn và sàng lọc mô chuyển gen. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đoạn thân (giả hành) của cây lan Dendrobium Sonia trồng tại vườn ươm của Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh được sử dụng làm vật liệu. Hình 1. Cấu trúc vùng T-DNA trên vector pCambia 1301 LAC Z CAM35S HYR(R) GUS 35S pro NOS RB LB MSC GUS first exon Catalase intron Nguyen Xuan Dung, Duong Hoa Xo, Chu Hoang Ha 258 Sử dụng các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404, EHA105, C58 mang vector pCambia 1301 với vùng T-DNA chứa gen GUS và gen kháng hygromycin (hình 1). Khảo sát môi trường thích hợp cho sự tái sinh tạo PLBs từ lát cắt mỏng đoạn thân lan Dendrobium Sonia nuôi cấy in vitro Đoạn thân ở vị trí giữa hai chồi ngủ của cây lan Dendrobium Sonia in vitro (cao 3-5 cm) được tách và cắt thành những lát mỏng (0,5 mm) theo hướng vuông góc với chiều dài đoạn thân. Các lát cắt mỏng sau đó được đặt nuôi cấy trên môi trường MS [10] có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA ở các nồng độ từ 0,1-0,3 mg/l kết hợp lần lượt với NAA ở các nồng độ từ 0,5-5 mg/l. Mẫu cấy được đặt ở điều kiện ánh sáng 2.500±500 lux, nhiệt độ 25±2oC, ẩm độ 50±5%. Theo dõi sự phát sinh PLBs sau 4 tuần nuôi cấy. Thí nghiệm được lập lại 3 lần với số lượng 3 bình/công thức/lần lập lại. Khảo sát môi trường thích hợp cho sự tăng sinh và phát triển PLBs Các PLBs (đường kính khoảng 1,0 mm) của lan Dendrobium Sonia được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ 0,1; 0,3 và 0,5 mg/l kết hợp lần lượt với NAA ở nồng độ 1,0 mg/l. Mẫu cấy được nuôi cấy ở điều kiện ánh sáng 2.500±500 lux, nhiệt độ 25±2oC, ẩm độ 50±5%. Theo dõi sự tăng trưởng của PLBs sau 10 tuần nuôi cấy. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩn lên khả năng chuyển gen vào PLBs Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen Vi khuẩn được tăng sinh qua đêm trong môi trường LB (3 ml) có bổ sung 50 mg/l kanamycin và 50 mg/l rifamicin, ở 28oC, tốc độ lắc 250 vòng/phút. Mẫu vi khuẩn sau khi tăng sinh, sẽ được kiểm tra OD để đảm bảo giá trị OD nằm trong khoảng từ 0,6-1, sau đó tiến hành li tâm thu sinh khối vi khuẩn ở 8.000 vòng/phút trong 10 phút. Sinh khối vi khuẩn thu được sau khi li tâm được pha loảng với môi trường MS lỏng (cùng thể tích tăng sinh) có bổ sung chất cảm ứng AS (Acetosyringone) ở các nồng độ 0, 50, 100, 200 và 300 M. Chuẩn bị PLBs và thực hiện đồng nuôi cấy Tiến hành tách riêng từng PLBs từ các cụm PLBs có nguồn gốc từ lát thân cắt mỏng của cây lan Dendrobium Sonia in vitro. Việc tách các PLBs được thực hiện trong môi trường MS lỏng. PLBs sau khi tách được ngâm trong môi trường MS có bổ sung chất cảm ứng AS ở các nồng độ 0, 50, 100, 200 và 300 M trong 15 phút ở 25oC. Sau đó, PLBs được chuyển sang ủ tiếp tục trong môi trường MS có bổ sung AS ở các nồng độ tương tự nhưng có bổ sung thêm vi khuẩn (đã thực hiện trong phần chuẩn bị vi khuẩn) trong 30 phút ở cùng nhiệt độ. Sau khi ủ, PLBs được làm khô nhẹ bằng cách đặt trên giấy thấm và chuyển sang đồng nuôi cấy trên môi trường MS rắn có bổ sung AS ở các nồng độ tương tự như môi trường ủ trong 1, 2, 3, 4 và 5 ngày. Các đĩa petri đồng nuôi cấy được đặt nuôi trong tối ở nhiệt độ 252oC, ẩm độ 505%. Thí nghiệm được tiến hành đồng thời với 3 chủng vi khuẩn Agrobacterium khác nhau: C58, EHA105 và LBA4404. Đánh giá