Phát triển phương pháp multiplex - PCR phát hiện vi khuẩn chlamydia trachomatis

TCNCYH 83 (3) - 2013 27 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX - PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN CHLAMYDIA TRACHOMATIS Nguyễn Ngọc Chỉnh1, Phạm Đăng Bảng2, Trần Hậu Khang2, Đặng Xuân Nghiêm1 1Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 2Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu được tiến hành nhằm phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn Chlamydia trachomatis. Các mẫu bệnh được khảo sát là của các bệnh nhân tới khám chữa bệnh tại bệnh viện Phụ sản Bắc Giang từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2011. Điều kiện tối ưu của phản ứng PCR nhằm phát hiện các đoạn DNA đặc thù của Chlamydia trachomatis bằng 5 cặp mồi CtP, CtM, CtR, NO, Chlamp và cặp mồi đối chứng dương AR, đã được khảo sát và cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu của từng cặp mồi nằm trong khoảng từ 53oC đến 57oC. Đồng thời, điều kiện tối ưu cho phản ứng Multiplex PCR với 4 cặp mồi: CtP, NO, Chlamp và AR đã được xác định là 56oC. Kết quả khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh ở các bệnh nhân đến khám phụ khoa ở bệnh viện Phụ sản Bắc Giang cho thấy có 31 mẫu dương tính trong số 251 mẫu nghiên cứu, chiếm 12,35%. Từ khóa: chẩn đoán nhanh, Chlamydia trachomatis, Multiplex PCR Địa chỉ liên hệ: Đặng Xuân Nghiêm, khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Email: dxnghiem@hua.edu.vn Ngày nhận: 12/01/2013 Ngày được chấp thuận: 20/6/2013 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh nhiễm khuẩn đường sinh dục do vi khuẩn Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) là bệnh phổ biến trên toàn Thế giới và có mức độ lây nhiễm cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, mỗi năm có khoảng 90 triệu người mắc bệnh do nhiễm vi khuẩn này. Nhiễm C. trachomatis là nguyên nhân gây viêm vùng chậu, với khoảng 80% nữ giới và 70% nam giới nhiễm C. trachomatis không biểu hiện triệu chứng, đây là nguyên nhân bệnh lây bệnh ra cộng đồng [1]. Vi khuẩn C. trachomatis là vi khuẩn kí sinh nội bào, bệnh ít biểu hiện ra bên ngoài nên cần có biện pháp phát hiện nhanh vi khuẩn để có biện pháp chữa kịp thời tránh gây biến chứng cho các bệnh nhân. Việc sử dụng các cặp mồi đã nghiên cứu và công bố trên thế giới để phát triển thành kít phát hiện vi khuẩn C. trachomatis ở các bệnh nhân là phương pháp có độ chính xác cao. Ratti và cộng sự (1991) dùng cặp mồi Chlamp để xác định vi khuẩn C. trachomatis [2]. Năm 1993, Roosendaal và cộng sự đã so sánh độ nhạy của phương pháp chuẩn đoán bằng PCR, sử dụng 4 cặp mồi AR, CtM, CtR, CtP để xác định vi khuẩn C.trachomatis [3]. Đến năm 2006, Viroj cùng các cộng sự đã dùng cặp mồi NLO để xác định các mẫu bệnh [1]. Mục tiêu nghiên cứu nhằm khảo nghiệm, tối ưu hóa việc ứng dụng các cặp mồi đã công bố để phát hiện vi khuẩn C. trachomatis bằng phương pháp PCR; phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện vi khuẩn C. trachomatis và xác định tỷ lệ nhiễm C. trachomatis tại Bắc Giang bằng phương pháp multiplex PCR. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng 20 mẫu DNA của vi khuẩn C. trachomatis thu thập và tách chiết tại Bệnh viện Da liễu Trung Ương được sử dụng để tối ưu hóa phản ứng PCR, 251 mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân nữ đến khám phụ khoa tại bệnh viện Phụ sản Bắc Giang tình nguyện tham gia 28 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nghiên cứu từ ngày 15/03/2011 đến ngày 13/05/2011. 