Thực hành Công nghệ vi sinh

g CO2 đã tạo thành. Ví dụ: Gọi lượng CO2 bay ra trong quá trình lên men là X gam. Vậy: - Lượng rượu được tạo thành là: Theo phương trình tổng quát của lên men ethanol thì 88 g CO2 tương ứng với 92 g rượu. Vậy X(g) CO2 tương ứng với Y(g) rượu. Khi đó: - Lượng đường lên men là: 180 g C6H12O6 cho 88 g CO2 Z (g) C6H12O6 cho X (g) CO2 - Xác định cường độ lên men: Cường độ lên men có đơn vị là %; được tính theo lượng đường lên men đã xác định được từ lượng CO2 tạo thành. Ví dụ: Nếu trong 100 ml môi trường có chứa 15 g đường, mà trong 15 g ấy có 12 g sử dụng cho lên men. Gọi cường độ lên men là A%. Khi đó: A (%) = 12 x 180/15 = 82%. Vậy cường độ lên men ethanol là 82%. Thí nghiệm 3: Xác định cường độ của quá trình lên men dựa vào việc xác định hàm lượng đường khử thực tế sử dụng cho lên men (tính theo thực tế). Lượng đường khử nấm men sử dụng là hiệu của hàm lượng đường tổng số bổ 23 sung vào môi trường lên men và hàm lượng đường khử còn lại (đường sót) sau quá trình lên men. Hàm lượng đường khử có trong dịch lên men trước và sau lên men được xác định bằng phương pháp vi lượng của Rodzevich. Từ hàm lượng đường khử trước và sau quá trình lên men có thể tính được cường độ của quá trình lên men. Nguyên tắc của phương pháp xác định hàm lượng đường khử theo Rodzevich: Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm các đường khử (glucose, fructose, mantose) có thể khử dễ dàng đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit (Cu2+ → Cu1+) dưới dạng kết tủa màu đỏ và qua lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) tính được lượng đường khử. Cơ chế của quá trình xảy ra với các giai đoạn sau: Khi trộn hai dung dịch Fehling A và Fehling B với nhau thì xảy ra phản ứng giữa chúng theo hai giai đoạn: Đầu tiên tạo thành kết tủa đồng hidroxit màu xanh da trời: CuSO4 + 2NaOH = Cu(OH) 2 + Na2SO4 Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối Kali natri tartrat tạo thành muối hòa tan có dung dịch màu xanh thẫm. Phương trình phản ứng: Muối trên là một hợp chất không bền, vì thế các đường khử có nhóm andehit hoặc xeton dễ dàng khử đồng (II) oxit tạo thành kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ, bản thân đường bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling. Lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong môi trường H2SO4 sẽ giải phóng ra Iot tự do. 24 CuSO4 + 4KI +H2SO4 → I2 + CuI2 + 2K2SO4 Chuẩn độ lượng Iôt tạo thành bằng natri thiosunfat (Na2S2O3) chuẩn, qua đó tính được lượng đường khử có trong dung dịch. I2 + 2Na2S2O3 = Na2S4O6 + 2NaI Tiến hành: Bước 1: Cho vào bình nón dung tích 50:1 ml dung dịch đã lên men, 2 ml nước cất, 1 ml dung dịch Fehling A và 1 ml dung dịch Fehling B. Bước 2: Đun sôi hai phút (kể từ lúc xuất hiên bọt sôi đầu tiên). Sau khi đun sôi, dung dịch phản ứng phải còn màu xanh đặc trưng và ở dưới có một kết tủa đồng (I) oxit màu đỏ gạch. Trong trường hợp dịch phản ứng mất màu hoàn toàn chứng tỏ lượng dung dịch Fehling cho vào không đủ để oxi hóa hoàn toàn lượng đường có trong dung dịch mẫu thí nghiệm, khi đó phải pha loãng dịch lên men (pha loãng dịch đường) và làm lại thí nghiệm. Trường hợp dịch phản ứng chỉ có màu xanh của Cu2+ và không có kết tủa màu đỏ gạch của đồng (I) oxit thì phải tăng lượng dung dịch lên men (tăng lượng đường trong dịch phản ứng), giảm nước cất để luôn đảm bảo thể tích là 5 ml. Bước 3: Làm nguội, cho thêm vào hỗn hợp 1 ml H2SO4 25% và 1 ml KI 30%, lắc đều và giữ trong 20 phút. Bước 4: Chuẩn độ I2 tạo thành bằng Na2S2O3 0,1N. Song song làm thí nghiệm đối chứng bằng cách thay dung dịch đường bằng nước cất. Hàm lượng đường khử được tính theo công thức sau: X = (a - b) x f x 3,3 Trong đó: - X: Hàm lượng đường khử (mg); - a: Số ml Na2S2O3 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu đối chứng (nước cất); - b: Số ml Na2S2O3 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm; - f : Hệ số hiệu chỉnh của dung dịch Na2S2O3 0,1N; 3,3: 1 ml Na2S2O3 0,1N tương ứng với 3,3 g đường khử. 25 d. Đánh giá chất lượng nấm men sau lên men Làm tiêu bản quan sát chất lượng nấm men dưới kính hiển vi: Nhuộm nấm men với thuốc nhuộm xanh metylen Loeffer. Quan sát nấm men dưới kính hiển vi ở vật kính x40 theo các tiêu chí sau: + Hình thái tế bào; + Số lượng tế bào sống, chết; + Hình thức sinh sản của nấm men; + Khả năng di động... 3.4. Kiểm tra, đánh giá - Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/nhóm) phải chuẩn bị đạt yêu cầu 2 công thức môi trường lên men, tiến hành lên men tạo ethanol thành công. Ngoài ra, sinh viên còn phải viết báo cáo mô tả động thái của quá trình lên men quan sát được và các kết quả nhận được sau khi kiểm tra chất lượng của quá trình lên men. - Viết bài thu hoạch (làm tại lớp, 1 nhóm/1 bài) trình bày kết quả của các thí nghiệm: (i) Đánh giá quá trình lên men ethanol theo cảm quan: Kết quả thống kê vào bảng sau: Công thức môi trường dinh dưỡng Tiêu chí quan sát Kết luận Giải thích Màu sắc Mùi Sự chuyển động của dịch lên men (CO2) Lượng sinh khối nấm men Mùi đường Mùi ethanol 1 2 (ii) Chưng cất thu hồi ethanol Thể tích ethanol thu được: ....... ml. 26 (iii) Định tính sự có mặt của ethanol trong dịch lên men: Kết quả thống kê vào Bảng sau: Ống nghiệm Thành phần phản ứng Kết quả phản ứng Kết luận về sự có mặt của ethanol trong dịch lên men Giải thích kết quả (iv) Xác định hiệu suất của quá trình lên men theo lý thuyết và theo thực tế: Kết quả xử lý và thống kê vào bảng: Công thức thí nghiệm Khối lượng bình lên men (g) Lượng CO2 tạo thành (g) Lượng ethanol tạo thành (g) Hiệu suất lên men theo lý thuyết Hiệu suất lên men thực tế Trước lên men Sau lên men Lượng đường lên men (%) Cường độ lên men (%) Lượng đường lên men (%) Cường độ lên men (%) 1 2 27 - Hoàn thành các câu hỏi sau: + So sánh và kết luận về công thức môi trường dinh dưỡng cho hiệu suất lên men cao trong 2 công thức môi trường lên men đã chuẩn bị? + Tại sao để quá trình lên men diễn ra hiệu quả, môi trường dinh dưỡng cho lên men phải chứa hàm lượng đường cao? + Tại sao trong giai đoạn đầu của quá trình lên men cần cung cấp một lượng nhỏ oxi trong bình lên men, và trong giai đoạn sau của quá trình lên men cần tạo điều kiện yếm khí? 28 Bài 4 QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC 4.1. Mục tiêu và yêu cầu  Mục tiêu Củng cố kiến thức lý thuyết của quá trình lên men lactic, thành phần vi sinh vật tham gia và các đặc trưng cần theo dõi và đánh giá trong quá trình lên men lactic.  