hiệu quả chuyển gen thông qua nhuộm GUS Sau khi đồng nuôi cấy, PLBs được nhuộm GUS với quy trình được cải tiến theo Jeffeson et al. (1987) [5]. Theo đó, PLBs được chuyển vào các eppendorf có chứa thuốc nhuộm GUS, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 72 giờ. Sau đó, loại bỏ thuốc nhuộm, ngâm mẫu với ethanol 70% cho đến khi diệp lục mất hoàn toàn (ít nhất sau 4 giờ). Cuối cùng, đánh giá sự biểu hiện màu của PLBs và chụp ảnh dưới kính hiển vi soi nổi. Khảo sát nồng độ kháng sinh cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn từ PLBs sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn Sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn (chủng LBA4404) 3 ngày, PLBs được rửa 3 lần với nước cất vô trùng và rửa tiếp 1 lần với môi trường MS lỏng có bổ sung kháng sinh cefotaxime nồng độ 0, 300, 500 và 700 mg/l. Sau khi rửa, làm khô nhẹ bề mặt PLBs bằng giấy thấm và đặt nuôi cấy trên môi trường MS rắn có bổ sung cefotaxime ở các nồng độ tương tự như môi trường lỏng. Các đĩa petri đồng nuôi cấy được đặt nuôi ở trong điều kiện ánh sáng 2.500500 lux, nhiệt độ 252oC, độ ẩm 505%. Ghi nhận tình trạng nhiễm khuẩn của mẫu cấy TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 257-265 259 dựa vào sự hiện diện và kích thước của vòng khuẩn bao quanh PLBs. Khảo sát nồng độ kháng sinh hygromycin thích hợp cho việc sàng lọc PLBs sau chuyển gen Các PLBs đơn được nuôi cấy trên môi trường MS rắn có bổ sung kháng sinh hygromycin ở các nồng độ 0, 5, 7, 10 và 15 mg/l. Mẫu cấy được đặt nuôi trong điều kiện ánh sáng 2.500500 lux, nhiệt độ 252oC, ẩm độ 505%. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sự tái sinh PLBs từ lát cắt mỏng đoạn thân lan Dendrobium Sonia in vitro Sau 6 tuần nuôi cấy, trên tất cả 15 môi trường đều có sự hình thành cấu trúc mới từ cát lát cắt mỏng đoạn thân ban đầu. Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể về khả năng tạo PLBs trên các loại môi trường. Trong 5 môi trường có sự hiện diện của BA 0,1 mg/l kết hợp lần lượt với NAA 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l, lát cắt tạo PLBs nhưng PLBs lại có xu hướng tăng trưởng thành chồi (NAA 0,5; 1,0; 2,0 và 3,0 mg/l) (hình 2-a, b, c, d) hay chỉ gia tăng về kích thước (phồng lên) so với ban đầu (NAA 5 mg/l) (hình 2-e). Tương tự, ở các môi trường có sự hiện diện của BA 0,3 mg/l kết hợp lần lượt với NAA 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l, lát cắt chỉ tạo mô sẹo (hình 2-f, g, i, j) hay cụm chồi (hình 2-h). Ở các môi trường có sự hiện diện của BA 0,5 mg/l kết hợp lần lượt với NAA 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l, lát cắt tạo PLBs và tiếp tục nhân lên về số lượng ở trường hợp NAA 0,5 và 1,0 mg/l (hình 2-k, m) trong khi ở 3 trường hợp còn lại (NAA 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l), lát cắt cũng chỉ tạo mô sẹo hay chồi (hình 2-m, n, o). Hình 2. Sự hình thành PLBs từ lát cắt mỏng đoạn thân Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA ở các nồng độ khác nhau a, b, c, d, e: MS bổ sung 0,1 mg/l BA kết hợp lần lượt với 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l NAA; f, g, h, i, j: MS bổ sung 0,3 mg/l BA kết hợp lần lượt với 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l NAA; k, l, m, n, o: MS bổ sung 0,5 mg/l BA kết hợp lần lượt với 