2. Phương pháp 2.1. Phương pháp thu thập mẫu Mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân nữ tham gia nghiên cứu được thu thập qua hai dạng: nước tiểu và mẫu quệt cổ tử cung. Mẫu được bảo quản trong ống eppendorf có đệm PBS (Phosphate-buffered saline) và ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút trong 4oC để thu các tế bào trong mẫu bệnh. Sau đó các tế bào được rửa bằng đệm PBS và bảo quản ở - 20oC. 2.2. Phương pháp tách chiết DNA Phương pháp sử dụng Trizol: 200 µl mẫu được trộn đều với 900 µl dung dịch Trizol pH 8, vortex 30 giây, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, 200µl chloroform được thêm vào và trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong ống eppendorf chuyển thành màu trắng đục, hỗn hợp được ly tâm ở 4oC, 13000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch nổi được chuyển vào ống eppendorf mới có sẵn 600µl isopropanol lạnh, trộn đều và ủ -20oC 30 phút. DNA được thu bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút và rửa bằng 900µl ethanol 70%, để khô ethanol ở nhiệt độ phòng và hòa tan bằng 50µl dung dịch đệm TE 10mM, pH 8. Mẫu DNA được bảo quản ở - 20oC [4]. Phương pháp sử dụng proteinase K và phương pháp đun sôi được tiến hành theo nghiên cứu của Jenab và cộng sự (2010) [5]. 2.3. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR, Multiplex PCR Bảng 1. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu Vị trí đoạn gen được nhân Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Kích thước (bp) Nhiễm sắc thể vi khuẩn Chlamp - 1 CCAAAGCTATTCAAAATCGGAGCTCTAAGA 610 - 612 Chlamp - 4 GTCTTCTGCTTACAATGCTCTTGCATATTA NLO ATGAAAAAACTCTTGAAATCG 1128 NRO CTCAACTGTAACTGCGTATTT DNA người AR1 GGCGGTGACGGAGCTGGGGCG 153 AR2 CGCCGCTGCACTGTGAAGCTC Plasmid CtP1 TAGTAACTGCCACTTCATCA 201 CtP2 TTCCCCTTGTAATTCGTTGC Gen MOMP trên NST vi khuẩn CtM1 GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCCTC 129 CtM2 CCAAGTGGTGCAAGGATCGCA Riboxôm CtR1 GTGGATAGTCTCAACCCTAT 310 CtR2 CCCTAAGTGTTGGCAACTAA TCNCYH 83 (3) - 2013 29 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Để đánh giá độ nhạy và tiềm năng xác định mẫu bệnh phẩm có nhiễm vi khuẩn C. tracho- matis bằng phản ứng PCR, 5 cặp mồi nghiên cứu và cặp mồi đối chứng dương đã được sử dụng (bảng 1). Mỗi cặp mồi nhân các đoạn DNA khác nhau của vi khuẩn C. trachomatis, ngoại trừ cặp AR là đối chứng dương trong phản ứng PCR, nhân một trình tự của HLA người - đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên bạch cầu HLA lớp 2 trong tế bào người. Trong mỗi xét nghiệm, đoạn DNA sản phẩm do cặp mồi AR phải luôn được nhân lên để xác định DNA được tách từ mẫu bệnh phẩm thành công. Đồng thời, DNA khuôn tách chiết từ các mẫu của người đã biết chắc chắn mang bệnh và không mắc bệnh cũng được chạy cùng như một đối chứng dương và âm tương ứng. Cặp mồi Chlamp, NO nhân đoạn DNA trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn [6; 7], cặp mồi CtP nhân đoạn DNA trên plamid 7,5 kb phổ biến, CtR nhân đoạn DNA của gen mã hóa riboxôm 16S, cặp mồi CtM nhân đoạn DNA không biến đổi của gen mã hóa protein trên màng tế bào của vi khuẩn C. trachomatis [3]. Thành phần PCR: PCR buffer (50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris - HCl pH = 8,3); 200 µM mỗi loại dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP); 50 pmol cho mỗi mồi và 1 U Taq poly- merase. Trong phản ứng Multiplex PCR, để phản ứng tối ưu, mỗi phản ứng Multiplex PCR cũng có 200 µM mỗi loại dNTP, 1,5 mM MgCl2 và 50 pmol cho mỗi mồi. Chu trình nhiệt: 95oC 5 phút, 95oC 1 phút, 50 - 60oC 2 phút, 72oC 1,5 phút, lặp lại 35 chu kỳ, kết thúc 72oC trong 10 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2,5%. 