Yêu cầu - Củng cố và khắc sâu vai trò, ý nghĩa của quá trình lên men lactic trong công nghệ thực phẩm, đời sống và bảo vệ môi trường. - Rèn luyện kỹ năng: Phân lập vi khuẩn lactic; xác định số lượng vi sinh vật trong cơ chất; pha chế môi trường dinh dưỡng cho lên men, phối trộn giống, cách thức thực hiện thành công một quá trình lên men có sự tham gia của vi sinh vật. 4.2. Kiến thức lý thuyết Quá trình lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường glucose dưới tác dụng của vi sinh vật trong điều kiện yếm khí thành axit lactic (C3H6O3 - CH3CHOHCOOH), một số axit hữu cơ khác và giải phóng năng lượng. Có hai kiểu lên men lactic chính là lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình. Trong lên men lactic đồng hình thực hiện bởi nhóm vi khuẩn lactic đồng hình như Lactobacterium, Thermobacterium, Streptobacterium, Streptococcus. Glucose được chuyển hóa theo chu trình Emden - Meyerhof tạo thành axit piruvic và NADH+. Axit pyruvic sẽ tiếp tục bị khử thành axit lactic theo phương trình phản ứng C6H12O6 → 2CH3CHOHCOOH + Q Trong lên men lactic dị hình thực hiện bởi nhóm vi khuẩn lactic dị hình (Streptococcaceae, Lactobacillaccae), ngoài axit lactic còn tạo thành một số sản phẩm khác như ethanol, axit acetic, glycerol, CO2. 2C6H12O6 → 2CH3CHOHCOOH + CH3COOH + CH3CH2OH + 2CO2 29 Hầu hết vi khuẩn lactic thuộc giống Lactobacillus, là vi khuẩn không sinh bào tử, gram dương (trừ loài Lactobacillus inulinus), không di động, thuộc loại yếm khí hoặc vi hiếu khí (microaerophil). Hình thái vi khuẩn lactic rất đa dạng: hình que ngắn, que dài, hình cầu 4.3. Nội dung thực hành 4.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu - Vật liệu để pha chế môi trường dinh dưỡng cho lên men lactic: sữa (sữa đặc có đường/sữa tươi), rau/củ/quả (ví dụ rau cải/củ xu hào/quả đu đủ). - Giống vi sinh vật: Nhóm vi khuẩn lactic trong sản phẩm sữa chua thương phẩm và nhóm vi khuẩn lactic có sẵn trong rau/củ/quả. - Hóa chất: Phenolphthalein 0,5%, NaCl tinh thể, NaOH 0,1N. - Môi trường xác định số lượng vi khuẩn lactic: Thành phần Hàm lượng Glucose: 20 g K2HPO4: 2 g MgSO4.7H2O: 0,58 g MnSO4.7H2O: 0,2 g Cao nấm men 5 g Peptone 10 g CaCO3: 5 g Agar: 15 g Dẫn nước tới 1.000 ml pH 7,0 Môi trường được khử trùng ở 118ºC trong 20 phút. - Dụng cụ: bình lên men dung tích 1 lít, đĩa petri, puret, pipet, bình tam giác, ống nghiệm, ống đong, lam kính, lamen... - Thiết bị: tủ ấm, tủ lạnh, box cấy vô trùng, cân phân tích, cân kỹ thuật. 30 4.3.2. Thực hiện thí nghiệm 4.3.2.1. Lên men lactic tạo sản phẩm sữa chua Tiến hành quá trình lên men lactic tạo sản phẩm sữa chua từ nguyên liệu là 1 lít sữa tươi hoặc 1 hộp sữa đặc có đường. - Pha loãng sữa: Trường hợp sản xuất sữa chua từ sữa tươi thì không cần pha loãng. Nguyên liệu là sữa đặc có đường và sữa bột thì pha loãng sữa với một lượng nước thích hợp tùy theo nhu cầu về chất lượng sản phẩm. Ví dụ: 1 hộp sữa đặc có thể pha loãng đến thể tích cuối cùng là 1 lít hoặc 1,5 lít, tương ứng với những thể tích pha loãng nhất định sẽ nhận được sản phẩm sữa chua có chất lượng khác nhau. - Khử trùng sữa láng theo kiểu Pasteur ở nhiệt độ 85 - 90ºC trong 15 - 20 phút. (Trong sản xuất nhỏ ở quy mô gia đình, có thể đun sôi nhẹ. Vừa đun vừa khuấy sữa thật đều để sữa không bị cháy). - Lọc sữa qua vải lọc để loại bỏ cặn và váng sữa. - Để sữa nguội tới 35ºC. - Cấy giống: Khuấy trộn giống (1 hộp sữa chua thương phẩm đều vào trong sữa). Lưu ý: Trong sản xuất thủ công có thể dùng giống là sản phẩm sữa chua của lần lên men trước được bảo quản trong tủ lạnh hoặc sản phẩm sữa chua bán trên thị trường. Trong sản xuất ở quy mô công nghiệp cần sử dụng giống vi khuẩn lactic ở dạng thuần khiết, hoặc giống là gói vi khuẩn lactic dạng đông khô. - Lên men sữa ở 30 - 45ºC trong 12 - 16h. Lưu ý: Trong môi trường lên men, quá trình chuyển hóa lactose thành axit lactic dưới hoạt động của nhóm vi khuẩn lactic xảy ra mạnh mẽ. Sự có mặt của axit lactic sẽ làm sữa được kết tủa ở pH đẳng điện (pH = 4 - 5), sữa trở lên đông tụ, đạt độ chua cần thiết. Có thể căn cứ vào độ đông và độ chua của sữa (pH = 3,5 - 5) để kết thúc quá trình lên men. Sản phẩm sữa chua đạt yêu cầu phải có dạng sệt, đồng nhất và không có hiện tượng nước - sữa tách rời, độ chua phải đạt 60 - 80ºT (1ºT = một độ Therner tương ứng với số ml NaOH 0,1N hay KOH 0,1N cần để trung hoà 100 ml sữa). Khi sữa có độ chua đạt yêu cầu thì phải kết thúc nhanh quá trình lên men bằng phương pháp làm lạnh nhanh, nếu không, độ chua của sữa tiếp tục tăng, nước sẽ tách 31 ra khỏi sữa. Có thể bảo quản sản phẩm sữa chua ở 4 - 8ºC. Khi đó, quá trình lên men lactic vẫn xảy ra nhưng chỉ ở mức độ yếu, sữa tiếp tục đông tụ, nước tự do liên kết với protein làm sữa đông đặc thêm. Quá trình tạo hương cho sữa vẫn được tiếp tục bởi hoạt động của vi khuẩn tạo mùi thơm khiến cho sữa chua có mùi đặc trưng. Sản phẩm sữa chua được sản xuất ở quy mô công nghiệp có thể được bổ sung thêm chất ổn định, khi đó sữa chua có thể bảo quản và sử dụng trong 3 - 6 tuần. Trường hợp không thêm chất ổn định, sản phẩm sữa chua chỉ có thể bảo quản và sử dụng trong 24 - 48 giờ. 4.3.2.2. Lên men lactic tạo sản phẩm rau/củ/quả lên men Tạo sản phẩm muối chua từ một loại rau/củ/quả bằng phương pháp lên men truyền thống, tận dụng nguồn vi khuẩn lactic có sẵn trong tự nhiên. - Chuẩn bị một loại rau/củ/quả, để khô, cắt lát. - Cân 500 g rau/củ/quả và xếp vào bình lên men. - Bổ sung dung dịch NaCl 3% đến ngập bề mặt rau/củ/quả trong bình. - Lên men trong tủ ấm ở 37ºC trong 16 - 24h. - Phân tích các đặc trưng của quá trình lên men hoặc bảo quản ở 4ºC cho đến khi phân tích. 4.3.2.3. Xác định các đặc trưng của quá trình lên men lactic a. Đánh giá kết quả bằng cảm quan Sản phẩm lên men lactic là sữa chua hoặc rau/củ/quả muối chua là đạt tiêu chuẩn nếu có các đặc điểm sau: - Sản phẩm sữa chua lên men có màu trắng ngà, bề mặt mịn, đồng nhất, vị chua ngọt, thơm dịu; - Sản phẩm rau/củ/quả lên men có vị chua ngon, màu vàng tươi sáng (không bị sẫm màu), giòn, chắc, không có vị đắng, mùi thơm đặc trưng và không có mùi lạ; - Đánh giá chất lượng sản phẩm bằng phép thử cho điểm thị hiếu sản phẩm theo thang điểm: 32 Cảm xúc đối với sản phẩm Điểm Cực kỳ thích 9 Rất thích 8 Thích 7 Hơi thích 6 Không thích không ghét 5 Hơi ghét 4 Ghét 3 Rất ghét 2 Cực kỳ ghét 1 b. Xác định sự biến đổi về thành phần sinh hóa trong sản phẩm trước và sau lên men  Đo pH của sản phẩm pH của sản phẩm sữa chua và rau/củ/quả muối chua được đo bằng máy đo pH.  