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 mg/l NAA. Như vậy, trong 15 loại môi trường được thử nghiệm, môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l kết hợp với NAA 0,5 hay 1,0 mg/l thích hợp nhất cho việc tạo PLBs từ lát cắt mỏng đoạn thân lan Dendrobium Sonia. Các môi trường có tỷ lệ auxin/cytokinin quá cao (từ 4 đến 50 lần) đều không thích hợp cho sự tạo PLBs. Tỷ lệ auxin/cytokinin từ 1 đến 2 lần có lẽ phù hợp nhất cho mục đích tạo PLBs trong nghiên cứu này. Sự tái sinh thành công PLBs từ mô thân là một hướng tiếp cận khá mới, giúp đa dạng hóa nguồn vật liệu phục vụ cho việc thu nhận PLBs. a b c d e f g h i j k l m n o Nguyen Xuan Dung, Duong Hoa Xo, Chu Hoang Ha 260 Sự tăng sinh và phát triển PLBs Dendrobium Sonia in vitro Sau 10 tuần nuôi cấy, ở tất cả các môi trường đều có sự tăng sinh PLBs từ một PLBs ban đầu thành khối với nhiều PLBs. Các môi trường có bổ sung BA và NAA giúp PLBs tăng sinh mạnh hơn so với đối chứng (MS cơ bản). Trong đó, môi trường có bổ sung 0,3 mg/l BA và 1,0 mg/l NAA cho kết quả tốt nhất. Với cùng lượng PLBs được cấy vào (5 PLBs), số lượng và khối lượng PLBs thu được trên môi trường này cao hơn so với các môi trường còn lại (hình 3, bảng 1). Sự hiện diện của auxin đơn lẻ hay kết hợp với cytokinin trong môi trường nuôi cấy là một trong những nhân tố quan trọng nhất đối với sự tăng sinh PLBs. Điều này đã được ghi nhận trong nghiên cứu của Atichart et al. (2007) [1] khi NAA 0,5 mg/l được bổ sung vào môi trường nuôi cấy đã tạo ra sự tăng sinh PLBs cao nhất. Hình 3. Sự tăng sinh PLBs của lan Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA ở các nồng độ khác nhau sau 10 tuần nuôi cấy a: MS; b: MS+0,1 mg/l BA+1,0 mg/l NAA; c: MS+0,3 mg/l BA+1,0 mg/l NAA; d: MS+0,5 mg/l BA+1,0 mg/l NAA Bảng 1. Sự thay đổi trọng lượng PLBs lan Dendrobium Sonia trên các môi trường. Công thức Trọng lượng PLBs (g) MS 1,50±0,15a MS + 0,1 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA 2,34±0,10ab MS + 0,3 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA 8,47±0,29c MS + 0,5 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA 3,15±0,01b *Các giá trị trong cột với chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 0,05. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩn lên khả năng chuyển gen vào PLBs Nhìn chung, cả ba chủng vi khuẩn Agrobacterium được sử dụng trong nghiên cứu này là C58, EHA 105 và LBA 4404 đều có thể thực hiện việc chuyển gen vào PLBs của lan Dendrobium Sonia. Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể về nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy cũng như hiệu quả chuyển gen đối với từng trường hợp. Trường hợp chủng C58 a b c d TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 257-265 261 Ở các thời điểm 1 và 2 ngày đồng nuôi cấy, hầu như không có sự khác biệt về tỷ lệ mẫu dương tính GUS giữa các nồng độ AS, sự khác biệt chỉ xuất hiện sau 3, 4 và 5 ngày. Trong đó, tỷ lệ mẫu dương tính GUS cao nhất (71,67± 2,36) đạt được ở thời điểm 3 ngày với cả hai trường hợp có (100 µM) và không có AS. Thời gian đồng nuôi cấy ngắn (1-2 ngày) cho hiệu quả chuyển gen không ổn định với độ biến động lớn giữa các lần lặp lại (thể hiện ở kết quả có sai số lớn), trong khi đó việc kéo dài thời gian đồng nuôi cấy (4-5 ngày) lại làm giảm hiệu quả chuyển gen (bảng 2). Có lẽ để thực hiện việc chuyển gen vào mô thực vật vi khuẩn cần có một khoảng thời gian chuẩn bị ban đầu trước khi phát huy tối đa hiệu quả của chúng; và sự biểu hiện gen trong mô thực vật bị ảnh hưởng đáng kể do việc nuôi cấy kéo dài dưới áp lực xâm nhiễm của vi khuẩn. Bảng 2. