Tạo dòng và xác định trình tự cdna mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin ở tôm sú (Penaeus Monodon) - Hoàng Thị Thu Yến

Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 87 - 92 87 TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ cDNA MÃ HÓA PEPTID KHÁNG KHUẨN TƯƠNG TỰ CRUSTIN Ở TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) Hoàng Thị Thu Yến1*, Kim Thị Phương Oanh2, Phạm Anh Tuấn3, Nông Văn Hải2 1 Đại học Thái Nguyên 2 Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 3 Tổng Cục Thủy sản, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Việt Nam TÓM TẮT Peptid kháng khuẩn (Antimicrobial peptide - AMP) được tìm thấy ở hầu hết các sinh vật sống, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch tự nhiên và thực hiện chức năng như là hàng rào đầu tiên chống lại các vi sinh vật xâm nhiễm. AMP cung cấp một lựa chọn tốt để phòng và trị các bệnh vi khuẩn truyền nhiễm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tạo dòng và xác định trình tự cDNA mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin (Crustin - like antimicroial peptide). Gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin có chiều dài 426 bp, mã hóa cho 141 amino acid. Kết quả so sánh trình tự nucleotid của gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin ở tôm sú cho thấy không có sự sai khác so với trình tự đã công bố có mã số EF654659. Tuy nhiên, chúng tôi thấy có 5 vị trí sai khác nucleotid so với trình tự công bố với mã số FJ539178: 91 G → C; 291 T → A; 311 G → A; 338 C → A và 342 C → A, sự sai khác trình tự nucleotid này dẫn đến sự sai khác trình tự amino acid ở 5 vị trí: 35 V → L; 108 D → E; 112V → I; 124 T → N; 125 D → E. Điểm đáng lưu ý là trình tự nucleotid của gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin này không có đoạn trình tự từ 128-142 (TTCCTGGAGTTGGAG). Trình tự gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin phân lập từ tôm sú Việt Nam được đăng ký trên GenBank với mã số HQ662560. Đoạn cDNA mã hóa peptid kháng khuẩn mà chúng tôi phân lập được là nguyên liệu tốt phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm làm sáng tỏ chức năng của peptid kháng khuẩn này. Từ khóa: Tôm sú, Penaeus monodon, miễn dịch, crustin, peptid kháng khuẩn. MỞ ĐẦU* Peptid kháng khuẩn (AMPs) là một đoạn peptid hoặc protein nhỏ có độ dài phân tử thấp khoảng 15-100 amino acid, chúng khác nhau về trình tự và cấu trúc. Các AMP được tìm thấy ở hầu hết các sinh vật sống, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch tự nhiên và thực hiện chức năng như là hàng rào đầu tiên chống lại các vi sinh vật xâm nhiễm [3], [5]. Hiện nay, để xử lý tác nhân gây bệnh là vi khuẩn ở tôm, thuốc kháng sinh và hóa chất là phương pháp chính được sử dụng. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là chi phí mua thuốc lớn, tồn dư kháng sinh có thể đe dọa đến sức khỏe cộng đồng, ảnh hưởng đến môi trường, đồng thời xuất hiện các mầm bệnh kháng thuốc và chúng có thể lây nhiễm cho con người [9]. * Tel: 0912. 896. 298; Email: yenhtt79@gmail.com Các AMP ở tôm được tổng hợp đầu tiên ở tế bào máu và giải phóng để đáp ứng lại sự lây nhiễm. Mô hình biểu hiện khác nhau của các AMP đã được đánh giá kết hợp với sự kích thích của nhiều nguồn bệnh. AMP có 3 họ peptid đại diện chính là: Penaeidin, crustin và yếu tố kháng khuẩn (ALF - anti- lipopolisaccharid factor). Phân tích trình tự nucleotid và amino acid đã phát hiện mỗi họ AMP của tôm có sự đa dạng về trình tự và có nhiều loại isoform, nhóm nhỏ. Hoạt tính sinh học của các AMP ở mỗi họ của tôm cũng được mô tả trong in vitro và in vivo khi nghiên cứu sử dụng các protein và peptid tái tổ hợp của chúng [9]. Ngoài ra, AMP khác được tìm thấy ở tôm có nguồn gốc từ hemocyanin, đoạn trình tự đầu C có hoạt tính kháng nấm. Tuy nhiên, cơ chế mà hemocyanin được phân tách và hoạt hóa vẫn chưa rõ ràng [4]. Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 87 - 92 88 Crustin là các peptid kháng khuẩn giàu cystein chứa một vùng WAP (whey acidic protein) ở đầu C [7], vùng WAP có chứa 50 gốc amino acid với 8 gốc cystein ở các vị trí xác định, chúng hình thành 4 liên kết disulfid [6]. Hiện có khoảng hơn 50 trình tự crustin đã được phân lập từ các loài giáp xác như tôm, cua Crustin có hoạt tính kháng các loại vi khuẩn Gram (-) [7], [9]. Ở họ tôm penaeid, các crustin đã được phát hiện ở nhiều loài tôm. Smith và đtg (2008) đã xếp họ crustin thành 3 loại: I, II và III trên cơ sở sự khác biệt trong tổ chức vùng giữa trình tự tín hiệu và vùng WAP (Whey acidic protein). Theo sự phân loại này, hầu hết các crustin thuộc loại II và một số ít thuộc loại III. So sánh trình tự amino acid loại II phát hiện hai nhóm nhỏ là: crustin II và peptid kháng khuẩn tương tự crustin (crustin-like antimicrobial peptide), 2 loại này khác nhau ở amino acid suy diễn của peptid tín hiệu và đoạn cystein ở giữa vùng giàu cystein và vùng WAP [6]. Crustin loại III được gọi là protein vùng WAP đơn (single WAP domain - SWDs) không chứa vùng giàu cystein và glycin nhưng có vùng giàu prolin-arginin giữa trình tự tín hiệu và vùng WAP [7]. Ở tôm sú, có 5 isoform của crustin loại III với chiều dài rất khác nhau đã được phân lập và đây là peptid đa dạng nhất trong họ AMP ở loài này [9]. Ở tôm sú, crustin loại II và III đã được tạo dòng và xác định trình tự [8]. Trong đó, gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin có chiều dài 716 bp, chứa 2 exon và 1 intron. Exon 1 có kích thước 38 bp gồm cả 5’UTR đến intron có kích thước 191 bp, sau đó đến exon 2 có kích thước 487 bp bao gồm cả vùng mã hóa và 3’UTR [2]. cDNA mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin có chiều dài 426 bp, mã hóa 141 amino acid (EF654659). Để góp phần tạo nguyên liện nghiên cứu sự đa dạng trong trình tự gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin và nghiên cứu chức năng, chúng tôi tiến hành tạo dòng gen này từ mẫu tôm sú Việt Nam. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu tôm bị bệnh đốm trắng tại Trạm Nghiên cứu thủy sản nước lợ, km10 đường cao tốc Hải Phòng - Đồ Sơn và các đầm nuôi tư nhân vùng lân cận. Ngay sau khi nhận tôm nguyên con, mô gan đã được tách riêng và bảo quản trong dung dịch nitơ lỏng. Phương pháp Tách chiết RNA tổng số, tinh sạch mRNA và tổng hợp cDNA Phương pháp tách chiết RNA tổng số, tinh sạch mRNA và tổng hợp cDNA được thực hiện theo mô tả của Hoàng Thị Thu Yến và đtg [1]. Nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin dựa trên trình tự gen đã được đăng ký trong ngân hàng Genbank với mã số EF654659. Để phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi thiết kế thêm đoạn nhận biết của enzym giới hạn SpeI- NdeI vào đầu 5’ mồi xuôi (Antmic- F1) và XhoI-BamHI vào đầu 3’ mồi ngược (Antmic- R426): Antmic-F1:5’- ACTAGTCATATGCTAAAGTTTGTA-3’ Antmic-R426:5’- CTCGAGGGATCCCTATCCCTGAGA-3’ Phản ứng RT-PCR được thực hiện bằng enzym Dream Taq DNA Polymeraza (Fermentas) với chu trình nhiệt như sau: 95oC -3 phút; (95oC -1 phút; 55oC -45 giây; 72oC - 45 giây) x 30 chu kỳ; 72o, 10 phút; kết thúc và giữ ở 4oC. Tách dòng gen và xác định trình tự gen Phương pháp tách dòng và xác định trình tự cDNA mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin đầy đủ được thực theo mô tả của Hoàng Thị Thu Yến và đồng tác giả [1]. Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 87 - 92 89 KẾT QUẢ K huếch đại gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin từ mẫu tôm sú Việt Nam Dựa trên cơ sở trình tự đoạn gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin đã công bố trên GenBank (EF654659), chúng tôi thiết kế mồi để nhân gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin hoàn chỉnh. Mẫu mRNA tách chiết và tinh sạch từ mô tim của tôm sú bị bệnh đốm trắng được dùng làm khuôn tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bằng cách sử dụng mồi Oligo(dT). Phản ứng RT-PCR sau đó được tiến hành với cDNA thu được. Sản phẩm RT-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. 