2.4. Khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh ở Bắc Giang Nghiên cứu tiến hành khảo sát 251 mẫu bệnh thu thập tại bệnh viện Phụ sản Bắc Giang. Các mẫu bệnh được tách chiết DNA và chạy multiplex PCR. Nếu phản ứng multiplex PCR dương tính thì mẫu bệnh có chứa vi khuẩn C. trachomatis, nếu không phản ứng mẫu bệnh được kết luận không chứa vi khuẩn gây bệnh. III. KẾT QUẢ 1. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu bệnh DNA tổng số của các mẫu bệnh được tách chiết theo 3 phương pháp khác nhau: phương pháp sử dụng Trizol, phương pháp sử dụng protein K và phương pháp đun sôi. Nồng độ và chất lượng DNA tổng số đã được kiểm tra bằng máy đo quang phổ hấp thụ và điện di. Kết quả của nhiều thí nghiệm lặp lại cho thấy phương pháp sử dụng Trizol cho chất lượng và số lượng DNA tốt nhất. Ngoài ra, mẫu bệnh phẩm là tế bào thu từ ly tâm nước tiểu cho kết quả tách chiết kém hơn so với mẫu dịch tiết cổ tử cung. Độ nhạy khi xét nghiệm các bệnh phẩm bằng nước tiểu thấp hơn nhiều so với bệnh phẩm là mẫu quệt cổ tử cung. 2. Kết quả kiểm nghiệm điều kiện tối ưu để chạy mỗi cặp mồi Mỗi cặp mồi nghiên cứu nhân các đoạn DNA khác nhau có kích thước khác nhau. Qua khảo sát với các DNA khuôn từ mẫu bệnh đối chứng dương tách chiết bằng kít chuẩn IVApDNA Extraction Kit - Code VA.A92- 002A, các điều kiện khác nhau về thành phần Mg2+, hàm lượng dNTP, thời gian bắt cặp của các cặp mồi cho ta thấy kết quả khác nhau không có ý nghĩa. Tuy nhiên, hình 1 cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu của mỗi cặp mồi là khác nhau. 30 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 1. Sản phẩm PCR của các cặp mồi nghiên cứu Nhiệt độ tối ưu cho các cặp mồi đã được nghiên cứu và lựa chọn dựa theo các nghiên cứu của Ratti cùng cộng sự (1991), Roosen- daal cùng cộng sự (1993), Viroj cùng cộng sự (2006). Trong nghiên cứu này, nhiệt độ tối ưu đã được xác định lại riêng cho từng cặp mồi như sau: cặp mồi AR, NO, CtR, CtM có nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 55oC, cặp mồi Chlamp có nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 53oC và cặp mồi CtP có nhiệt độ gắn mồi tốt nhất ở 57oC. Như vậy, nhân tố nhiệt độ bắt cặp ảnh hưởng mạnh tới kết quả của phản ứng PCR. Hình 1 còn cho thấy, ngoại trừ mồi AR, các cặp mồi nghiên cứu đều rất nhạy và cho ra các sản phẩm rõ nét, đúng kích thước. Sản phẩm PCR của 5 cặp mồi cũng đã được khẳng định là DNA của C. trachomatis bằng việc cắt bằng enzyme giới hạn thích hợp và giải trình tự. Việc khảo sát này được thực hiện nhằm tìm ra các cặp mồi tốt nhất, có nhiệt đội gắn mồi tối ưu gần giống nhau để dùng trong phản ứng multiplex PCR. 3. Kết quả multiplex PCR Dựa vào kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi và kích thước sản phẩm PCR, phản ứng multiplex PCR được tiến hành xây dựng để phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn C. trachomatis. 