Định tính axit lactic Nguyên tắc: Chuyển hóa axit lactic thành CH3CHO, dựa vào phản ứng của CH3CHO với AgNO3 tạo kết tủa bạc có ánh trắng để nhận biết sự có mặt của axit lactic. Tiến hành: Lọc dung dịch sữa chua lấy 10 ml dịch trong. Cho dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 10 ml H2SO4 đặc. Đun nóng. Thêm 1 - 3 giọt KMnO4 10% đến khi xuất hiện kết tủa màu đen. Cho thêm 1 - 2 ml AgNO3. Tiếp tục đun đến khi có ánh bạc trên thành ống nghiệm. Phương trình phản ứng diễn ra như sau: 2KMnO4 + 3H2SO4 = K2SO4 + 2MnSO4 + 3H2O + 5Oº 5CH3CHOHCOOH + 5O = 5CH3CHO + 5CO2 + 5H2O CH3CHO + AgNO3 = Ag↓ + CH3COOH 33  Định lượng axit lactic bằng phương pháp chuẩn độ Therner - Lấy 10 ml dịch lên men, bổ sung 20 ml nước cất và thêm 1 - 2 giọt phenol phthalein 0,5%. - Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại số ml NaOH đã dùng để chuẩn độ. Độ axit được tính như sau: ºT = VNaOH 0,1N x 10 % axit lactic = ºT x 0,009 Trong đó: ºT = Độ Therner. 0,009 là số gam axit lactic tương đương với 1 ml NaOH 0,1N. c. Xác định thành phần vi sinh vật trong sản phẩm lên men lactic  Quan sát hình dạng nhóm vi khuẩn lactic trong sản phẩm dưới kính hiển vi Tiến hành nhuộm gram để quan sát các tế bào vi sinh vật trong sản phẩm sữa chua, rau/củ/quả muối chua dưới kính hiển vi. - Làm vết bôi: Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên phiến kính. Nhỏ 1 giọt dịch sản phẩm lên men lên giọt nước, hòa trộn đều bằng que cấy đầu tròn vô trùng. Để vết bôi khô tự nhiên trong không khí hoặc cố định nhẹ trên ngọn đèn cồn. - Đặt 1 miếng giấy lọc lên vết bôi. Nhuộm vết bôi bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút. Nhuộm lugol trong 1 phút. - Rửa nước, tẩy bằng cồn trong 30 giây (để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu. Rửa lại bằng nước. - Nhuộm bổ sung Fuchsin. - Rửa nước. - Làm khô và soi tiêu bản duới vật kính dầu. Lưu ý: Vi khuẩn gram dương bắt màu thuốc nhuộm tím, vi khuẩn gram âm bắt màu hồng của thuốc nhuộm bổ sung.  Xác định số loại vi sinh vật trong sản phẩm và số lượng tương ứng với từng loại Kiểm tra số loại và số lượng vi sinh vật tương ứng với từng loại trong sản phẩm để đánh giá chất lượng sản phẩm theo tiêu chí: Có bao nhiêu loại vi khuẩn lactic; số lượng tế bào vi khuẩn tương ứng với từng loại từng loại; có chứa vi sinh vật tạp 34 nhiễm không? Có một số phương pháp xác định số lượng vi sinh vật: Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng phiến kính có khung đếm Goriaep (buồng đếm hồng cầu); phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch (theo nguyên tắc mỗi tế bào vi sinh vật trên môi trường thích hợp sẽ phát triển thành một khuẩn lạc, căn cứ vào số lượng khuẩn lạc sẽ tính được số lượng vi sinh vật trong 1 ml hoặc 1 gam cơ chất). Tiến hành xác định số lượng vi sinh vật theo phương pháp nào cũng cần tiến hành pha loãng vi sinh vật. Phƣơng pháp pha loãng vi sinh vật: - Xếp 1 dãy ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng; - Hút 1 ml cơ chất hoặc cân 1 gam cơ chất (tùy theo cơ chất cần xác định số lượng vi sinh vật là láng hay đặc) cho vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều, có dung dịch cơ chất được pha loãng đến 10-1 lần; - Dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch ở nồng độ 10-1 cho vào 9 ml nước cất vô trùng ở ống nghiệm thứ hai, lắc đều có nồng độ pha loãng 10-2; - Tiếp tục làm như vậy với các ống nghiệm thứ 3, 4, 5, 6, 7, 8 đến khi có được dãy pha loãng cần thiết để nuôi cấy và xác định số loại vi sinh vật có trong cơ chất và số lượng của chúng. Phƣơng pháp xác định số lƣợng vi sinh vật bằng đếm khuẩn lạc: - Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch pha loãng cho vào mỗi đĩa thạch; - Dùng que gạt thủy tinh gạt đều khắp trên mặt thạch để tách riêng rẽ từng tế bào. Lưu ý: Với mỗi mẫu cần xác định số lượng vi sinh vật cấy ở 3 nồng độ liên tiếp. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa petri và lấy kết quả trung bình. - Đặt các đĩa petri cấy vi sinh vật ở tủ ấm 37ºC trong 24 - 48h; - Xác định số lượng vi sinh vật mọc trên đĩa petri ở nồng độ pha loãng thích hợp cho phân tách vi sinh vật dưới dạng khuẩn lạc; - Xác định số lượng tế bào tương ứng với từng loại vi sinh vật theo công thức: 35 Trong đó: - N: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 ml dịch mẫu; - ΣC: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa xác định được số khuẩn lạc; - n1: Số lượng đĩa cấy đếm được khuẩn lạc tại độ pha loãng i; - V: Thể tích dịch mẫu (ml) đã pha loãng cấy vào mỗi đĩa; - di: Độ pha loãng i. Lưu ý: Nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn lactic trong sản phẩm sữa chua mọc trên môi trường dinh dưỡng agar đã chuẩn bị như sau: Vi khuẩn Lactobacillus cho khuẩn lạc nhỏ, đường kính 1 - 5 mm, dạng tròn, trắng đục, bề mặt trơn nhẵn, có khả năng tạo vòng trong quanh khuẩn lạc (do sinh ra axit lactic phân giải CaCO3); vi khuẩn Streptococcus cho khuẩn lạc tròn, đường kính 0,5 - 3 mm, màu trắng sữa, bề mặt bóng, mọc lồi trên bề mặt môi trường. Các khuẩn lạc có đặc điểm của vi khuẩn lactic có thể tiếp tục cấy chuyển thêm một số lần để phân lập được chủng vi khuẩn lactic thuần khiết. 