1,0 0,5 0,25 3,0 6,0 kb M 1 Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm nhân gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin bằng kỹ thuật RT-PCR (M: Marker 1kb; 1: Sản phẩm RT-PCR) Kết quả ở hình 1 cho thấy sản phẩm RT-PCR nhân gen crustin-like antimicrobial peptide có kích thước khoảng 0,4 kb đúng với tính toán lý thuyết. Sản phẩm này được tinh sạch từ gel agarose và tách dòng phân tử. Tạo dòng gen mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự crustin Sản phẩm RT-PCR được gắn vào vector tách dòng pCR 2.1. Để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp chúng tôi sử dụng enzym giới hạn EcoRI, cho phép cắt gen crustin-like antimicrobial peptide (nếu có) ra khỏi vector. Kết quả phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp được thể hiện ở hình 2. Sau khi phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp bằng enzym EcoRI, kết quả điện di cho thấy mỗi plasmid bị cắt thành hai đoạn: một đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pCR2.1 (~3,9 kb) và một đoạn nhỏ hơn có kích thước 0,4 kb tương ứng với sản phẩm RT-PCR (Hình 1). Như vậy, bước đầu chúng tôi khẳng định các dòng plasmid này đã có gắn gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin. 0,25 0,5 1,0 3,0 6,0 kb M 1 2 3 4 5 Hình 2. Kết quả điện di kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RT-PCR trong vector tái tổ hợp (M: Marker 1kb, 1-5: Plasmid pCR2.1 mang gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin) Xác định và phân tích trình tự gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin Chúng tôi đã xác định trình tự của gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin đầy đủ được gắn với vector pCR2.1. Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi đã khẳng định được chắc chắn đoạn cDNA phân lập được là trình tự ORF hoàn chỉnh mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin. Gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin có kích thước 426 bp, mã hóa 141 amino acid và mã kết thúc là TAG (Hình 3). Khi so sánh trình tự nucleotid của gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin phân lập từ tôm sú Việt Nam với trình tự phân lập từ tôm sú Thái Lan đã đăng ký ở GenBank với mã số EF654659 không có sự sai khác trình tự nucleotid. Tuy nhiên, chúng tôi thấy có 5 vị trí sai khác nucleotid so với trình tự phân lập từ tôm sú Ấn Độ (FJ539178), đó là 91 G → C; 291 T → A; Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 87 - 92 90 311 G → A; 338 C → A và 342 C → A (số thứ tự theo trình tự gen phân lập từ tôm sú Việt Nam). Điểm đáng lưu ý là trình tự nucleotid gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin không có đoạn trình tự từ 128-142 (TTCCTGGAGTTGGAG). Trình tự gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin phân lập từ tôm sú Việt Nam được đăng ký trên GenBank với mã số HQ662560. Hiện nay, gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin được phân lập với số lượng ít, chỉ được phát hiện ở tôm sú, tôm thẻ chân trắng, tôm thẻ Trung Quốc và Ấn Độ. Để phân tích sâu hơn trình tự gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin thu được, chúng tôi đã so sánh trình tự amino acid của peptid này với các trình tự đã công bố ở họ tôm. Kết quả so sánh được thể hiện trên hình 4. Hình 3. Trình tự gen và amino acid suy diễn của gen mã hóa peptide kháng khuẩn tương tự crustin [---peptide tín hiệu---][----------------------------------------vùng giàu glycine------------------------------------- -- 10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AntmicVN MLKFVVLSVVAVAVVHAQDKGNADTRFLGGVGVPGGGVPGVGVPGVGGGFLPGV---- PGHGGVVP-------GGGGLLP ABV25095.1 ......................................................----........-------....... ACL97378.1 ..............................L........-----..........----........-------....... FE049920.1 .......A......A.....DK.G..LG..F....A.G-----VFP.A.GV...GGVF..A...F.GAGGIGP.P...I. ACV84092.1 ...............QS.