Chọn dòng và biểu hiện gen keratinase trong escherichia Coli BL21(DE3) từ vi khuẩn bacillus - Nguyễn Thu Hiền

SUMMARY B. licheniformis and B. subtilis are capable to produce enzyme, which hydrolyzed feather highly. Keratinase is a group of commercial enzyme, that has many important applications in industries of waste management, leather, food. Hydrolyzed keratin is used to create some rare amino acids, such as, serine, cysteine and proline or used as animal feed, fertilizer, glue that contribute to reducing environmental pollution. We carried out cloning and expression of recombinant keratinase from Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis in Escherichia coli BL21(DE3). Ker 1 from the strain B. licheniformis HT10 was integrated into pET22b vector and Ker 2 from B. subtilis Đ.nd1.2 was integrated into the pET32a vector. In the same expression conditions at 37°C, the 1mM IPTG, two obtained proteins showed a differ in size and activity of the enzyme respectively is 28 kDa, 23.5 U/ml and 36 kDa, 18.5 U/ml.

pdf7 trang | Chia sẻ: thucuc2301 | Lượt xem: 507 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Chọn dòng và biểu hiện gen keratinase trong escherichia Coli BL21(DE3) từ vi khuẩn bacillus - Nguyễn Thu Hiền, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 51-57 51 CHỌN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN KERATINASE TRONG ESCHERICHIA COLI BL21(DE3) TỪ VI KHUẨN BACILLUS Nguyễn Thu Hiền1, Hoàng Thị Thu Hiền1, Khuất Hữu Thanh2, Nguyễn Huy Hoàng1* 1Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *nhhoang@igr.ac.vn 2Trường Đại học Bách khoa Hà Nội TÓM TẮT: Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis là hai chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân lông vũ cao. Protein keratinase từ hai chủng này đã được nghiên cứu khá phổ biến, đây là nhóm enzyme thương mại, có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong các quá trình công nghệ sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin từ ngành công nghiệp gia cầm và công nghệ da. Mặt khác, keratin sau khi bị thủy phân có thể làm thức ăn chăn nuôi, phân bón, keo, tạo ra được các axit amin hiếm như serine, cystein và proline và góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Nhằm mục đích thu được lượng enzyme có hoạt tính cao, chúng tôi tiến hành biểu hiện gen keratinase tái tổ hợp từ B. licheniformis và B. subtilis trong Escherichia coli. Gen Ker 1 từ chủng B. licheniformis HT10 được tích hợp vào vector pET22b và gen Ker 2 từ B. subtilis Đ.nđ1.2 được tích hợp vào vector pET32a. Trong cùng điều kiện biểu hiện ở 37oC, cảm ứng IPTG nồng độ 1mM, hai protein thu được có kích thước và hoạt độ enzyme khác nhau lần lượt là 28 kDa, 23,5 U/ml và 36 kDa, 18,5 U/ml. Từ khóa: Bacillus lichenniformis, Bacillus subtilis, E. coli, biểu hiện gen, keratinase. MỞ ĐẦU Keratin là thành phần chủ yếu trong lông vũ, là protein cấu trúc sợi, giàu liên kết disulfide, hydro và các đầu tương tác kị nước dẫn đến độ bền cơ học cao. Theo Lin et al. (2009) [6], keratin không hòa tan trong nước và không phân hủy bởi các enzyme phân giải protein phổ biến như trypsin, pepsin và papain. Nhưng keratin có thể bị phân hủy bởi các vi sinh vật có khả năng sinh keratinase cao. Hiện nay, keratinase được thu từ nhiều nguồn khác nhau