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn Agrobacterium C58 Tỷ lệ mẫu dương tính GUS (%) Nồng độ AS (µM) Số mẫu xử lý chuyển gen 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 0 10 46,67±24,94a 76,67±18,86a 78,33±2,36b 55,42±3,58b 57,22±2,08b 50 10 46,67±24,94a 60,00±8,16a 58,33±2,36a 41,67±6,24ab 41,67±6,24a 100 10 40,00±32,66a 56,67±20,55a 71,67±2,36b 26,67±4,71a 51,67±6,24ab 200 10 53,33±24,94a 61,67±10,80a 60,00±0,00a 43,89±4,37ab 45,00±7,07ab 300 10 33,33±9,43a 41,67±23,92a 63,33±6,24a 50,0±24,49ab 48,33±2,36ab Chú thích: như bảng 1. Trường hợp chủng Agrobacterium EHA105 Tương tự với trường hợp chủng C58, không có sự khác biệt về hiệu quả chuyển gen giữa các nồng độ AS ở thời điểm 1 và 2 ngày đồng nuôi cấy. Ở thời điểm 4 và 5 ngày, có sự khác biệt giữa các nồng độ AS nhưng không rõ ràng, tỷ lệ mẫu dương tính GUS biến động ngẫu nhiên không tuân theo quy luật. Trái lại, ở thời điểm 3 ngày, tỷ lệ mẫu dương tính GUS biến động theo quy luật cụ thể; theo đó việc bổ sung AS ở nồng độ thấp (50 µM) hay quá cao (200-300 µM) đều không tạo ra được sự khác biệt về hiệu quả chuyển gen. Tỷ lệ mẫu dương tính GUS có sự khác biệt và đạt giá trị cao nhất (75,00±4,08) ở nồng độ AS 100 µM (bảng 3). Trường hợp chủng LBA4404 Trái lại, với hai trường hợp trên, ở 4 thời điểm đồng nuôi cấy từ 1 đến 4 ngày đều có sự khác biệt rõ ràng về hiệu quả chuyển gen giữa các nồng độ AS. Tỷ lệ mẫu dương tính GUS tăng dần theo nồng độ AS, đạt giá trị cao nhất ở nồng độ 100 µM (73,33±2,36) và sau đó giảm xuống ở nồng độ 200 µM). Ở thời điểm 5 ngày, tỷ lệ mẫu dương tính GUS mặc dù vẫn có sự khác biệt giữa các nồng độ AS nhưng lại biến thiên ngẫu nhiên không theo quy luật. Ở cùng nồng độ AS 100 µM, tỷ lệ này tăng dần theo thời gian đồng nuôi cấy, đạt giá trị cao nhất ở thời điểm 4 ngày và giảm xuống sau 5 ngày (bảng 4). Bảng 3. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn Agrobacterium EHA105 Tỷ lệ mẫu dương tính GUS (%) Nồng độ AS (µM) Số mẫu xử lý chuyển gen 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 0 10 53,33±9,43a 60,00±0,00a 51,67±2,36a 51,67±8,50a 46,67±12,47b 50 10 36,67±12,47a 58,33±2,36a 50,00±8,16a 70,00±4,08b 31,67±2,36ab 100 10 60,00±28,28a 68,33±8,50a 75,00±4,08b 60,00±8,16ab 36,67±12,47ab 200 10 53,33±41,10a 56,67±2,36a 46,67±4,71a 54,17±8,25ab 53,33±9,43b 300 10 26,67±9,43a 68,33±8,50a 44,44±4,16a 54,44±4,16ab 20,00±0,00a Chú thích: như bảng 1, 2. Nguyen Xuan Dung, Duong Hoa Xo, Chu Hoang Ha 262 Bảng 4: Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA4404 Tỷ lệ mẫu dương tính GUS (%) Nồng độ AS (µM) Số mẫu xử lý chuyển gen 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 0 10 20,00±16,33a 43,33±4,71a 33,33±9,43a 20,00±0,00a 00,00±0,00a 50 10 40,00±0,00ab 50,00±8,16ab 58,67±1,98bc 61,11±6,85c 13,33±9,43a 100 10 56,67±4,71b 67,78±11,00b 69,33±15,08c 73,33±2,36d 23,33±17,0ab 200 10 36,67±4,71ab 63,33±12,47ab 35,57±6,27a 49,30±8,45c 46,67±18,86b 300 10 40,0±14,14ab 55,00±4,08ab 46,67±4,71ab 36,67±4,71b 0,00±0,00a Chú thích: như bảng 1. Về mức độ biểu hiện gen