4.4. Kiểm tra, đánh giá - Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/nhóm) phải thực hiện thành công 2 quá trình lên men lactic (sản phẩm sữa chua và rau/củ/quả muối chua) và xác định được các đặc trưng của quá trình lên men. - Viết bài thu hoạch (làm tại lớp, 1 nhóm/1 bài) trình bày kết quả của các thí nghiệm: (i) Đánh giá chất lượng của sản phẩm lên men theo cảm quan. Kết quả trình bày vào bảng dưới đây: Loại sản phẩm lên men Cấu trúc Màu sắc Mùi Vị Điểm chấm theo thị hiếu Trước lên men Sau lên men Trước lên men Sau lên men Trước lên men Sau lên men Sữa chua Rau/củ/quả muối chua (ii) Xác định sự biến đổi về thành phần sinh hóa trong sản phẩm trước và sau lên men. Kết quả xử lý và thống kê vào bảng dưới đây: 36 Loại sản phẩm lên men pH Nồng độ axit lactic (% w/v) Nồng độ axit lactic tạo thành trong quá trình lên men Đánh giá hiệu quả của quá trình lên men Trước lên men Sau lên men Trước lên men Sau lên men Sữa chua Rau/củ/quả muối chua Ghi chú: Nồng độ axit lactic tạo thành trong quá trình lên men bằng hiệu số của nồng độ axit lactic trong sản phẩm trước và sau lên men (iii) Xác định các đặc trưng về thành phần vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn lactic trong sản phẩm sữa chua (số loại vi khuẩn lactic và số lượng tế bào vi khuẩn tương ứng với từng loại). Kết quả xử lý và thống kê vào bảng dưới đây: Ký hiệu vi sinh vật Hình thái khuẩn lạc Số lượng khuẩn lạc đếm được ở nồng độ pha loãng Số lượng tế bào (CFU/ml) Số lượng tế bào vi sinh vật tổng số Đường kính (mm) Màu sắc Hình dạng 10-7 10-8 10-9 Ghi chú: CFU - Colony Forming Unit (đơn vị tạo thành khuẩn lạc). (iv) Xác định hình dạng tế bào vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn lactic trong sản phẩm lên men (sữa chua, rau/củ/quả muối chua) bằng phương pháp nhộm Gram. Kết quả quan sát và thống kê trình bày ở bảng dưới đây: 37 Loại sản phẩm lên men Ký hiệu vi khuẩn Thuộc loại Gram Hình dạng tế bào Sữa chua Rau/củ/quả muối chua - Hoàn thành các câu hỏi sau: + Mô tả hình dạng của nhóm vi khuẩn lactic? + Đa số vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương hay Gram âm? + Loại cơ chất không thể thiếu cho quá trình lên men lactic là gì? + Điều kiện môi trường vật lý thích hợp quá trình lên men lactic thực hiện bởi nhóm vi khuẩn lactic? + Kể tên 10 loại cơ chất có sẵn trong tự nhiên mà anh/chị có thể sử dụng để chuẩn bị môi trường dinh dưỡng cho quá trình lên men lactic làm thực phẩm cho người và vật nuôi? 38 Bài 5 QUÁ TRÌNH LÊN MEN ACETIC 5.1. Mục tiêu và yêu cầu  Mục tiêu Củng cố kiến thức về nguyên lý và vai trò của nhóm vi khuẩn Acetobacter trong công nghệ sản xuất giấm ăn và sản xuất axit acetic.  Yêu cầu Mỗi nhóm sinh viên phải tiến hành quá trình lên men sinh axit acetic từ nguồn cơ chất ban đầu là bia, qua đó rèn luyện các kỹ năng: thao tác thực hiện quá trình lên men tận dụng nguồn vi sinh vật có lợi phân bố phổ biến trong tự nhiên, xác định hiệu suất lên men bằng các phương pháp hóa sinh. 5.2. Kiến thức lý thuyết Lên men acetic là một quá trình chuyển hóa hiếu khí để oxi hóa ethanol thành axit acetic. Phương trình tổng quát của quá trình này diễn ra như sau: CH3CH2OH + O2 → CH3COOH + H2O + 117 kcal Các vi sinh vật tham gia vào quá trình này gồm nhiều loại, chủ yếu là giống Acetobacter. Đặc điểm chung của nhóm vi khuẩn Acetobacter là trực khuẩn liên kết thành chuỗi, gram âm, không sinh bào tử, hầu hết không có khả năng chuyển động và hô hấp hiếu khí bắt buộc. Khi phát triển các vi khuẩn Acetobacter thường tạo trên bề mặt dịch lên men một vết láng nhầy màu xám trắng thường gọi là con giấm. Điều kiện thích hợp cho quá trình lên men tạo axit acetic từ ethanol là môi trường dinh dưỡng có pH 3,0, nồng độ ethanol trong khoảng 6 - 12%, ở nhiệt độ 28 - 30ºC. Trong thực tế các loài Acetobacter được dùng trong công nghiệp thường gặp gồm: - A. aceti: Trực khuẩn ngắn hình que, xếp thành chuỗi, không di động, có khả năng chịu được độ rượu khá cao, có màu vàng khi nhuộm lugol; - A. pasteurianum: Tế bào hình que, có khi xếp thành sợi dài, tạo thành lết váng khô nhăn nheo, có màu xanh khi nhuộm lugol; - A. orleanse: Tế bào hình que, nhỏ, có khi dị hình, không di động, có thể chịu được độ rượu cao; - A. sylnium: Tế bào hình que, không di động, tạo thành vòng dày, tích lũy 4,5% axit acetic. 39 5.3. Nội dung thực hành 5.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu - Hóa chất: phenolphthalein 0,1%, ethanol 96º, NaOH 0,1N, H2SO4 đậm đặc. - Dụng cụ: bình tam giác, puret, pipet, lam kính, lamen, đèn cồn... - Thiết bị: tủ ấm, cân kỹ thuật, box cấy vô trùng. 5.3.2. Thực hiện thí nghiệm 5.3.2.1. Lên men tạo axit acetic - Chuẩn bị môi trường cho lên men acetic: Cho vào dụng cụ thủy tinh có miệng rộng (thể tích 100 ml) các chất sau: 30 - 40 ml bia, 0,5 ml rượu etylic. - Để dụng cụ này ngoài không khí vài giờ (tạo điều kiện cho nhóm vi khuẩn lên men tạo axit acetic trong không khí lây nhiễm vào môi trường), đậy bình môi trường bằng vải màn mỏng, cho vào tủ ấm 25 - 30ºC trong 72 - 120h. - Thu hồi sản phẩm lên men khi thấy xuất hiện một màng mỏng màu xám trắng do các tế bào vi khuẩn Acetobacter liên kết tạo thành trên bề mặt môi trường, ngửi bình môi trường thấy có mùi giấm. 5.3.2.2. Xác định các đặc trưng của quá trình lên men acetic a. Đánh giá theo cảm quan Đánh giá quá trình lên men theo cảm quan bằng quan sát và ngửi mùi. b. Định tính phát hiện sự có mặt của axit acetic trong dịch lên men Nguyên tắc: Dựa vào các phản ứng đặc trưng của axit acetic với các chất khác nhau để xác định sự có mặt của axit acetic trong quá trình lên men. Thực hiện 2 thí nghiệm định tính axit acetic: Thí nghiệm 1: Phản ứng tạo thành ethyl acetate. - Cho vào ống nghiệm các chất sau: 5 ml dịch lên men + 0,5 ml rượu etylic 96% + 3 ml H2SO4 đậm đặc. - Đun nóng ống nghiệm trên đèn cồn và thấy mùi thơm bay ra do ethyl acetate tạo thành. Điều này chứng tỏ trong thành phần dịch lên men có axit acetic. Phản ứng diễn ra theo phương trình: 40 Thí nghiệm 2: Phản ứng tạo thành sắt acetate. - Cho vào ống nghiệm các chất sau: 3 ml dịch lên men + 1 ml NaOH 20% + vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Lắc đều ống nghiệm. - Đun nóng ống nghiệm trên ngọn đèn cồn. Nếu dung dịch có axit acetic thì sẽ có màu đỏ thẫm do sắt acetate được tạo thành. Phương trình phản ứng: CH3COOH + NaOH → CH3COONa + H2O 3CH3COONa + FeCl3 → Fe(CH3COO)3 + 3NaCl c. Phản ứng định lượng axit acetic - Cho vào bình tam giác có thể tích 100 ml: 10 ml dịch lên men; 1 - 2 giọt dung dịch phenolphtalein 0,1%. - Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại số ml NaOH đã dùng để chuẩn độ. Độ axit acetic được tính như sau: N (% w/v) = VNaOH 0,1N x 10 x 0,006 Trong đó: N = Độ axit acetic (%). 