như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn. Trong nhóm vi khuẩn có khả năng sinh keratinase, hoạt tính keratinase cao đã được ghi nhận rộng rãi đối với các chủng từ Bacillus. Keratinase có đặc tính sinh hóa rất đa dạng khi được thu từ các nguồn khác nhau. Mặc dù chỉ phân lập trong phạm vi hai chủng vi khuẩn B. licheniformis và B. subtilis nhưng cũng cho ta thấy sự đa dạng của keratinase. Đối với B. licheniformis, theo nghiên cứu của Lin et al. (1992) [7], keratinase có khối lượng phân tử 33 kDa, pH tối ưu đã được xác định 7.5, nhiệt độ tối ưu là 50°C và ổn định khi bảo quản ở -20°C. Đối với chủng B. subtilis, keratinase có khối lượng phân tử là 25,4 kDa, pH tối ưu là 7,5 và nhiệt độ tối ưu là 70°C theo công bố của Gupta & Ramnani (2006) [2]. Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng keratinase được phân lập từ chủng B. licheniformis và B. subtilis, là thành viên của nhóm protease serine, điều này đã được đề cập đến trong công bố của Brandelli (2008) [1]. Đây là nhóm enzyme thương mại, có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong các quá trình công nghệ sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin từ ngành công nghiệp gia cầm và công nghệ da. Mặt khác keratin sau khi bị thủy phân có thể làm thức ăn chăn nuôi, phân bón, keo, tạo ra các axit amin hiếm như serine, cystein và proline, làm giảm ô nhiễm môi trường [9]. Do tầm quan trọng của keratinase trong các ngành công nghiệp, keratinase đã được nghiên cứu khá nhiều. Nhưng để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của keratinase trong ứng dụng công nghiệp, những nghiên cứu tập trung vào việc nâng cao năng suất và hoạt tính keratinase thông qua nhân bản gen và biểu hiện keratinase tái tổ hợp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nhân đoạn gen mã hóa keratinase bằng phản ứng PCR từ 2 chủng vi khuẩn B. licheniformis và B. subtilis, chọn dòng trong hệ vector pET và biểu hiện trong vi khuẩn E. coli. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Nguyen Thu Hien, Hoang Thi Thu Hien, Khuat Huu Thanh, Nguyen Huy Hoang 52 B. licheniformis HT10, B. subtilis Đnđ1.2 (mã số FN692035.1) đã được phân lập từ vùng đất chăn nuôi và giết mổ gia cầm tại Hà Nội đã được công bố bởi Nguyễn Huy Hoàng và nnk. (2010) [4]. Phương pháp Chọn dòng gen keratinase Khuếch đại đoạn gen Ker Trình tự mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen Ker được thiết kế bằng cách phân tích độ tương đồng nucleotide từ đoạn gen keratinase của chủng B. subtillis và B. licheniformis đã được đăng kí trên Gen Bank (bảng 1). Theo phương pháp của Nguyễn Thị Minh và nnk. (2011) [8], đoạn mồi được gắn thêm trình tự các enzyme giới hạn để khuếch đại được đoạn gen Ker từ điểm khởi đầu đến điểm kết thúc. Bảng 1. Trình tự các cặp mồi Chủng Mồi Trình tự mồi (chiều 5’ đến 3’) ker-F1 5’-TCCATGGATGATGAGGAAAAAGAGTTTTGGC-3’ Nco I B. licheniformis HT10 - Gen Ker1 ker-R1 5’-TGGATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCG-3’ BamHI ker-F2 5’-CGTGGGATCCAAAAAATTGTGGATCAGC-3’ BamHI B. subtilis Đnđ1.2 - Gen Ker2 ker-R2 5’-TTATTCTCGAGCTGCTTGTACGTTGAT-3’ XhoI Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích là 50 µl bao gồm 1X Dream Taq Buffer, 10 mmol/L dNTP, 10 pmol mỗi mồi, 100 ng DNA khuôn và 2U Dream Taq polymerase. Chu trình nhiệt: 95oC: 3 phút; (95oC: 1 phút; 60oC: 1 phút; 72oC: 3 phút) 30 chu kỳ; 72oC: 10 phút, giữ mẫu ở 4oC. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và được tinh sạch bằng bộ kit GeneJETTM Gel Extration của Fermentas. Tách dòng phân tích trình tự gen Ker Sản phẩm gen Ker được khuếch đại từ phản ứng PCR sau khi tinh sạch được gắn vào vector chọn dòng. Gen Ker1 được gắn vào vector pCR2.1 (TA cloning Kit, Invitrogen). Gen Ker2 được gắn vào vector pJET1.2/blunt (CloneJET™ PCR Cloning Kit-Thermo Scientific). Các phản ứng được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tiến hành biến nạp sản phẩm ligase vào tế bào khả biến E. coli Top10 trên đĩa môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc để chọn lựa được tế bào mang vector tái tổ hợp. Để kiểm tra kết quả của phản ứng ligase, các khuẩn lạc được chọn lọc và tách plasmid sau đó được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn. Biểu hiện gen keratinase trong vi khuẩn E. coli Thiết kế vector biểu hiện trong E. coli Xử lý vector pCR2.1-Ker1 và vector pET22b(+) bằng 2 enzyme NcoI và BamHI. Vector pJET1.2-Ker2 và pET32a(+) được xử lý bằng 2 enzyme BamHI và XhoI. Sản phẩm cắt sau khi tinh sạch được gắn vào vector tương ứng bằng enzyme T4 ligase ở 16oC, qua đêm. Biến nạp sản phẩm ligase vào tế bào khả biến E. coli Top 10. Thu nhận các khuẩn lạc mọc được trên đĩa môi trường có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicillin nồng độ 100 µg/ml để tách plasmid. Cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn để kiểm tra kích thước của đoạn gen và vector. Biểu hiện gen Ker1 và Ker2 tái tổ hợp Plasmid mang vector tái tổ hợp pET22b- Ker1 và pET32c-Ker2 được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 bằng phương pháp sốc nhiệt. Khuẩn lạc sinh trưởng được trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicillin nồng độ 100 µg/ml được lựa chọn. Nuôi cấy tế bào E. coli BL21 mang vector tái tổ hợp được nuôi trong 3 ml môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, qua đêm, điều kiện 200 vòng/phút, 37oC. Tiếp giống với tỉ lệ 1/50 thể tích trong 50 ml môi trường LB, ampicillin. IPTG nồng độ 1mM được bổ sung vào khi OD600nm dịch nuôi đạt 0,8. Sau 4 giờ TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 51-57 53 nuôi cấy, tế bào được thu sinh khối bằng phương pháp ly tâm. Cặn tế bào được hòa tan trong PBS pH 7 và bị xử lý bằng phương pháp siêu âm. Sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để thu lại lượng protein hòa tan, điện di trên gel polyacrylamid 12% được biến tính ở 95oC trong 10 phút. Thử hoạt tính keratinase Hoạt tính của keratinase tái tổ hợp được đo theo phương pháp của Riffel et al. (2003) và Zhang et al. (2009) [11, 17]. Chủng E. coli BL21 (DE3) được lên men trong điều kiện ở 37oC, tốc độ lắc 220 vòng/phút và cảm ứng IPTG với nồng độ cuối cùng 1 mM, dừng lên men sau 4 giờ từ khi cảm ứng. Tế bào được thu bằng ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC; sinh khối được hòa tan bằng đệm PBS, siêu âm phá vỡ tế bào ở tần số 22Hz với chu kỳ 15 giây phá, dừng 10 giây trong thời gian 2 phút ở 2-4oC. Dịch sau siêu âm được ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, được sử dụng như enzyme. Phản ứng enzyme, cơ chất diễn ra trong môi trường đệm glycine/NaOH ở 60°C, 15 phút. Kết quả được đo ở bước sóng 440 nm. Trong đó, cứ 0,01 giá trị hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 440 nm tương ứng với 1U hoạt tính enzyme. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nhân dòng gen keratinase từ chủng B. licheniformis HT10, B. subtilis Đnđ1.2 Gen Ker1 đã được nhân lên từ DNA tổng số của chủng B. licheniformis HT10. Dựa trên trình tự gen ker mã hóa cho protease serin kiềm của các B. licheniformis được đăng kí trên GenBank có kích thước khoảng 1,2 kb (hình 1). Tương tự, đoạn gen Ker 2 cũng được nhân lên từ DNA tổng số của chủng B. subtillis Đ.nđ1.2. Đoạn gen Ker2 cũng có chiều dài khoảng 1,2 kb. Kết quả PCR trên gel điện di cho thấy một đoạn băng đặc hiệu đúng theo kích thước mong đợi (hình 1). Sản phẩm PCR được tinh sạch và được gắn vào vector chọn dòng, Ker1 được gắn vào vector pCR2.1, Ker2 được gắn vào vector pJET1.2. Sau đó, toàn bộ sản phẩm ligase được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli Top10. Trong quá trình sinh trưởng của E. coli, plasmid được nhân lên với số lượng lớn. Để chọn ra đúng các plasmid mang gen Ker, các dòng tế bào E. coli tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh và tách chiết plasmid để kiểm tra sự có mặt của gen ker trong plasmid. Các plasmid có kích thước cao hơn so với đối chứng là vector chọn dòng không mang gen được chọn và kiểm tra tiếp bằng phản ứng cắt enzyme. Plasmid Ker1-pCR21 được xử lý bằng hai enzyme NcoI và BamHI, Ker2-pJET12 được xử lý bằng hai enzyme XhoI và BamHI. Kết quả điện cho thấy có một băng có kích thước đúng bằng kích thước của vector, băng còn lại có kích thước bằng kích thước của đoạn gen được chèn vào (không đưa hình ảnh). Hình 1. Sản phẩm PCR gen keratinase M. Thang DNA chuẩn; 1. Gen Ker1 từ chủng B. licheniformis HT10; 2. Gen Ker2 từ chủng B. subtillis Đ.nđ1.2. Phân tích trình tự gen Ker1, Ker2 Gen Ker1, Ker2 được tiến hành giải trình tự gen và được phân tích trên phần mềm BioEdit. Toàn bộ trình tự gen Ker1 dài 1146 bp mã hóa cho protein gồm 381 axit amin. Khi so sánh các trình tự nucleotid của gen Ker1 của chủng B. licheniformis HT10 với các trình tự của các gen keratinase khác được tách ra từ các chủng vi khuẩn B. licheniformis đăng kí trên GenBank, trình tự nucleotid của keratin từ chủng B. licheniformis HT10 có độ tương đồng cao về trình tự nucleotid (97-99%). Đặc biệt, nucleotid của gen keratinase trong nghiên cứu có độ tương đồng tới 99,56% với trình tự của gen keratinase có mã số truy cập QG339614. Đoạn gen Ker2 có chiều dài 1138 bp, mã hóa 378 axit amin. Kết quả so sánh trên Gen Bank, trình tự Ker 2 có độ tương đồng cao với Nguyen Thu Hien, Hoang Thi Thu Hien, Khuat Huu Thanh, Nguyen Huy Hoang 54 nhiều gen keratinase từ các chủng B. subtilis khác được công bố. Ker2 có độ tương đồng đến 99% với gen keratinase chủng B. subtilis strain YYW-1KerC có mã số truy cập EU362730. Từ các kết quả so sánh về trình tự nucleotid và trình tự acid amin có thể thấy, gen Ker1 chúng tôi phân lập được từ chủng B. licheniformis HT10 và gen Ker2 từ chủng Đ.nđ1.2 là gen mã hóa cho keratinase thuộc nhóm subtilisin. Thiết kế vector biểu hiện trong E.coli BL21 (DE3) Hình 2. Cắt kiểm tra sản phẩm tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn 1. Thang DNA chuẩn; 2. Ker2-pET32 được xử lý bằng XhoI và BamHI; 3. Thang DNA chuẩn; 4. Ker1-pET22 được xử lý bằng NcoI và BamHI Gen Ker1 được