Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 10: Các phương pháp phân tích DNA

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA Chương 10 Các phương pháp phân tích DNA • Chiết tách DNA • Các phương pháp định tính và định lượng sơ bộ acid nucleic • Kỹ thuật cắt, nối, lai DNA và ứng dụng • Các phương pháp xác định trình tự DNA • Kỹ thuật PCR Chiết tách vật liệu di truyền • Nguyên tắc chung: 3 bước – Phá vỡ tế bào: vật lý, hóa học – Chiết tách acid nucleic: Phenol-Chloroform – Kết tủa acid nucleic: cồn tuyệt đối • Các trường hợp cụ thể: – Plasmid: mục tiêu loại NST bằng sự khác nhau về cấu dạng - kích thước – ADN thực khuẩn: tủa phage bằng PEG, loại bỏ capsid – Tế bào Thực vật: phá tế bào bằng cách nghiền – Tế bào Động vật: phá tế bào bằng enzym - chất tẩy – ARN: bất hoạt RNase, tủa bằng LiCl 8M, loại ADN bằng DNase – Tủa lượng ADN nhỏ: độn bằng tARN – Tủa bằng isopropanol, tert-butanol, • Các kỹ thuật khác – Loại carbohydrat, lipid bằng CTAB – Thu hồi ADN bằng sắc ký hấp phụ Tinh chế acid nucleic • Siêu ly tâm, ly tâm phân đoạn – Gradient liên tục / không liên tục của cesium chloride (CsCl) – Gradient saccharose • Sắc ký – Sắc ký ái lực: sử dụng pha tĩnh là U-Sepharose hay oligodT- cellulose để tinh chế mARN. – Sắc ký lọc gel để tách các nucleotid tự do sau khi tạo mẫu dò đánh dấu. – Sắc ký trao đổi ion trên vi cột, áp dụng để thu hồi những lượng ADN rất nhỏ. – Sắc ký lỏng hiệu năng cao: dùng để tinh chế các oligonucletid tổng hợp (độ phân giải là 1 nucleotid), plasmid, phân tách các đoạn ADN. • Điện di: – Agarose – PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) Định tính - định lượng acid nucleic • Quang phổ kế: OD260nm – 50 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đôi – 40 μg/ml dung dịch ARN (hoặc ADN) sợi đơn – 30 μg/ml oligonucleotid (tới 70 base) – Kiểm tra độ tinh khiết bằng tỷ lệ OD260/230 hoặc OD260/280 , OD320nm • Điện di gel: phân tách acid nucleic bằng dòng điện trong gel – Định tính theo kích thước – Định lượng bằng so sánh với chuẩn Điện di Các enzym biến đổi acid nucleic • Enzym cắt hạn chế / methylase – Cắt ADN tại vị trí xác định – Tạo ra đầu dính hoặc đầu tù – Lưu ý tính tương thích khi cắt nối • Polymerase – ADN polymerase phụ thuộc ADN – Polymerase phụ thuộc ARN (hoặc ADN) – ADN Polymerase không phụ thuộc khuôn mẫu – ARN polymerase phụ thuộc ADN • Ligase – Nối hai đoạn ADN C-A-T-G-A-T G-T-A-G-T-A A-T-G-A-T-G T-A-G-T-A-C C-A-T-G-A G-T-A-G-T-A-C T-G-T-G-A-T-G A-C-T-A-C C-A-T-G-A G-T-A-G-T-A-C G-T-G-A-T-G A-C-T-A-C Nối được Nối được Không được Kỹ thuật lai acid nucleic • Là sự bắt cặp bổ sung đặc hiệu của hai phân tử acid nucleic mạch đơn G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T +  Các yếu tố ảnh hưởng – Nồng độ ADN và thời gian phản ứng – Nhiệt độ – Độ dài của các trình tự – Lực ion Kỹ thuật lai acid nucleic • Southern Blot: lai ADN • Northern Blot: lai ARN • Lai tại chỗ (in situ) • Mẫu dò (probe) • Hệ thống phát hiện – Phóng xạ – Enzym – Huỳnh quang B B B B B AP B AP B B B B B AP B B AP B AP B AP AP B AP B B B AP B B AP B AP B AP AP Chiết tách ADN vi khuẩn Gắn ADN vào màng Lai với đo ạ n d ò đánh d ấ u b ằ n g b i o t i n Streptavidin Alkaline phosphatase biotinyl hóa Cơ c h ấ t A l k a l i n e p h o s p h a t a s e Phát quang Đo ạ n d ò được đánh d ấ u b i o t i n ADN đích Màng Polymerase Kỹ thuật PCR • Nguyên lý: sao chép ADN in vitro – Trong điều kiện có sẵn nucleotid – Enzym polymerase sẽ kéo dài mạch ADN theo nguyên tắc bổ sung nếu đầu 3’-OH trống • Kỹ thuật PCR gồm 3 bước: – biến tính dsADN thành các sợi đơn nhờ nhiệt độ, – ủ các đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp đặc hiệu) với các ssADN, – enzym kéo dài các đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với khuôn mẫu. 3’-OH 5’-P 3’-OH 5’-P nucleotid PCR PCR - Các yếu tố kỹ thuật • Chương trình PCR – Biến tính khởi đầu: 95oC / 5-10 phút – Chu kỳ nhiệt: gồm 3 bước lặp lại 25-40 lần • Biến tính: 94-95oC / 30’-vài phút • Gắn mồi: 40-70oC (< Tm của mồi) / 30’-60’ • Kéo dài: 65-74OC / thời gian tùy theo độ dài khuôn – Kéo dài kết thúc: 72-74oC / vài lần thời gian kéo dài • Thành phần phản ứng: 20-100 µl – Khuôn mẫu – Mồi (oligo 15-30 nucleotid, được thiết kế đặc hiệu) – Đệm có nồng độ Mg++ thay đổi (cần tối ưu hóa) – dNTP: A, T, G và C – DNA polymerase chịu nhiệt Ưu nhược điểm và các biến thể • Ưu – Nhanh, Đơn giản, Nhạy, Đặc hiệu • Nhược – Phải biết trình tự 2 đầu để thiết kế mồi – Ngoại nhiễm  mất tính đặc hiệu • Biến thể – Nested PCR (tổ): dùng 2 bộ mồi  tăng tính đặc hiệu, nhạy khi khuôn mẫu không tốt – Multiplex PCR: dùng nhiều bộ mồi của nhiều khuôn mẫu trong một phản ứng – RT-PCR: khuôn mẫu ARN – Realtime-PCR: PCR song song với phát hiện sản phẩm – Ứng dụng PCR • Tạo đoạn ADN mong muốn • Giải trình tự • Gây đột biến • Chẩn đoán, Phát hiện và định danh sinh vật • Xác định quan hệ di truyền • Nhận dạng tội phạm, Phương pháp giải trình tự Sanger • Phương pháp enzym/dideoxy: dựa vào sự ngừng tổng hợp ADN khi gặp phải dideoxy nucleotid (Frederick Sanger) • Qui trình: – Thực hiện 4 phản ứng PCR riêng biệt với 1 mồi: 1. A: có dNTP + ddATP 2. T: có dNTP + ddTTP 3. G: có dNTP + ddGTP 4. C: có dNTP + ddCTP – Mỗi ống sản phẩm được nạp vào một giếng điện di – Kết quả điện di được đọc  trình tự Đọc kết quả Phương pháp Sanger 5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’ ddG ddA ddT ddC 5’ 3’ Kỹ thuật tự động mới nhất (Harold Swerdlow) • Các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau • Thực hiện một phản ứng PCR duy nhất với sự hiện diện của các dNTP và ddNTP • Sử dụng điện di mao quản để tách sản phẩm • Đọc kết quả bằng đầu dò laser Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert • Phương pháp hóa học: dựa vào sự thủy giải đặc trưng của ADN (Allan Maxam và Walter Gilbert) • Qui trình: – Tạo ADN sợi đơn từ đoạn ADN cần giải trình tự – Đánh dấu các phân tử ADN ở một đầu – Thực hiện 4 (hoặc 5) ống phản ứng riêng biệt: 1. G: + dimethyl sulphate  Guanine bị methyl hóa 2. AG: + formic acid  Adenin và Guanine bị methyl hóa 3. TC: + Hydrazine  biến đổi Thymin và Cytosin 4. C: + Hydrazine + 1,5 M NaCl  biến đổi Cytosin – Xử lý 4 ống trên với piperidine 1M/90oC để cắt ADN ở liên kết phosphat kế nucleotid bị biến đổi 5. A>C: NaOH 1,2N/90oC cắt ADN ở Adenin > Cytosin – Mỗi ống được nạp vào một giếng điện di – Kết quả điện di được đọc và biện luận  trình tự Tạo sợi ADN đơn Đánh dấu bằng P32 Cắt tại các base đặc hiệu Phản ứng tại G Phản ứng tại C Phản ứng tại A/T Phản ứng tại T/C ADN cần giải trình tự Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert G A/G T/C C 5’ 3’ Tách theo kích thước Kích thước của sản phẩm (số nucleotid) Điện di Phóng xạ ký Đọc trình tự 394 Ưu nhược điểm của Maxam-Gilbert • Ưu: – Giải trình tự không cần mồi • Nhược: – Chậm – Độc hại – Năng suất thấp – Không tự động hóa được Pyrosequencing • Được phát triển bởi Pål Nyrén và Mostafa Ronaghi tại Royal Institute of Technology, Thụy Điển, năm 1996 • Dựa vào phát hiện sự phóng thích pyrophosphate khi nucleotide được gắn vào • Thành phần phản ứng: – ADN sợi đơn – Mồi – Các enzym: DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase và apyrase, – Các cơ chất adenosine 5´ phosphosulfate (APS) và luciferin