0,006 là hệ số chuyển đổi thể tích NaOH 0,1N thành axit acetic. d. Quan sát hình dạng nhóm vi khuẩn sinh axit acetic dưới kính hiển vi - Làm tiêu bản vết bôi vi khuẩn sinh axit acetic lên phiến kính và nhuộm màu vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram (thực hiện theo các bước như ở mục c của phần 4.3.2.3, bài 4 - Quá trình lên men lactic). - Quan sát hình dạng nhóm vi khuẩn lên men tạo axit acetic ở vật kính x40 và vẽ hình dạng của vi khuẩn. 5.4. Kiểm tra, đánh giá - Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/nhóm) phải thực hiện thành công quá trình lên men acetic và xác định được các đặc trưng của quá trình lên men. - Viết bài thu hoạch (làm tại lớp, 1 nhóm/1 bài) trình bày kết quả của các thí nghiệm: 41 (i) Đánh giá bằng cảm quan và định tính, định lượng axit acetic. Kết quả được xử lý, thống kê vào bảng: Thí nghiệm Đặc trưng của quá trình lên men acetic Kết luận Đánh giá bằng cảm quan Định tính Nồng độ axit acetic (%) Màu sắc Mùi Phản ứng tạo ethyl acetate Phản ứng tạo sắt acetate (ii) Xác định hình dạng tế bào và tính chất Gram của vi khuẩn sinh axit acetic: Kết quả thống kê vào bảng: Tiêu bản Thuộc loại Gram Hình dạng vi khuẩn - Hoàn thành các câu hỏi: + Giải thích cơ chế của phản ứng tạo thành axit acetic từ ethanol nhờ nhóm vi khuẩn sinh axit aceitic? + Lên men acetic là quá trình lên men hiếu khí hay kỵ khí? Giải thích? 42 Bài 6 QUÁ TRÌNH PHÂN GIẢI CELLULOSE NHỜ VI SINH VẬT 6.1. Mục tiêu và yêu cầu  Mục tiêu Giúp sinh viên củng cố kiến thức về quá trình phân giải cellulose trong thành tế bào thực vật bởi một số nhóm vi sinh vật trong tự nhiên, và ứng dụng của quá trình đó trong công nghiệp sản xuất giấy, trong công nghệ sản xuất ethanol từ nguồn cơ chất cellulose thực vật.  Yêu cầu Mỗi nhóm sinh viên phải tiến hành quá trình phân giải cellulose hiếu khí nhờ vi sinh vật có hoạt tính cellulase trong đất. 6.2. Kiến thức lý thuyết Cellulose là một phần rất cơ bản của tổ chức thực vật. Tham gia phân giải cellulose có nhiều nhóm vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn. Dưới tác dụng của men cellulase do vi sinh vật tiết ra, cellulose bị phân giải thành cellobiose và sau đó nhờ men cellobioase bị phân giải tiếp thành glucose theo phương trình: (C6H10O5) + nH2O → nC12H22O11 + nH2O → nC6H12O6 Trong điều kiện hiếu khí, glucose tiếp tục được oxi hóa bởi nhóm vi sinh vật hiếu khí thành CO2 và H2O theo phương trình: Trong điều kiện kị khí, glucose bị phân giải theo cơ chế của quá trình lên men butyric theo phương trình: C6H12O6 → CH3CH2CH2COOH + CH3COOH + CO2 + H2 + Q 6.3. Nội dung thực hành 6.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu - Chuẩn bị môi trường Vinogratxki dạng lỏng có công thức: 43 Thành phần Hàm lượng KNO3 2,5 g KH2PO4 1 g MgSO4 0,5 g NaCl 0,5 g FeSO4 0,01 g Mn2(SO4)3 0,01 g Nước cất 200 ml Môi trường được khử trùng ở 121ºC trong 20 phút. - Dụng cụ: ông nghiệm, giấy lọc. - Thiết bị: tủ ấm, cân kỹ thuật. 6.3.2. Thực hiện thí nghiệm - Cho vào ống nghiệm 4 - 5 ml môi trường Vinogratxki lỏng vô trùng. - Cắt giấy lọc thành dải hình chữ nhật sao cho đường chiều ngang dải giấy lọc nhỏ hơn đường kính ống nghiệm. - Dùng kẹp sắt kẹp một đầu dải giấy lọc đặt vào ống nghiệm chứa môi trường sao cho một đầu giấy lọc ngập vào môi trường, đầu kia nằm trên miệng ống nghiệm. - Cho vào ống nghiệm 0,1 g đất (nguồn vi sinh vật). - Đặt ống nghiệm vào tủ ấm, giữ ở 30ºC trong 7 - 15 ngày. - Kiểm tra kết quả: Các vi sinh vật phân giải cellulose phát triển, tiết ra men cellulase phân giải cellulose làm cho giấy bị phân hủy, hóa nhày, có màu vàng, hồng, lục. Chất nhày có màu sắc chính là sinh khối của vi khuẩn phân giải cellulose. 6.4. Kiểm tra, đánh giá Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/1 nhóm) phải thực hiện thành công thí nghiệm kiểm tra khả năng phân giải cellulose của vi sinh vật trong đất; quan sát, thống kê kết quả và ghi vào bảng dưới đây: 44 Ký hiệu mẫu Vị trí giấy lọc bị phân hủy Mức độ phân giải giấy lọc Số vị trí bị phân hủy Đường kính trung bình của vùng bị phân hủy (mm) Màu sắc 45 Bài 7 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME CỦA VI SINH VẬT 7.1. Mục tiêu và yêu cầu  Mục tiêu Củng cố kiến thức về sự hình thành các sản phẩm được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật như enzyme và vai trò của enzyme việc phân giải cơ chất trong môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật.  Yêu cầu Mỗi nhóm sinh viên phải tiến hành xác định hoạt tính amylase được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của một số loài vi sinh vật khi nuôi trong môi trường dinh dưỡng lỏng. Qua các thí nghiệm thực hành, sinh viên được hình thành và rèn luyện kỹ năng: nuôi cấy vi sinh vật, xác định hoạt tính enzyme của vi sinh vật. 7.2. Kiến thức lý thuyết Enzyme ngoại bào của vi sinh vật được tạo ra trong tế bào, sau đó tiết vào môi trường trong quá trình nuôi cấy để thực hiện chức năng cụ thể, phục vụ các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các vi sinh vật khác nhau có hoạt tính và tính chất khác nhau. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme và hiệu suất thu hồi enzyme, ví dụ đặc điểm chủng giống, môi trường và điều kiện vật lý trong quá trình nuôi cấy... 7.3. Nội dung thực hành 7.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu - Giống vi sinh vật: Các ống giống Bacillus subtilis và Aspergillus niger. - Môi trường xác định hoạt tính amylase ngoại bào của vi sinh vật: Thành phần Hàm lượng NaNO3 1 g K2HPO4 1 g KCl 0,5 g 46 Thành phần Hàm lượng MgSO4 0,5 g FeSO4 0,01 g Tinh bột tan 10 g Nước cất 1.000 ml Lưu ý: Tinh bột hòa tan vào nước ấm, khuấy đều, đun thành hồ rồi đổ vào hỗn hợp chất dinh dưỡng của môi trường. Điều chỉnh pH môi trường đến 6,5. Khử trùng môi trường ở 121ºC trong 20 phút. Phân phối môi trường vào các đĩa petri. - Thuốc nhuộm Lugol: 1 g I2 hòa tan trong 100 ml dung dịch KI 2%. - Dụng cụ: đĩa petri, que cấy vi sinh vật, thước chia vạch. - Thiết bị: tủ ấm điều nhiệt, cân phân tích, cân kỹ thuật. 