thu hồi từ sản phẩm lai tách dòng Ker1- pCR2.1 bằng 2 enzyme cắt giới hạn NcoI và BamHI, sản phẩm lai Ker2-pJET12 được xử lý bằng XhoI và BamHI để thu nhận gen Ker2. Gắn gen Ker1 vào vector pET22b và gen Ker2 vào pET32a tại hai vị trí cắt tương ứng để tạo vector biểu hiện trong E. coli. Phản ứng ghép nối được thực hiện ở 16oC qua đêm. Trong vector biểu hiện này, vùng nhân bản có sẵn điểm His•Tag® và S•Tag™ phục vụ cho việc nhận biết và tinh sạch các protein. Sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21(DE3) và chọn lựa những dòng tế bào có kích thước plasmid lớn hơn pET22b và pET32a. Xử lý đồng thời các dòng plasmid này với enzyme giới hạn tương ứng để chọn lựa chính xác dòng tế bào mang gen Ker1 và Ker 2 (hình 2). Kết quả điện chứng tỏ, vector tái tổ hợp pET 22b-Ker1 và pET32a-Ker2 đã được thiết kế và biến nạp thành công vào chủng E. coli BL21 (DE3). Biểu hiện gen Ker1, Ker2 trong E. coli BL21(DE3) Trong nghiên cứu biểu hiện đã sử dụng chủng chủ là E. coli BL21(DE3), đây là chủng chứa đột biến Ion protease (protease nội bào) và ompT protease (protease màng ngoài tế bào). Vì vậy, E. coli BL21(DE3) có ưu điểm là hạn chế sự phân cắt của protease đối với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân hủy và ổn định hơn sau khi tổng hợp. Ngoài ra, DNA hệ gen của E. coli BL21(DE3) có chứa gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, có nguồn gốc từ bacteriophage T7. Gen này được đưa vào hệ gen của chủng E. coli BL21(DE3) và đặt dưới sự điều khiển của promoter lac. T7 RNA polymerase là enzyme hoạt động mạnh, có khả năng sao chép hoàn toàn bất kỳ trình tự DNA nào đặt dưới sự kiểm soát của T7 promoter . Protein tái tổ hợp trong E. coli có thể tồn tại ở dạng thể vùi hoặc thể hòa tan. Hai trong những yếu tố quan trọng nhất trong việc biểu hiện một protein ngoại lai trong E. coli là nhiệt độ và nồng độ IPTG. Các yếu tố khác như nếp gấp nội bào protein, hoạt động protease nội sinh, tốc độ sinh trưởng của tế bào cũng có thể ảnh hưởng đến mức độ biệu hiện, điều này đã được đề cập đến trong công bố của Sambrook & Michal (1989) [13]. Theo Lin et al. (2009) [6], các vấn đề như khả năng biểu hiện thấp hoặc sự hình thành thể vùi thường gây ra bởi yếu tố kị nước được quy định bởi trình tự amino acid mang tín hiệu kỵ nước đầu N của phân tử protein mới được tổng hợp. Để đạt được mức độ biểu hiện cao nhất, các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp hợp pET 22b-Ker1 và pET32a-Ker2 được nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ, nồng độ IPTG, thời gian biểu hiện khác nhau. Qua các kết quả nghiên cứu, chủng E. coli mang gen Ker tái tổ hợp biểu hiện tốt nhất ở điều kiện 200 vòng/phút, 37oC, nồng độ IPTG 1mM. Protein ngoại lại được thu hồi sau 4 giờ cảm ứng và điện di trên gel SDS 12,5% (hình 3). Vì keratinase tái tổ hợp này có thể được thể hiện trong tế bào chất của vi khuẩn E. coli theo TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 51-57 55 nghiên cứu của Lin et al. (2009) [6], nên chúng tôi tập trung thu hồi protein ở dạng hòa tan. Kết quả điện di cho thấy, mẫu protein được cảm ứng xuất hiện một băng đậm hơn hẳn so với mẫu không cảm ứng (hình 3). Với dòng tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pET22b-Ker1, khi cảm ứng IPTG, protein tái tổ hợp được tổng hợp có kích thước khoảng 28 kDa (giếng 3). Dòng tế bào E. coli mang vector pET32a-Ker2 tổng hợp được protein ngoại lai có kích thước khoảng 36 kDa (giếng 6). Hình 3. Điện di protein trên gel polyacrylamide -SDS ở nồng độ 12,5% Giếng 1: Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3) [pET22b]; Giếng 2: Thang protein chuẩn (14-116 kDa); Giếng 3 Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3) [pET22b-Ker1] được cảm ứng bởi 1 mM IPTG; Giếng 4: Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3) [pET22b-Ker1] không cảm ứng IPTG; Giếng 5: Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3) [pET32a - Ker2] không cảm ứng IPTG; Giếng 6: Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3) [pET32a -Ker2] được cảm ứng bởi 1 mM IPTG. Theo các nghiên cứu về biểu hiện gen keratinase của Gupta & Ramnami (2006) [2], kích thước protein tạo ra có sự khác nhau tùy theo nguồn gốc của gen và hệ vector biểu hiện. Khối lượng phân tử của keratinase khoảng 18- 200 kDa, ngoại trừ một enzyme đặt biệt từ một loại nấm gây bệnh. Đối với gen keratinase từ chủng B. licheniformis, đã có nhiều nghiên cứu thành công trong việc biểu hiện gen này ở cả E. coli và tế bào nấm men Pichia đã được công bố bởi Radha & Gunasekaran (2009) và Hu et al. (2013) [10, 5]. Kích thước keratinase từ chủng B. licheniformis khoảng 33 kDa. Tuy nhiên, theo Hu et al. (2013) [5] khi biểu hiện gen này với vector pET30a và pET32a trong E. coli lại có kích thước 45 kDa và 55 kDa. Trong nghiên cứu Radha & Gunasekaran (2009) [10], khi biểu hiện gen này trong nấm men P. pastoris lại có kích thước khoảng 39 kDa. Gen keratinase được phân lập từ chủng B. licheniformis HT10, khi biểu hiện với vector pET22b trong E. coli, chỉ có kích thước khoảng 28 kDa, kích thước protein thu được nhỏ hơn nhiều so với các kích thước đã được công bố. Chủng B. subtilis là một trong những chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân lông vũ cao nhất và là nguồn nguyên liệu gen keratinase rất phổ biến trong nghiên cứu. Kích thước của protein keratinase từ chủng này cũng có sự khác nhau trong các công bố trước đây của Suh & Lee (2001) [14] là 25,4 kDa, kích thước này nhỏ hơn kích thước 32 kDa được công bố bởi Tork et al. (2013) [16], nhưng cao hơn với kích thước 22 kDa đã được công bố bởi Nguyễn Văn Hiếu và nnk. (2010) [3]. Protein từ chủng B. subtilis Đ.nđ1.2 trong nghiên cứu của chúng tôi khi biểu hiện với vector pET32a trong E. coli lại có kích thước cao hơn, khoảng 36 kDa. Vì vậy, kích thước protein keratinase tái tổ hợp có sự chênh lệch có thể do hiện tượng cắt ngắn hoặc biến đổi trong quá trình hoàn chỉnh protein trước khi ra khỏi tế bào. Hoạt tính keratinase tái tổ hợp Hoạt độ keratinase của chủng E. coli tái tổ hợp được xác định bằng phản ứng thủy phân cơ chất azokeratin, đây là một cơ chất đặc hiệu được sử dụng để đo hoạt tính của enzyme keratinase và đã được Riffel et al. (2003) và Zhang et al. (2009) [12, 17] sử dụng. Trong phương pháp này một đơn vị hoạt động của enzyme được tính bằng lượng enzyme gây ra sự thay đổi hấp thụ của 0,01 giá trị OD ở bước sóng 440nm. Dịch enzyme được thu từ dịch sau sau biểu hiện của tế bào E. coli mang gen tái tổ hợp pET22(+)-ker1 và pET32(+)-ker2 được sử dụng như enzyme (bảng 2). So với nghiên cứu của Radha & Gunasekaran (2007) [9], Tiwary & Gupta (2010) [15] kết quả hoạt độ enzyme khá