----E......---.S..--------VA....V...----.....IA.-------------- AAZ76017.1 ..................N.--D.......--...----------.....V...----......A.VGGGLVP.....I. [vùng giàu cystein] [-------------------------------vùng WAP-----------------------------] 90 100 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.. AntmicVN GGQFECNYCRTRYGYVCCKPGRCPQIRDTCPGLRKGVPICRQDTDCFGSDKCCFDTCLNDTVCKPIVA GSQG ABV25095.1 ........................................................................ ACL97378.1 ...........................E........I......NE........................... FE049920.1 ..G.N......PV...........PV..V..ST.F.P.V....L..S......Y.V..E............. ACV84092.1 --G.....................PV......I.NRP.......E........Y.............L..E. AAZ76017.1 ..G.....................PV..V.....Q..................Y.V...........L..E. Hình 4. So sánh trình tự amino acid của peptid kháng khuẩn tương tự crustin ở tôm AntmicVN - peptide kháng khuẩn tương tự crustin được phân lập từ tôm sú Việt Nam, ABV25095.1 (phân lập từ tôm sú Thái Lan), ACL97378.1 (phân lập từ tôm sú Ấn Độ), FE049920.1 (phân lập từ tôm thẻ chân trắng ), ACV84092.1 (phân lập từ tôm thẻ Ấn Độ), AAZ76017.1 (phân lập từ tôm thẻ Trung Quốc), amino acid có nền xám là trình tự cystein bảo thủ trong họ crustin. ATGCTAAAGTTTGTAGTATTATCCGTTGTCGCTGTGGCTGTGGTACACGCGCAGGATAAAGGCAATGCCGATACTCGCTT 80 M L K F V V L S V V A V A V V H A Q D K G N A D T R F CCTAGGTGGAGTTGGAGTTCCTGGAGGTGGAGTTCCTGGAGTTGGAGTTCCTGGAGTTGGAGGTGGATTCCTGCCGGGGG 160 L G G V G V P G G G V P G V G V P G V G G G F L P G TTCCTGGGCATGGTGGCGTTGTTCCTGGAGGCGGTGGCCTTCTCCCTGGAGGTCAATTCGAGTGCAATTACTGCAGAACG 240 V P G H G G V V P G G G G L L P G G Q F E C N Y C R T AGGTACGGATACGTATGCTGCAAGCCCGGCAGGTGTCCACAGATTCGCGATACCTGCCCAGGCCTCAGAAAGGGTGTCCC 320 R Y G Y V C C K P G R C P Q I R D T C P G L R K G V P GATCTGCCGTCAGGACACTGACTGCTTCGGCTCCGACAAATGCTGCTTCGACACCTGCTTGAACGACACCGTCTGCAAAC 400 I C R Q D T D C F G S D K C C F D T C L N D T V C K CCATCGTGGCAGGTTCTCAGGGATAG 426 P I V A G S Q G * Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 87 - 92 91 Kết quả của hình 4 cho thấy, trình tự peptid kháng khuẩn tương tự crustin từ tôm của Việt Nam và Thái Lan không có sự sai khác trình tự amino acid. Tuy nhiên, trình tự amino acid của loại peptid này phân lập từ tôm sú Ấn Độ có 5 vị trí sai khác: 35 V → L; 108 D → E; 112V → I; 124 T → N; 125 D → E và không có đoạn trình tự GVGVP từ vị trí 45-49 (Số thứ tự theo trình tự peptid kháng khuẩn tương tự crustin trong nghiên cứu này), đoạn trình tự này cũng không có ở các loài tôm thẻ khác. Phân tích trình tự amino acid ở các vùng chức năng, chúng tôi thấy trình tự amino acid vùng peptid tín hiệu của peptid kháng khuẩn tương tự crustin có sự tương đồng hoàn toàn ở tôm sú và có sự sai khác amino acid thấp nhất so với trình tự ở các loài tôm khác. Các peptid kháng khuẩn mã hóa tương tự crustin ở các loài tôm khác nhau có sự sai khác nhiều nhất ở vùng giàu glycin, đặc biệt đoạn trình tự amino acid GGVF (60 - 63) có ở tôm thẻ chân trắng mà không phát hiện ở các loài tôm còn lại. Đoạn trình tự (72-78) chỉ có ở tôm thẻ chân trắng và tôm thẻ Trung Quốc. Ngoài ra, một số trình tự amino acid đặc trưng ở tôm sú thuộc về vùng này: ở vị trí 56, 88 amino acid của tôm sú là L và Q còn các loài còn lại tương ứng là V và G. Vùng giàu cystenin và WAP có 12 cystenin bảo thủ trong họ crustin [9]. Vùng WAP có các vị trí amino acid đặc trưng của tôm sú so với các loài tôm khác, đó là 105 P → Q, 106 V → I, 111 V → T, 134 F → Y. Như vậy, gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin có sự đa dạng về trình tự nucleotid và amino acid. Để biết được các vị trí sai khác đóng vai trò như thế nào cần có những nghiên cứu sâu hơn. KẾT LUẬN Chúng tôi đã tiến hành tạo dòng và xác định trình tự cDNA mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin từ mô gan của tôm sú nhiễm bệnh đốm trắng. Gen này có kích thước 426 bp mã hóa cho 141 amino acid. Trình tự gen mã hóa peptid kháng khuẩn đã được đăng ký trên Genbank với mã số HQ662560. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Hoàng Thị Thu Yến, Kim Thị Phương Oanh, Trần Trung Thành, Phạm Anh Tuấn, Nông Văn Hải (2010), "Phân lập và xác định trình tự hoàn chỉnh cDNA mã hóa syntenin liên quan đến đáp ứng miễn dịch đối với bệnh đốm trắng ở tôm sú (Penaeus monodon)", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(2), pp. 155-163. [2]. Amparyup P., Kondo H., Hirono I., Aoki T., Tassanakajon A. (2008b), "Molecular cloning, genomic organization and recombinant expression of a crustin-like antimicrobial peptide from black tiger shrimp Penaeus monodon", Mol Immunol, 45(4), pp. 1085-1093. [3]. Brown K. L., Hancock R. E. (2006), "Cationic host defense (antimicrobial) peptides", Curr Opin Immunol, 18(1), pp. 24-30. [4]. Destoumieux-Garzon D., Saulnier D., Garnier J., Jouffrey C., Bulet P., Bachere E. (2001), "Crustacean immunity. Antifungal peptides are generated from the C terminus of shrimp hemocyanin in response to microbial challenge", J Biol Chem, 276(50), pp. 47070-47077. [5]. Hancock R. E., Brown K. L., Mookherjee N. (2006), "Host defence peptides from invertebrates- -emerging antimicrobial strategies", Immunobiology, 211(4), pp. 315-322. [6]. Ranganathan S., Simpson K. J., Shaw D. C., Nicholas K. R. (1999), "The whey acidic protein family: a new signature motif and three- dimensional structure by comparative modeling", J Mol Graph Model, 17(2), pp. 106-113, 134-106. [7]. Smith V. J., Fernandes J. M., Kemp G. D., Hauton C. (2008), "Crustins: enigmatic WAP domain-containing antibacterial proteins from crustaceans", Dev Comp Immunol, 32(7), pp. 758-772. [8]. Smith V. J., Fernandes J. M., Kemp G. D., Hauton C. (2008), "Crustins: Enigmatic WAP domain-containing antibacterial proteins from crustaceans", Dev Comp Immunol 32, pp. 758-772. [9]. Tassanakajon A., Amparyup P., Somboonwiwat K., Supungul P. (2010), "Cationic antimicrobial peptides in penaeid shrimp", Mar Biotechnol (NY), 12(5), pp. 487-505. Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 87 - 92 92 SUMMARY CLONING AND SEQUENCING OF cDNA ENCODING CRUSTIN - LIKE ANTIMICROBIAL PEPTIDE IN PENAEUS MONODON Hoang Thi Thu Yen1*, Kim Thi Phuong Oanh2, Pham Anh Tuan3, Nong Van Hai2 1Thai Nguyen University 2Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology 3Directorate of Aquiculture, Ministry of Agriculture & Rural Development Antimicrobial peptides (AMPs), which are widely distributed in all living organisms, are important components of the innate immune system and function as a first line of defense against invading icroorganisms. Antimicrobial peptides provide a good alternative treatment for the control of infectious bacterial disease. In this study, we cloned and sequenced full length cDNA encoding crustin like antimicrobial peptide from WSSS infected black tiger shrimp. The ORF of crustin like antimicrobial peptide gene was 426 bp in length, and was predicted to encode a 141 amino acid. Alignment of the newly determined sequence and that of the GenBank (EF654659) showed that do not alter the nucleotides. However, we found that 5 nucleotides are different with FJ539178 accession number: 91 G → C; 291 T → A; 311 G → A; 338 C → A và 342 C → A. The nucleotide differences were found to result in 5 amino acid substitutions: 35 V → L; 108 D → E; 112V → I; 124 T → N; 125 D → E. Points of note, this crustin like antimicrobial peptide encoded gene without a nucleotide sequence fragment from 128-145 (TTCCTGGAGTTGGAG). Our sequence was submitted to GenBank with accession number HQ662560. The isolated cDNA is a good starting material for further elucidating the function of crustin like antimicrobial peptide. Key words: Black tiger shrimp, Penaeus monodon, immune, crustin, antimicrobial peptide. Ngày nhận bài: 16/8/2012, ngày phản biện:17/8/2012, ngày duyệt đăng: 10/10/2012 * Tel: 0912. 896. 298; Email: yenhtt79@gmail.com