7.3.2. Thực hiện thí nghiệm Xác định khả năng sinh amylase ngoại bào của vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm mốc Aspergillus niger bằng phương pháp cấy chấm điểm và đo đường kính vòng phân giải cơ chất xung quanh khuẩn lạc. Tiến hành: - Dùng que cấy hình thước thợ lấy giống vi sinh vật (Bacillus subtilis, Aspergillus niger) và cấy vào môi trường thạch đĩa thành những điểm (cấy chấm điểm); - Đặt các đĩa petri vào tủ ấm 30ºC trong thời gian 3 - 5 ngày đến khi vi sinh vật phát triển tạo khuẩn lạc; - Lấy đĩa cấy ra khỏi tủ ấm, rót dung dịch Lugol lên bề mặt thạch trong đĩa petri; - Quan sát đường kính vòng phân giải tinh bột của amylase ngoại bào của các chủng vi sinh vật (amylase ngoại bào do vi sinh vật tiết ra môi trường sẽ làm phân giải tinh bột xung quanh các khuẩn lạc tạo thành vòng thủy phân không màu, trong khi phần còn lại trên đĩa có màu xanh do tinh bột phản ứng với I2 trong dung dịch Lugol; - Dùng thước đo đường kính khuẩn lạc (d) và đường kính vùng thủy phân (D). Lưu ý: Đo đường kinh của khuẩn lạc và vòng thủy phân ở mặt sau đĩa petri. - Tỉnh tỷ lệ D/d (mm): Tỷ số D/d có giá trị càng cao chứng tỏ hoạt tính enzyme của chủng vi sinh vật càng mạnh. 47 7.4. Kiểm tra, đánh giá Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/1 nhóm) phải thực hiện thành công thí nghiệm kiểm tra khả năng sản sinh amylase ngoại bào của Bacillus subtilis và Aspergillus niger. - Báo cáo kết quả thực hành: Quan sát, thống kê, xử lý kết quả và ghi vào bảng dưới đây: Loại vi sinh vật kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào Đường kính vòng thủy phân tinh bột 1% (D, mm) Đường kính khuẩn lạc (d, mm) Tỷ lệ D/d Kết luận Bacillus subtilis Aspergillus niger - Kết luận về hoạt tính amylase ngoại bào của hai chủng vi sinh vật kiểm tra hoạt tính kháng sinh là vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm mốc Aspergillus niger. 48 Bài 8 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA VI SINH VẬT 8.1. Mục tiêu và yêu cầu  Mục tiêu Giúp sinh viên củng cố kiến thức về khả năng sinh chất kháng sinh của vi sinh vật, nắm vững phương pháp xác định hoạt tính sinh chất kháng sinh của vi sinh vật.  Yêu cầu - Mỗi nhóm sinh viên phải tiến hành xác định hoạt tính kháng sinh của hai loại vi sinh vật là vi khuẩn Bacillus subtilis, xạ khuẩn Actinomyces. - Hình thành và rèn luyện kỹ năng xác định khả năng sinh chất kháng sinh của vi sinh vật; phương pháp tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính kháng sinh cao. 8.2. Kiến thức lý thuyết Chất kháng sinh (antibiotic) là các chất hóa học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc các vi sinh vật khác. Trong tự nhiên, việc tổng hợp các chất kháng sinh sẽ tạo ưu thế cạnh tranh cho các chủng vi sinh vật sinh chất kháng sinh, qua đó ức chế hoặc tiêu diệt sự phát triển của các vi sinh vật khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái. Trong công nghệ sản xuất chất kháng sinh, các nhà khoa học đã áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến để tạo ra những biến chủng công nghiệp có năng lực “siêu tổng hợp” các chất kháng sinh với hàm lượng cao gấp nhiều lần so với các chủng tự nhiên. Các chủng vi sinh vật thường được khai thác khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh chủ yếu thuộc chi/loài: Penicillium chrysogenum, Streptomyces, Cephalosporium, Acremonium, Streptococcus, Bacillus... 8.3. Nội dung thực hành 8.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu - Giống vi sinh vật gồm: + Các ống giống vi sinh vật sinh chất kháng sinh là vi khuẩn Bacillus subtilis 49 và xạ khuẩn Actinomyces; + Các ống giống vi sinh vật kiểm định gồm: vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, nấm mốc Fusarium, Aspergillus niger. - Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng cho nuôi cấy và xác định hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật: + Môi trường LB nhân giống vi khuẩn Bacillus subtilis: Thành phần Hàm lượng Peptone 10 g NaCl 5 g Dịch chiết nấm men 5 g Dẫn nước tới 1.000 ml pH 7,0 Agar 20 g + Môi trường Gause nhân sinh khối xạ khuẩn Actinomyces: Thành phần Hàm lượng KNO3 1 g K2HPO4 0,5 g MgSO4 0,5 g NaCl 0,5 g FeSO4 0,01 g Tinh bột tan 20 g Dẫn nước tới 1.000 ml pH 7,0 Agar 20 g 50 + Môi trường thạch - thịt - peptone xác định hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật: Thành phần Hàm lượng Peptone 10 g Cao thịt 5 g pH 7,0 Agar 20 g Sau khi pha chế, môi được hấp khử trùng ở 121ºC trong 20 phút, để nguội đến 50ºC sau đó phân phối vào các đĩa petri vô trùng (thao tác trong box cấy). - Dụng cụ: bình tam giác, đĩa petri, que cấy vi sinh vật - Thiết bị: tủ ấm nuôi vi sinh vật, cân phân tích, cân kỹ thuật. 8.3.2. Thực hiện thí nghiệm 8.3.2.1. Nhân giống vi sinh vật sinh chất kháng sinh - Lấy giống vi khuẩn Bacillus subtilis và xạ khuẩn Actinomyces trong ống nghiệm. - Cấy giống vi khuẩn Bacillus subtilis vào môi trường LB agar và xạ khuẩn Actinomyces vào môi trường Gause agar trong đĩa petri. - Nuôi cấy trong tủ ấm ở 37ºC trong 48h đối với vi khuẩn Bacillus subtilis và 120h đối với xạ khuẩn Actinomyces. 8.3.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật - Cấy giống vi sinh vật kiểm định (vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, nấm mốc Fusarium, Aspergillus niger) vào môi trường thạch - thịt - peptone bằng phương pháp cấy trải (mỗi loại vi sinh vật kiểm định được cấy riêng rẽ vào 1 đĩa petri. Dán nhãn ghi ký hiệu vi sinh vật, ngày cấy và người cấy lên đĩa. - Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có vi sinh vật cần thử hoạt tính kháng sinh. - Đặt các khối thạch vào đĩa petri chứa môi trường thạch - thịt - peptone đã cấy 51 các vi sinh vật kiểm định. Lưu ý: Có thể đặt có thể đặt sấp hay ngửa khối thạch. Đặt sấp khối thạch để xem tác dụng trực tiếp của kháng sinh do vi sinh vật tạo ra; đặt ngửa khối thạch để xác định sự tiết kháng sinh ra ngoài môi trường. - Đặt các đĩa cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 30ºC trong thời gian 3 - 5 ngày. - Xác định hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật bằng đo đường kính vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch (nếu vi sinh vật sinh chất kháng sinh thì chất kháng sinh sẽ tiêu diệt hoặc ức chế vi sinh vật kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch. Vòng vô khuẩn càng lớn thì hoạt tính kháng sinh của chủng vi sinh vật càng mạnh). 