4 cặp mồi, AR, CtP, Chlamp và NO, có nhiệt độ gắn mồi gần giống nhau được chọn để chạy phản ứng multiplex PCR. Nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR được khảo sát lại ở dải nhiệt độ từ 47oC tới 56oC và kết quả được thể hiện trong hình 2. Hình 2. Sản phẩm phản ứng Multiplex PCR với 4 cặp mồi: AR, CtP, Chlamp và NO M: Thang DNA 100 bp; 1: 47oC; 2: 50oC; 3: 53oC; 4: 56oC TCNCYH 83 (3) - 2013 31 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Nhiệt độ gắn mồi tốt nhất cho phản ứng Multiplex PCR là 56oC. 4. Kết quả khảo sát các mẫu bệnh từ bệnh viện Phụ sản Bắc Giang Trong nghiên cứu này, có 251 mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân được thu thập. Căn cứ vào nhóm tuổi, tình trạng hôn nhân, quê quán và nghề nghiệp, các bệnh nhân được phân ra nhiều các nhóm nhỏ khác khác nhau theo đặc điểm trên. Đáng ngạc nhiên là các phản ứng multiplex PCR với các mẫu nghiên cứu hoặc cho sản phẩm đầy đủ của các cặp mồi thành phần với độ nét cao hoặc không có bất kỳ sản phẩm nào ngoài DNA do cặp mồi AR nhân lên. Kết quả này có sự khác biệt với công bố của Roosendaal cùng cộng sự (1993) rằng cặp mồi CtP có độ nhạy cao hơn các cặp mồi khác. Kết quả phản ứng multiplex PCR phát hiện ra 31 mẫu trong tổng số 251 mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu có kết quả dương tính, chiếm 12,35%. Hình 3. Tỷ lệ các bệnh nhân dương tính với phản ứng Multiplex PCR theo lứa tuổi, nơi sống, tình trạng hôn nhân và nghề nghiệp 32 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC IV. BÀN LUẬN Phát triển phản ứng multiplex PCR Hiện nay, phương pháp nuôi cấy các vi khuẩn C. trachomatis trong các tế bào nuôi cấy là một phương pháp cho kết quả chính xác và là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán C. trachomatis. Tuy nhiên, việc phải vận chuyển bệnh phẩm tới các phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn và chi phí cao cho quá trình nuôi cấy là nhược điểm của phương pháp này [7]. Phương pháp phát hiện kháng nguyên như miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (Direct Immunofluorescence (DIF)) và miễn dịch gắn men (Enzyme - Immunoassays (EIA)) là các phương pháp xét nghiệm được sử dụng rộng rãi nhất mà không cần nuôi cấy C. tracho- matis. Gần đây, các kỹ thuật lai DNA đã được giới thiệu. Tuy nhiên, khi so sánh với các phương pháp khác trong điều kiện tối ưu, các phương pháp xét nghiệm này có độ nhạy thấp. Hơn nữa, kỹ thuật DIF là một kỹ thuật khó, đòi hỏi kinh nghiệm cao, còn EIA có thể kém đặc hiệu, do việc phát hiện kháng nguyên thường xảy ra phản phản ứng chéo [8]. Phương pháp multiplex - PCR là một phương pháp có độ nhạy và độ tin cậy cao trong việc phát hiện chính xác vi khuẩn C. trachomatis trong các mẫu bệnh phẩm nhưng kết quả xét nghiệm còn phụ thuộc vào loại mẫu bệnh phẩm và cách xử lý mẫu. Theo tác giả Vũ Tuấn Anh (2003), trong mẫu nước tiểu có rất ít vi khuẩn Chlamydia trachomatis do vậy mẫu DNA tách chiết từ mẫu bệnh nước tiểu có nồng độ DNA thấp hoặc có thể không có chứa DNA [9]. Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh phẩm nước tiểu có kết quả tách chiết DNA kém hơn so với mẫu dịch tiết cổ tử cung. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Vũ Tuấn Anh. Nhiệt độ 56oC là tối ưu cho sản phẩm PCR rõ nhất với cả 4 cặp mồi đã được lựa chọn là AR, CtP, Chlamp và NO. Hai cặp mồi CtM và CtR cũng đã được khảo sát khi thêm vào hỗn hợp mồi cho phản ứng multiplex PCR nhưng chúng cho băng điện di không rõ nét ở các phản ứng nên không được sử dụng cho nghiên cứu. Sản phẩm nhân lên là các đoạn DNA nằm trong plasmid và nhiễm sắc thể của vi khuẩn C. trachomatis do mồi CtP, Chlamp, No nhân lên có kích thước theo thứ tự là: 610 - 612 bp, 1128 bp, 201 bp. Mồi AR nhân lên đoạn DNA người có kích thước 153 bp. Do các sản phẩm này đã được xác thực như đã nói ở trên bằng việc giải trình tự và cắt enzyme giới hạn thích hợp nên có thể kết luận phản ứng multiplex PCR này giúp phát hiện nhanh sự nhiễm vi khuẩn C. trachomatis một cách chính xác và sẽ được áp dụng để tiến hành khảo sát các bệnh nhân tham gia nghiên cứu. Tỷ lệ nhiễm bệnh của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu ở Bắc Giang Để giảm thiểu sai sót kỹ thuật có thể xảy ra trong chuẩn đoán bằng phản ứng PCR với từng cặp mồi đơn lẻ và để tiết kiệm thời gian cũng như hóa chất xét nghiệm, phản ứng multiplex PCR với 4 mồi và DNA khuôn tách chiết bằng trizol kể trên được sử dụng để phát hiện vi khuẩn C. Trachomatis trong các mẫu bệnh phẩm của tình nguyện viên ở Bắc Giang, số bệnh nhân dương tính cao hơn so với các nghiên cứu của các tác giả trong nước. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Huyền năm 2002, tỷ lệ nhiễm C. trachomatis ở phụ nữ có hội chứng tiết dịch âm đạo là 10,5% [10]. Năm 2002, Nguyễn Thị Ngọc Yến và Trần Hậu Khang nhận thấy tỷ lệ nhiễm C. trachomatis trong số bệnh nhân mang bệnh lây truyền qua đường sinh dục tại viện Da liễu Quốc gia là 9,5% [6]. Nguyên nhân tỷ lệ nhiễm C. trachomatis trong nghiên cứu này cao hơn các nghiên cứu trước có thể được giải thích do đa số các bệnh nhân ở Bắc Giang khi có TCNCYH 83 (3) - 2013 33 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC biểu hiện bệnh mới tới các cơ sở khám chữa bệnh để khám và điều trị. Đây là thói quen không tốt gây tốn kém cho điều trị và gây ra nhiều di chứng về sau. Nhóm tuổi: Tuổi là yếu tố quan trọng tới các bệnh do vi khuẩn C. trachomatis. Bệnh lây nhiễm mạnh ở độ tuổi sinh hoạt tình dục nhiều. Độ tuổi này khác nhau giữa các quốc gia, các vùng khác nhau. Trong nghiên cứu này cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất thuộc lứa tuổi 25 - 35 với tỷ lệ 15,2% và sau đó là độ tuổi dưới 25 với tỷ lệ là 10,9%. Số liệu cho thấy phụ nữ trẻ tuổi có tỷ lệ nhiễm bệnh cao. Kucinskiene và cộng sự (2006) tổng hợp các nghiên cứu về C. trachomatis trong khoảng thời gian từ 1998 đến 2005 thấy rằng tỷ lệ nhiễm C. trachomatis cao nhất là ở phụ nữ trẻ tuổi, đặc biệt là ở thanh thiếu niên nữ do cổ tử cung chưa phát triển hoàn chỉnh, rất dễ nhạy cảm với C. trachomatis [11]. Tình trạng hôn nhân: Tình trạng hôn nhân là yếu tố được các nghiên cứu trên thế giới nhấn mạnh là có liên quan đến tỷ lệ nhiễm C. trachomatis. Đối tượng phụ nữ độc thân có nguy cơ nhiễm C. trachomatis cao gấp 3,6 lần so với nhóm có gia đình. Còn nghiên cứu của Romoren tại Botswana trên các đối tượng phụ nữ có thai thấy rằng phụ nữ độc thân có nguy cơ nhiễm C. trachomatis cao gấp tới 6,9 lần so với phụ nữ đã có gia đình [2]. Trong nghiên cứu này, nhóm bệnh nhân độc thân có tỷ lệ nhiễm C. trachomatis là 15,9%, cao hơn nhóm bệnh nhân đã có gia đình. Nghề nghiệp: Nhóm công nhân là nhóm có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất với 19,4%, tiếp sau đó là nhóm nông dân với 10,7% và thấp nhất là nhóm học sinh, sinh viên. Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh do nhiễm C.trachomatis thuộc nhóm công nhân cao nhất (19,4%). Kết quả này có thể được lý giải là do lối sống tập trung và trình độ nhân thức về cách phòng trừ, điều trị bệnh chưa cao. Địa bàn sinh sống: Bệnh nhiễm khuẩn đường tình dục do vi khuẩn C. trachomatis thường gặp ở vùng thành thị, trung tâm công nghiệp nhiều hơn ở nông thôn: Khu vực sống ở thành phố có tỷ lệ nhiễm là 16,5% cao hơn hẳn so với tỷ lệ nhiễm bệnh của các huyện lẻ trong tỉnh. V. KẾT LUẬN Phương pháp sử dụng Trizol cho lượng sản phẩm DNA không bị đứt gãy và nồng độ cao. Nhiệt độ tối ưu của các cặp mồi là khác nhau: cặp mồi AR, CtM, NO có nhiệt độ tối ưu là: 55oC, cặp mồi CtR, Chlamp có nhiệt độ tối ưu là: 53oC, cặp mồi CtP có nhiệt độ tối ưu là: 57oC. Phản ứng multiplex PCR với 4 trong tổng số 6 cặp mồi được chọn, CtP, NO, Chlamp và AR, với nhiệt độ tối ưu 56oC cho độ nhạy cao và đồng đều. Tại bệnh viện phụ sản Bắc Giang, có 31 mẫu trong tổng số 251 mẫu bệnh phẩm nghiên cứu dương tính với C. trachomatis chiếm tỷ lệ 12,35%. Tỷ lệ trung bình ở thành phố Bắc Giang cao hơn ở các huyện lẻ, đối tượng chưa có gia đình cao hơn có gia đình và độ tuổi < 30 có tỷ lệ nhiễm cao hơn so với các lứa tuổi khác. TÀI LIỆU KHAM KHẢO 1. Viroj, W. (2006). PCR Test for Detection of Chlamydia trachomatis Using NLO and NRO Primers, a Re-evaluation, Sexuality and Disability. 24 (4), 217 - 221. 2. Ratti G., Moroni A., Cevenini R., (1991). Detection of Chlamydia trachomatis DNA in patients with non-gonococcal urethritis using the polymerase chain reaction, J Clin Pathol. 44(7), 564 - 568. 3. Romoren M., Sundby J., Manonmany V., et al (2007). Chlamydia and gonorrhoea in pregnant Batswana women: time to discard 34 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC the syndromic approach, BMC Infectious Dis- eases. 7, 27. 4. Chomczynski P, Sacchi N., (1987). Single - step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate - phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 162(1), 156 - 159. 5. Jenab A., Roghanian R., Golbang N., et al (2010). Comparison of three methods of DNA extraction in endocervical specimens for Chlamydia trachomatis infection by spectro- photometry, agarose gel, and PCR, Arch Im- munol Ther Exp (Warsz), 58(3), 227 - 234. 6. Nguyễn Thị Ngọc Yến, Trần Hậu Khang (2002). Điều trị nhiễm trùng đường sinh dục do Chlamydia trachomatis bằng Zithromax, Y học thực hành, 471(3), 27 - 29. 7. Ridgway GL, Taylor-Robinson D, (1991). Current problems in microbiology: 1 Chlamydia infections: which laboratory test J Clin Pathol. 44, 1 - 5. 8. Roosendaal, R., Walboomer,s J.M.M., Veltman, O.R., et al (1993). Comparison of dif- ferent primer sets for detection of Chlamydia trachomatys by the polymerrase chain reaction, J. Med. Microbio1, 38, 426 - 433. 9. Vũ Tuấn Anh (2003). Tình hình, đặc điểm lâm sàng và giá trị chẩn đoán của PCR trong nhiễm Chlamydia trachomatis đường sinh dục, Luận văn Thạc sỹ Y học,Học viện Quân Y. 10. Nguyễn Thị Thanh Huyền (2002). Nghiên cứu tình hình nguyên nhân và đặc điểm lâm sàng hội chứng tiết dịch đường sinh dục dưới ở phụ nữ đến khám lại Viện Da liễu, Luận văn Thạc sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội. 11. Kucinskiene V., Sutaite I., Vali- ukeviciene S et al (2006). Prevalence and risk factors of genital Chlamydia trachomatis infection, Medicina (Kaunas), 42(10), 885 - Summarry OPTIMIZE MULTIPLEX-PCR CONDITIONS FOR QUICK AND RELIABLE DETECTION OF CHLAMYD