cao khoảng trên 70 U/ml, kết quả của chúng tôi có sự chênh lệch khá lớn. Các nghiên cứu về keratinase cho thấy, khả năng biểu hiện của gen này có thể bị ức chế bởi Cd2+, Cu2+, Hg2+, Ni2+, Nguyen Thu Hien, Hoang Thi Thu Hien, Khuat Huu Thanh, Nguyen Huy Hoang 56 Fe3+, ethylene glycoltetraacetic acid, ethylenediaminetetraacetic acid và pchloromercuribenzoate. Nhưng enzyme lại được kích hoạt bởi Ba2+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, dithiothreitol, glutathione, và β- mercaptoethanol điều này đã được đề cập trong nghiên cứu của Lin et al. (2009) [6]. Vì vậy, sự biểu hiện của gen Ker1 từ chủng B. licheniformis và gen Ker2 từ chủng B. subtilis phải tiếp tục nghiên cứu các điều kiện biểu hiện cũng như các tác nhân kích thích để protein được biểu hiện có hoạt tính cao hơn. Bảng 2. Thử hoạt tính của keratinase tái tổ hợp Hoạt tính keratinase (U/ml) Cơ chất E. coli BL21(DE3)[pET22(+)-ker1] E. coli BL21(DE3)[pET32(+)-ker2] Azokeratin 23,5 18,5 KẾT LUẬN Chúng tôi đã thiết kế và khuếch đại thành công hai đoạn gen keratinase từ chủng B. licheniformis HT10, B. subtilis Đnđ1.2. Hai đoạn gen Ker 1 và Ker 2 này có độ tương đồng cao tương ứng với các gen keratinase từ chủng B. licheniformis, B. subtilis đã được công bố trên GenBank. Hai vector pET22b + Ker 1 và pET32a + Ker 2 đã được biểu hiện trong E. coli và thu nhận được hai protein tái tổ hợp có kích thước tương ứng là 28 kDa (hoạt tính đạt 23,5 U/ml) và 36 kDa (hoạt tính đạt 18,5 U/ml). Lời cảm ơn: Công trình được sự hỗ trợ về kinh phí của Bộ Công thương với đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất keratinase ứng dụng trong chế biến lông vũ làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi”, mã số: ĐT.04.12/CNSHCB. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Brandelli A., 2008. Bacterial Keratina ses: Useful Enzymes for Bioprocessing Agroindus trial Wastes and Beyond. Food Bioprocess Technol., 1: 105 -116. 2. Gupta R., Ramnani P., 2006. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Applied Microbiology and Biotechnology, 70(1): 21- 33. 3. Nguyễn Văn Hiếu, Phí Quyết Tiến, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Gia Hy, 2010. Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protease serin của chủng Bacillus subtilis HT 24 trong Escherichia coli. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A): 841-846. 4. Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Quỳnh Mai, 2010. Phân loại và đánh giá khả năng phân hủy lông vũ của các chủng vi khuẩn Bacillus sp. phân lập từ đất ở nơi giết mổ gia cầm. Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(4): 1869-1875. 5. Hu H., He J., Yu B., Zheng P., Huang Z., Mao X., Yu J., Han G., Chen D., 2013. Expression of a keratinase (kerA) gene from Bacillus licheniformis in Escherichia coli and characterization of the recombinant enzymes. Biotechnol Lett, 35(2): 239-244. 6. Lin H. H., Yin L. J., Jiang S. T., 2009. Cloning, Expression, and Purification of Pseudomonas aeruginosa Keratinase in Escherichia coli AD494(DE3)pLysS Expression System. J. Agric. Food Chem., 57: 3506-3511. 7. Lin X., Lee C. G., Casale E. S., 1992. Purification and characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain. Appl. Environ. Microbiol., 58: 3271-3275. 8. Nguyễn Thị Minh, Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Huy Hoàng, 2011. Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân lông vũ gia cầm và thiết kế vector biểu hiện keratinase trong Escherichia Coli. Hội nghị Khoa học toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên sinh vật lần thứ 4: 1221- 1226. 9. Radha S., Gunasekaran P., 2007. Cloning and expression of keratinase gene in Bacillus megaterium and optimization of fermentation conditions for the production of keratinase by recombinant strain. J. Appl. Microbiol., 103(4): 1301-1310. TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 51-57 57 10. Radha S., Gunasekaran P., 2009. Purification and characterization of keratinase from recombinant Pichia and Bacillus strains. Protein Expr Purif., 64(1): 24-31. 11. Riffel A., Brandelli A., 2002. Isolation and characterization of a feather-degrading bacterium from the poultry processing industry. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 29(5): 255-258. 12. Riffel A., Lucas F., Heeb P., Brandelli A., 2003. Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather keratin. Arch. Microbiol., 179(4): 258-265. 13. Sambrook J., Michal R., 1989. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor 1. 14. Suh H. J., Lee H. K., 2001. Characterization of a keratinolytic serine protease from Bacillus subtilis KS-1. J. Protein Chem., 20(2). 15. Tiwary E., Gupta R., 2010. Extracellular expression of keratinase from Bacillus licheniformis ER-15 in Escherichia coli. J. Agric. Food Chem., 58(14): 8380-8385. 16. Tork S. E., Shahein Y. E., El-Hakim A. E., Abdel-Aty A. M., Aly M. M., 2013. Production and characterization of thermostable metallo-keratinase from newly isolated Bacillus subtilis NRC 3. Int. J. Biol. Macromol., 55: 169-175. 17. Zhang B., Sun Z., Jiang D., Niu T., 2009. Isolation and purification of alkaline keratinase from Bacillus sp. 50-3. African Journal of Biotechnology, 8(11): 2598- 2603. CLONING AND EXPRESSION OF KERATINASE GENES IN ESCHERICHIA COLI BL21(DE3) FROM BACILLUS SPECIES Nguyen Thu Hien1, Hoang Thi Thu Hien1, Khuat Huu Thanh2, Nguyen Huy Hoang1 1Institute of Genome Research, VAST 2Hanoi University of Science and Technology SUMMARY B. licheniformis and B. subtilis are capable to produce enzyme, which hydrolyzed feather highly. Keratinase is a group of commercial enzyme, that has many important applications in industries of waste management, leather, food. Hydrolyzed keratin is used to create some rare amino acids, such as, serine, cysteine and proline or used as animal feed, fertilizer, glue that contribute to reducing environmental pollution. We carried out cloning and expression of recombinant keratinase from Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis in Escherichia coli BL21(DE3). Ker 1 from the strain B. licheniformis HT10 was integrated into pET22b vector and Ker 2 from B. subtilis Đ.nd1.2 was integrated into the pET32a vector. In the same expression conditions at 37°C, the 1mM IPTG, two obtained proteins showed a differ in size and activity of the enzyme respectively is 28 kDa, 23.5 U/ml and 36 kDa, 18.5 U/ml. Keywords: Bacillus lichenniformis, Bacillus subtilis, E. coli, expresssion, keratinase. Ngày nhận bài: 30-6-2013

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf3839_13331_1_pb_4119_2016637.pdf
Tài liệu liên quan