8.4. Kiểm tra, đánh giá - Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/1 nhóm) phải thực hiện thành công quá trình xác định hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật. - Viết bài thu hoạch (làm tại lớp, 1 nhóm/1 bài). Trong bài thu hoạch trình bày rõ kết quả về hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật và thống kê kết quả vào bảng dưới đây: Vi sinh vật sinh kháng sinh Vi sinh vật kiểm định Đường kính vòng phân giải (D, mm) Đường kính lỗ thạch (d, mm) Hoạt tính kháng sinh D - d (mm) B. subtilis E. coli S. aureus Fusarium Aspergillus niger Actinomyces E. coli S. aureus Fusarium Aspergillus niger 52 - Hoàn thành các câu hỏi sau: + Đánh giá về hoạt tính kháng sinh của hai chủng vi sinh vật là vi khuẩn Bacillus subtilis và xạ khuẩn Actinomyces? + So sánh hoạt tính kháng sinh của hai chủng vi sinh vật đã xác định hoạt tính kháng sinh? 53 Bài 9 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG QUÁ TRÌNH PHÂN HỦY RÁC HỮU CƠ 9.1. Mục tiêu và yêu cầu  Mục tiêu Giúp sinh viên hiểu rõ vai trò của vi sinh vật trong công nghệ vi sinh ứng dụng không chỉ giới hạn bởi các sản phẩm của quá trình lên men thực phẩm, sản xuất thuốc dùng trong y - dược, sản xuất thuốc trừ sâu mà còn đóng vai trò rất lớn trong công nghệ xử lý rác thải, môi trường.  Yêu cầu Mỗi nhóm sinh viên phải tiến hành thành công một thí nghiệm xử lý rác thải hữu cơ với sự tham gia của các thành phần vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên, thực hiện trong điều kiện in vivo. 9.2. Kiến thức lý thuyết Từ xưa đến nay, các hoạt động do sinh hoạt và sản xuất công nghiệp của con người vẫn tạo ra một lượng lớn rác thải mỗi ngày. Tuy nhiên, môi trường sống của con người không bị ngập, nguồn nước và không khí không bị ô nhiễm nặng bởi những khối lượng rác thải khổng lồ. Bởi vì sao? Trước khi đề cập đến các biện pháp tích cực của con người nhằm xử lý ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí, cần xem xét một hiện tượng rất quan trọng trong tự nhiên, giúp cho môi trường sinh thái và môi trường sống được cân bằng, đó là quá trình tự phân hủy rác thải rác thải và tự làm sạch nguồn nước do các yếu tố sinh học, mà trong đó vi sinh vật đóng một vai trò rất quan trọng. Rác thải có thể được con người xử lý bằng các tác động vật lý, hóa học để xúc tác quá trình phân hủy rác thải, tái chế rác thải, đặc biệt là các loại rác không thể tự phân hủy nhờ hoạt động của vi sinh vật (túi nilon, đồ dùng bằng nhựa, sành, sắt). Ngoài ra, rác thải có thể được sử dụng bởi các mắt xích trong chuỗi thức ăn như động vật bậc thấp (côn trùng, giun, động vật nguyên sinh ăn những thức ăn dạng hạt nhỏ và cực nhỏ, động vật bậc cao ăn xác thực vật và các động vật khác nhỏ hơn). Trong số các tác nhân có khả năng dọn dẹp rác hữu cơ, vai trò của vi sinh vật có ý nghĩa hơn cả. Vi sinh vật có thể sử dụng các hợp chất hữu cơ tồn tại ở thể rắn cũng như hoà tan trong môi trường nước và phân giải chúng đến muối vô cơ, CO2 và nước 54 trong những trường hợp thuận lợi nhất của môi trường. Nói cách khác, vi sinh vật có khả năng khoáng hóa một cách hoàn toàn rất nhiều chất bẩn hữu cơ có trong rác thải. 9.3. Nội dung thực hành 9.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu - Chế phẩm vi sinh phân giải rác hữu cơ chứa một số nhóm vi sinh vật như vi khuẩn Bacillus, vi khuẩn lactic, nấm mốc - Dụng cụ: quốc, xẻng, nhiệt kế, nilon. 9.3.2. Thực hiện thí nghiệm Thực hành xử lý rác thải hữu cơ theo hai biện pháp: (i) Thực hiện phương pháp ủ để tự phân hủy nhờ hệ vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên (phân bố trong rác); (ii) ủ rác hữu cơ với chế phẩm vi sinh vật phân hủy rác thải. Cách thức tiến hành: - Đào 2 hố vuông, mỗi hố có diện tích 1 m2; - Thu rác thải hữu cơ gồm xác động thực vật, thức ăn thừa đổ đầy 2 hố; - Hố thứ nhất sử dụng hệ vi sinh vật tự nhiên phân hủy theo kiểu truyền thống; - Hố thứ hai rắc đều vào đống rác chế phẩm vi sinh vật xử lý rác thải; - Ủ kín bề mặt đống rác với mảnh nilon (chèn chặt với nilon); - Sau 4 tuần ủ. Thống kê các chỉ tiêu ở mỗi đống rác: + Nhiệt độ đo được trong mỗi đống ủ: Đo bằng nhiệt kế; + Dung lượng rác trước và sau khi ủ: Đo thể tích rác trong đống ủ; + Nhận xét bằng cảm quan: quan sát, ngửi; + Quan sát vi sinh vật dưới kính hiển vi: Làm tiêu bản và quan sát hệ vi sinh vật ở vật kính x40; + Xác định sơ bộ số lượng vi sinh vật: Bằng phương pháp pha loãng và cấy trải trên môi trường dinh dưỡng agar trong đĩa petri; + Đánh giá và so sánh hiệu quả xử lý rác thải của hai biện pháp. 9.4. Kiểm tra, đánh giá Nhóm sinh viên (5 - 10 sinh viên/nhóm) thu thập số liệu thí nghiệm sau 4 tuần. Kết quả được xử lý và thống kê ở bảng: 55 Công thức thí nghiệm Nhiệt độ đống ủ (ºC) Dung lượng rác trong đống ủ (cm3) Hình thái các nhóm vi sinh vật chủ yếu Trước ủ Sau ủ Vi khuẩn Nấm mốc Phân hủy nhờ hệ vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên Phân hủy bằng chế phẩm vi sinh 56 Bài 10 THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS 10.1. Mục tiêu và yêu cầu  Mục tiêu Giúp sinh viên nắm vững và hiểu thấu đáo về vai trò và hiệu quả của việc sử dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) để diệt trừ sâu hại cây nông - lâm nghiệp, và việc sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh Bt trong canh tác sẽ giúp phát triển một nền nông nghiệp xanh - sạch - bền vững.  Yêu cầu Mỗi nhóm sinh viên phải thực hành để rèn luyện các kỹ năng: - Kỹ năng nhân giống vi khuẩn Bt trong môi trường dinh dưỡng lỏng; - Kỹ năng làm tiêu bản, xác định hình dạng tế bào, bào tử và tinh thể độc của vi khuẩn Bt; - Xác định hiệu quả diệt sâu ăn lá của vi khuẩn Bt trong phòng thí nghiệm. 