GUS Mức độ biểu hiện gen GUS được thể hiện thông qua mức độ màu (xanh chàm) xuất hiện trên mẫu. Các mẫu chuyển gen thành công ở cả 3 trường hợp đều xuất hiện màu xanh khác biệt so với đối chứng không chuyển gen với 3 mức độ khác nhau: biểu hiện rải rác, biểu hiện thành mảng hay biểu hiện trên toàn bộ mẫu (hình 4). Hình 4. Các mức độ biểu hiện gen GUS của mẫu (PLBs) chuyển gen a. Đối chứng không chuyển gen; b. biểu hiện rải rác; c. biểu hiện thành mảng; d. biểu hiện trên toàn bộ mẫu. Các kết quả trên cho thấy, cả 3 chủng vi khuẩn được thử nghiệm đều có khả năng chuyển gen vào PLBs. Nồng độ chất cảm ứng AS thích hợp cho chuyển gen là 100 µM, tương tự với nồng độ Men et al. (2003) [8] đã sử dụng để chuyển gen trên lan Dendrobium nobile và thấp hơn nhiều so với nồng độ (200 µM) mà Atichart et al. (2007) [1] đã sử dụng trên lan Dendrobium a b c d TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 257-265 263 secundum. Thời gian đồng nuôi cấy thích hợp là 3 ngày (C58 và EHA105) hay 4 ngày (LBA4404), phù hợp với nghiên cứu của Men et al. (2003) [8], Atichart et al. (2007) [1] và Bunnag & Pilahome (2012) [2]. Hiệu quả chuyển gen tối ưu lần lượt cho 3 trường hợp đều vượt trên 70%, cao hơn nhiều so với các nghiên cứu trước đó với hiệu quả chuyển gen chỉ dao động từ 18-60%. Như vậy, trái với những lo lắng ban đầu về khả năng sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho việc chuyển gen trên loại cây một lá mầm như hoa lan, kết quả này một lần nữa cho thấy điều hoàn toàn ngược lại. Hiệu quả diệt khuẩn của cefotaxime trên PLBs Sau 7 ngày nuôi cấy, khả năng diệt khuẩn tăng dần theo sự gia tăng nồng độ cefotaxime và đạt hiệu quả cao nhất ở nồng độ cefotaxime 700 mg/l, trong khi tỷ lệ mẫu sống không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ cefotaxime. Ở thời điểm 14 ngày nuôi cấy, khả năng diệt khuẩn đạt mức tối đa ở tất cả các trường hợp có cefotaxime. Tuy nhiên, tỷ lệ sống của PLBs có sự khác biệt đáng kể giữa các nồng độ cefotaxime. Tỷ lệ PLBs sống đạt cao nhất ở nồng độ 300 mg/l, sau đó giảm dần và đạt giá trị thấp nhất ở nồng độ 700 mg/l (bảng 5). Bảng 5. Hiệu quả diệt khuẩn của cefotaxime ở các nồng độ khác nhau trên PLBs Thời gian nuôi cấy (ngày) 7 14 Nồng độ cefotaxime (mg/l) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tình trạng nhiễm khuẩn Tỷ lệ mẫu sống (%) Tình trạng nhiễm khuẩn 0 100,00a±0,00 +++ 100,00c ±0,00 +++ 300 93,30a ±11,50 ++ 80,00c±0,00 - 500 86,70a ±11,50 + 40,00b±34,6 - 700 80,00a ±34,60 - 0,00a±0,00 - *Các giá trị trong cột với chữ cái khác nhau biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 0,05. Các kí hiệu “+”: mức độ nhiễm khuẩn của PLBs và “-”: sạch khuẩn. Trong thí nghiệm chuyển gen, để loại hoàn toàn vi khuẩn Agrobacterium, cần có một nồng độ cefotaxime vừa có khả năng diệt khuẩn vừa đảm bảo được sức sống của mô. Cả 3 nồng độ cefotaxime được thử nghiệm đều có khả năng diệt khuẩn sau 14 ngày. Tuy nhiên, xét trên tỷ lệ sống của PLBs, nồng độ 300 mg/l thích hợp nhất cho việc diệt khuẩn. Cefotaxime 250 mg/l đã được Men et al. (2003) [8] sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen ở lan Dendrobium nobile. Nồng độ này tương đối gần với mức 300 mg/l trong nghiên cứu này. Hiệu quả gây chết PLBs của hygromycin Sau 7 ngày nuôi cấy, ở cả 4 nồng độ hygromycin 5, 7, 10 và 15 mg/l