10.2. Kiến thức lý thuyết Trong số các loại thuốc trừ sâu sinh học thì thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bacillus thurigiensis (thuốc trừ sâu Bt) luôn được ưu tiên sử dụng bởi hiệu quả diệt sâu mạnh, phổ kháng rộng với nhiều loại côn trùng, đặc biệt có khả năng diệt mạnh nhiều loại sâu ăn lá. Bacillus thurigiensis (Bt) là vi khuẩn đất, gram (+), có khả năng sinh nội bào tử và tinh thể độc, hô hấp hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc, tế bào hình que (kích thước khoảng 3 - 6µm), có tiêm mao phủ mỏng, có khả năng di động, tế bào đứng đơn độc hoặc xếp thành chuỗi. Bacillus thurigiensis sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28 - 30ºC, pH 6,8 - 7,2. Tinh thể độc (crystal) do vi khuẩn Bt sản sinh còn được gọi là protein độc tố diệt côn trùng (insectisidal crystal proteins - IPCs). Tinh thể độc có bản chất protein, kích thước khoảng 0,6 x 0,02 µm với nhiều hình dạng như: hình ô van, hình lập phương, hình sao, hình trứng, hình kim... Tinh thể của đa số các chủng vi khuẩn Bt đều gây độc và tác động đặc hiệu với các loại côn trùng đích. 57 10.3. Nội dung thực hành 10.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu - Giống vi sinh vật: Các ống giống vi khuẩn Bacillus thurigiensis thuần khiết. - Sâu ăn lá: Chuẩn bị 2 loại sâu ăn lá cây lâm nghiệp hoặc cây nông nghiệp. Ví dụ: Sâu hại Dưa chuột, Dưa hấu thuộc loài Spodoptera litura Fabricius; sâu hại Cải bắp và Su hào thuộc loại sâu tơ Plutella xylostella Linnaeus. Tương ứng với mỗi loại sâu cần chuẩn bị ít nhất 30 cá thể sâu đồng đều về kích thước và tuổi sâu. - Thức ăn của sâu ăn lá: Tương ứng với loại sâu ăn lá được thu thập thì chuẩn bị loại lá là thức ăn cho loại sâu đó. Ví dụ thu thập sâu ăn lá Dưa chuột thì chuẩn bị thức ăn cho sâu là lá Dưa chuột. Lá tươi sau khi thu thập về được rửa sạch và để khô tự nhiên. - Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng lỏng nhân sinh khối vi khuẩn Bt. Thành phần Hàm lượng Cao thịt bò 10 g Peptone 10 g CaCl2 0,01 g KH2PO4 . 7H2O 0,02 g ZnSO4 . 7H2O 0,001 g Dịch chiết nấm men 5 g Glucose 10 g Dẫn nước tới 1.000 ml pH 7,0 Hóa chất được hòa tan vào nước và dẫn tới vạch định mức, điều chỉnh pH và phân phối môi trường dinh dưỡng vào các bình tam giác 250 ml (100 ml/bình). Khử trùng môi trường ở 118ºC trong 20 phút. - Thuốc nhuộm Fuchsin: 58 Trộn dung dịch 1 và 2 lại rồi pha loãng 5 lần. - Dụng cụ: đĩa petri, bình tam giác 250 ml, pipet, cốc đong, lam kính, lamen, panh, que cấy vi sinh vật - Thiết bị: box cấy vô trùng, máy lắc ổn nhiệt nuôi vi sinh vật, kính hiển vi, cân phân tích, cân điện tử, máy đo pH, nồi hấp khử trùng 10.3.2. Thực hiện thí nghiệm 10.3.2.1. Nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus thurigiensis Thao tác cấy giống cho nhân sinh khối vi khuẩn Bt được thực hiện trong box cấy. - Sử dụng que cấy vi sinh vô trùng lấy giống vi khuẩn Bt trong ống giống, cấy vào bình chứa môi trường dinh dưỡng lỏng. - Nuôi các bình giống vi khuẩn Bt trong máy lắc ở 28ºC, tốc độ lắc 220 vòng/phút trong 72h. 10.3.2.2. Quan sát hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của vi khuẩn Bacillus thurigiensis - Làm vết bôi sinh khối vi khuẩn trên lam kính. - Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuchsin đậm đặc trong 1 phút. - Rửa nhẹ bằng ethanol 10%, sau đó rửa với nước cất. - Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính x100. - Vẽ hình dạng tế bào, bào tử và tinh thể độc của vi khuẩn Bacillus thurigiensis (minh họa ở Hình 3). 59 Hình 10.1. Hình dạng bào tử và tinh thể độc của vi khuẩn Bacillus thurigiensis 10.3.2.3. Xác định khả năng diệt sâu ăn lá của vi khuẩn Bacillus thurigiensis - Sử dụng panh vô trùng gắp lá nhúng vào dịch môi trường dinh dưỡng chứa sinh khối vi khuẩn Bt đã được nhân lên. - Gắp lá ra khỏi môi trường, để ráo bớt dịch sau đó cho vào các đĩa petri. Trên thành đĩa petri ghi rõ chủng Bt, nồng độ pha loãng, ngày thí nghiệm... - Thả sâu vào các lô thí nghiệm với số lượng 10 sâu/đĩa. - Đậy các đĩa petri bằng vải màn thưa để đảm bảo môi trường trong đĩa luôn được thoáng khí. - Đặt các đĩa thí nghiệm trong phòng có nhiệt độ 25ºC. - Ở lô đối chứng, thức ăn của sâu được nhúng vào môi trường lên men vô trùng đã chuẩn bị sẵn (không có vi khuẩn Bt) và tiếp cho sâu ăn với lượng thức ăn và lượng sâu như tiến hành với các lô thí nghiệm có dịch Bt. - Theo dõi và thống kê số lượng sâu sống/chết; tình trạng sâu sau 24h, 48h, 72h ở tất cả các lô thí nghiệm. - Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức: 60 Trong đó: - A: Tỷ lệ (%) sâu chết; - C: Số sâu sống sót ở lô đối chứng; - T: Số sâu sống sót ở lô thí nghiệm. 10.4. Kiểm tra, đánh giá - Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/1 nhóm) phải thực hiện thành công các thí nghiệm: Nhân sinh khối vi khuẩn Bt, xác định hình dạng tế bào, bào tử và tinh thể độc của vi khuẩn Bt; xác định khả năng diệt sâu ăn lá của Bt. - Viết bài thu hoạch (làm tại lớp, 1 nhóm/1 bài). Trong bài thu hoạch trình bày rõ kết quả của các thí nghiệm: (i) Làm tiêu bản quan sát vi khuẩn Bt dưới kính hiển vi, xác định hình dạng tế bào, bào tử và tinh thể độc của vi khuẩn Bt. Kết quả thí nghiệm trình bày trong bảng: Tiêu bản Hình dạng tế bào Hình dạng bào tử Hình dạng tinh thể độc 1 2 3 (ii) Xác định khả năng diệt sâu ăn lá của vi khuẩn Bt, kết quả thống kê ở bảng: Loại sâu thí nghiệm % sâu chết theo thời gian Hình thái sâu bị diệt bởi Bt 24h 48h 72h Sâu 1 Sâu 2 61 - Hoàn thành các câu hỏi sau: + Cơ chế diệt sâu ăn lá của vi khuẩn Bt? + Đánh giá và rút ra kết luận về hiệu quả diệt sâu hại cây trồng của Bt? + Lợi ích của việc sử dụng thuốc trừ sâu Bt trong bảo vệ thực vật? + Để đẩy mạnh hơn nữa khả năng ứng dụng thuốc trừ sâu Bt trong bảo vệ thực vật và bảo vệ môi trường ở Việt Nam, theo anh/chị, các nhà khoa học cần làm gì? 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Kiều Hữu Ảnh (2010). Giáo trình vi sinh vật học thực phẩm. NXB Giáo dục Việt Nam. 2. Lương Đức Phẩm (2012). Giáo trình công nghệ lên men. NXB Giáo dục Việt Nam. 3. Ngô Đình Bính (2005). Thuốc trừ sâu vi sinh. NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội. 4. Nguyễn Văn Mùi (2001). Thực hành Hóa sinh học. NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội. 5. Trần Thanh Thủy (1998). Hướng dẫn thực hành Vi sinh vật học. NXB Giáo dục Việt Nam. 6. McNeil B, Harvey L (2008). Practical fermentation technology. John Wiley & Sons, Ltd. 7. Morello JA, Granato PA, Mizer HE (2003). Laboratory Manual and Workbook in Microbiology. The McGraw - Hill Companies. 8. Shen C, Zhang Y (2017). Food Microbiology Laboratory for the Food Science Student. Springer International Publishing AG.