và đối chứng 0 mg/l đều không có PLBs chết. Tuy nhiên, đến thời điểm 14 ngày nuôi cấy, PLBs bắt đầu chết ở tất cả các trường hợp có hygromycin. Tỷ lệ mẫu chết khá thấp (13,33%) ở nồng độ hygromycin 5 mg/l nhưng lại rất cao ở các nồng độ hygromycin 7, 10 và 15 mg/l (90%). Ở thời điểm 28 ngày nuôi cấy, tỷ lệ mẫu chết tiếp tục tăng lên và đạt giá trị 26,67% ở nồng độ hygromycin 5 mg/l trong khi ở các nồng độ hygromycin còn lại 7, 10 và 15 mg/l tỷ lệ này đều đạt giá trị 100% (bảng 6). Như vậy, nồng độ hygromycin từ 7 đến 15 mg/l thích hợp nhất cho mục tiêu chọn lọc PLBs chuyển gen. Nồng độ hygromycin này thấp hơn nhiều so với nồng độ 25-30 mg/l đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác trên lan Dendrobium [1, 2, 8]. Nguyen Xuan Dung, Duong Hoa Xo, Chu Hoang Ha 264 Bảng 6. Hiệu quả gây chết của hygromycin đối với PLBs theo thời gian nuôi cấy Tỷ lệ mẫu chết theo thời gian (%) Nồng độ hygromycin (mg/l) 7 ngày 14 ngày 28 ngày 0 0,00±0,00 0,00a ±0,00 0,00a ±0,00 5 0,00±0,00 13,33a±11,55 26,67b±11,55 7 0,00±0,00 86,67b±0,00 100,00c±0,00 10 0,00±0,00 88,89b±7,70 100,00c±0,00 15 0,00±0,00 90,00b±10,00 100,00c±0,00 Chú thích: như bảng 1. KẾT LUẬN Sự tái sinh tạo PLBs từ lát cắt đoạn thân lan lan Dendrobium Sonia xảy ra tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA và 1,0 mg/l NAA. Các PLBs tạo ra tăng sinh tốt nhất trên trường MS bổ sung 0,3 mg/l BA và 1,0 mg/l NAA. Sự chuyển gen vào PLBs lan Dendrobium Sonia xảy ra tốt nhất ở nồng độ AS 100 µM, thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày đối với chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 và Agrobacterium tumefaciens EHA105 hay 4 ngày đối với chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Quá trình chuyển gen vào PLBs lan Dendrobium Sonia có thể được thực hiện với cả 3 chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404, EHA105 và C58, với hiệu quả chuyển gen trên 70%. Cefotaxime ở nồng độ 300 mg/l thích hợp cho việc loại khuẩn sau lây nhiễm và hygromycin ở nồng độ từ 7 đến 15 mg/l thích hợp cho việc sàng lọc PLBs chuyển gen. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Atichart P., Bunnag S., Piyada T., 2007. Agrobacterium - mediated transformation of Dendrobium secundum (B. L.) Lindl with antisense ACC oxidase. Asian J. Plant Sci., 6(7): 1065-1071. 2. Bunnag S., Pilahome W., 2012. Agrobacterium-mediated transformation of Dendrobium chrysotoxum Lindl. Afr. J. Biotechnol., 11(10): 2472-2476. 3. Chang C., Chen Y. C., Hsu Y. H., Wu J. T., Hu C. C., Chang W. C., Lin N. S., 2005. Transgenic resistance to Cymbidium mosaic virus in Dendrobium expressing the viral capsid protein gene. Transgenic Res., 14: 41-46. 4. Chin D. P., Mishiba K., Mii M., 2007. Agrobacterium - mediated transformation of protocorm-like bodies in Cymbidium. Plant Cell Rep., 26: 735-743. 5. Jefferson R. A., 1987. Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system. Experimental protocols. Plant Mol. Biol. Rep., 5(4): 387-405. 6. Julkifle A. L., Rathinam X., Sinniah U. R. and Subramaniam S., 2010. Optimisation of transient green fluorescent protein (GFP) gene expression in Phalaenopsis violacea orchid mediated by Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation system. Aust. J. Bas. App. Sci., 4(8): 3424- 3432. 7. Liau C. H., You S. J., Prasad V., Hsiao H. H., Lu J. C., Yang N. S., Chan M. T., 2003. Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of an Oncidium orchid. Plant Cell Rep., 21: 993-998. 8. Men S., Ming X., Liu R., Wei C., Li Y., 2003. Agrobacterium - mediated genetic transformation of a Dendrobium orchid. Plant Cell Tiss. Org., 75: 63-71. 9. Mishiba K., Chin D. P., Mii M., 2005. Agrobacterium - mediated transformation of Phalaenopsis by targeting protocorms at an early stage affter germinatia. Plant Cell Rep., 24: 297-303. 10. Murashige T., Skoog, 1962. Agrobacterium revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures. Plant Physiol. 15: 473-497. TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 257-265 265 11. Raffeiner B., Serek M., Winkelmann T., 2009. Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of Oncidium and Odontoglossum orchid species with the ethylene receptor mutant gene etr1-1. Plant Cell Tiss. Org., 98: 125-134. 12. Shrestha B. R., Chin D. P., Tokuhara K., Mii M., 2010. Agrobacterium - mediate transformation of Vanda using PLB-like bodies. Aspac J. Mol. Biol. Biotechnol., 18(1): 225-228. 13. Sjahril1 R., Chin D. P., Khan R. S., Yamamura S., Nakamura I., Amemiya Y., Mii M., 2006. Transgenic Phalaenopsis plants with resistance to Erwinia carotovora produced by introducing wasabi defensin gene using Agrobacterium method. Plant Biotechnol., 23: 191-194. 14. Yang S. H., Yu H., Goh C. J., 2003. Functional characterisation of a cytokinin oxidase gene DSCKX1 in Dendrobium orchid. Plant Mol. Biol., 51: 237-248. 15. Yu H., Yang S. H., Goh C. J., 2001. Agrobacterium - mediated transformation of a Dendrobium orchid with the class 1 knox gene DOH1. Plant Cell Rep., 20: 301-305. 16. Zhang L., Chin D. P., Mii M., 2010. Agrobacterium - mediated transformation of protocorm-like bodies in Cattleya. Plant Cell Tiss. Org., 103: 41-47. OPTIMIZATION OF GENETIC TRANSFORMATION OF ORCHID (Dendrobium Sonia) MEDIATED BY Agrobacterium tumefaciens Nguyen Xuan Dung1, Duong Hoa Xo1, Chu Hoang Ha2 1Biotechnology Center of Ho Chi Minh City 2Isntitute of Biotechnology, VAST SUMMARY Dendrobium Sonia is a popular orchid and used for many purposes in Vietnam. In this study, the transformation is set on protocorm like bodies (PLBs) mediated by Agrobacterium tumefaciens containing vector with GUS gene and kanamycin resistance gene. The main factors influencing the transformation including medium for regeneration and growth of PLBs, acetosyringone (AS) concentration, the co- cultivation time, Agrobacterium strain, bactericidal antibiotic concentrations and screening of transformed PLBs were surveyed. Results showed that MS medium supplemented with 1.0 mg/l NAA in combination with 0.5 mg/l or 0.3 mg/l BA was suitable for PLBs regeneration from stem tissue slices. The highest transformation efficiency (percentage of PLBs with GUS gene expression) was obtained when PLBs were infected and co-cultivated with Agrobacterium on the medium containing 100 µM AS for 3 days (with strain EHA105 and C58) or 4 days (with strain LBA4404). Medium containing 300 mg/l cefotaxime and 7-15 mg/l hygromycin was suitable for the disinfection and screening of transformed PLBs. Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Dendrobium Sonia, genetic transformation, orchird. Ngày nhận bài: 15-7-2013