Nhân dòng gen và vùng promoter Ubiquitin từ cây ngô (Zea mays L.) - Nguyễn Đức Thành

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 114-121 114 NHÂN DÒNG GEN VÀ VÙNG PROMOTER UBIQUITIN TỪ CÂY NGÔ (ZEA MAYS L.) Nguyễn Đức Thành*, Lê Hoàng Đức Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *nguyenducthanh_pcg@ibt.ac.vn TÓM TẮT: Ubiquitin là một protein trong tế bào nhân thực và trình tự của nó có tính bảo thủ cao, ubiquitin tham gia vào nhiều quá trình của tế bào như: cân bằng giữa tổng hợp và thoái biến protein, cấu trúc chromatin, điều hành chu kỳ tế bào, sửa chữa DNA và phản ứng với sốc nhiệt và các stress khác. Gen mã hóa cho protein này (gen Ubiquitin) và promoter Ubiquitin đã được nhân dòng và nghiên cứu đánh giá khả năng hoạt động từ nhiều đối tượng như lúa, ngô, lay ơn. Promoter Ubiquitin có vai trò quan trọng trong thể hiện gen ở cây một lá mầm. Trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu các kết quả về nhân dòng gen mã hóa cho protein Ubiquitin (gen Ubi) và promoter Ubiqitin từ dòng ngô H240 phục vụ cho nghiên cứu về công nghệ gen ở cây ngô. Các kết quả nhận được cho thấy các vùng như: vùng promoter, vùng phiên mã và hộp TATA của gen Ubi nhân dòng được từ dòng ngô H240 có độ tương đồng cao so với các chuỗi gen tương đồng cùng loài trong gemone thực vật. Gen Ubi đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen quốc tế với mã số JX947345.1. Kết quả nhận được trong nghiên cứu này sẽ góp phần đáng kể trong việc nghiên cứu và sử dụng promoter Ubiquitin trong chuyển gen ở các cây một lá mầm nói chung và cây ngô nói riêng. Từ khóa: Cây ngô, gen Ubiquitin, hộp TATA, mức độ tương đồng, promoter, vùng phiên mã. MỞ ĐẦU Ubiquitin là một protein trong tế bào nhân thực và trình tự của nó có tính bảo thủ cao, ubiquitin tham gia vào nhiều quá trình của tế bào như: cân bằng giữa tổng hợp và thoái biến protein, cấu trúc chromatin, điều hành chu kỳ tế bào, sửa chữa DNA và phản ứng với sốc nhiệt và các stress khác. Promoter là vùng trình tự nucleotide trong genome nằm ngược dòng về phía đầu 5’ của vị trí khởi đầu phiên mã gen (transcription start site-TSS). Promoter là thành phần quan trọng trong cấu trúc của tất cả các gen, khởi đầu cho sự phiên mã, đóng vai trò then chốt trong việc biểu hiện gen. Theo khả năng biểu hiện, promoter được chia làm hai loại chính: promoter không đặc hiệu hay còn gọi là promoter cơ định và promoter đặc hiệu bao gồm promoter đặc hiệu mô tế bào, đặc hiệu giai đoạn phát triển và promoter cảm ứng. Hiện nay, có rất nhiều promoter hiệu quả được sử dụng rộng rãi để điều khiển biểu hiện các gen ngoại lai trong cây trồng biến đổi gen như CaMV35S, CaMV19S, nopaline synthase (NOS) (promoter trên các cây hai lá mầm), hay Actin và Ubiquitin (promoter trên các cây một lá mầm). Promoter Ubiquitin đã được phân lập và nghiên cứu đánh giá khả năng hoạt động từ nhiều đối tượng như lúa, ngô, lay ơn [1, 3, 6]. Các nghiên cứu đã cho thấy khả năng hoạt động của promoter này cao gấp mười lần hoạt động của promoter CaMV35S khi điều khiển biểu hiện gen ngoại lai trên cây một lá mầm. Hoạt tính của promoter Ubiquitin trong lúa chuyển gen bằng các phương pháp chuyển qua tế bào trần và mô sẹo thông qua đánh giá mức độ biểu hiện của các gen chỉ thị và chọn lọc cho thấy promoter này biểu hiện mạnh nhưng không phải ở tất cả các mô cũng như tất cả các giai đoạn phát triển của cây lúa [2]. Nhìn chung, promoter Ubiquitin có hoạt tính mạnh trong các mô non có hoạt động trao đổi chất mạnh và ở hạt phấn hoa [9]. Trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu các kết quả về nhân dòng gen mã hóa cho protein Ubiquitin (gen Ubi) và promoter Ubiquitin từ dòng ngô H240 phục vụ cho nghiên cứu về công nghệ gen ở cây ngô. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Vật liệu nghiên cứu được sử dụng là các mẫu lá của dòng ngô H240 do Viện Nghiên cứu ngô cung cấp. Vector tách dòng pBT do Phòng Nguyen Duc Thanh, Le Hoang Duc 115 Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp. Phương pháp Thiết kế cặp mồi nhân gen Ubiquitin (Ubi) và promoter: thông tin về trình tự gen và promoter Ubiquitin được khai thác trên ngân hàng gen quốc tế thông qua trang Web NCBI. Dựa trên thông tin về gen polyUbiquitin1 (Ubi1) trên ngân hàng gen có mã số DQ141598.1 và sử dụng phần mềm Primer 3 [10] để thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho nhân gen Ubi. Xác định các vị trí cắt của enzyme giới hạn, vị trí bám của mồi và xác định các thông số kỹ thuật của mồi, như: nhiệt độ nóng chảy (Tm), tỷ lệ GC, chiều dài mồi bằng phần mềm NEBcutter V2.0 (New England Biolab INC). Tách chiết DNA genome: DNA genome được tách từ các mẫu lá ngô theo phương pháp CTAB của Saghai Maroof et al. (1994) [12]. Nhân bản gen Ubi và promoter: Gen Ubi và promoter Ubiquitin được nhân bản từ DNA genome tách từ lá ngô bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế. Thành phần phản ứng bao gồm: đệm 10 x PCR: 2,5 µl; MgCl2 (25 mM): 1,5 µl; dNTP (1 mM): 1 µl; mồi xuôi (50 ng/µl): 1 µl; mồi ngược (50 ng/µl): 1 µl, ; Taq DNA polymerase (5 U/µl): 1 µl ; DNA (50 ng/ µl): 1 µl và nước cất vô trùng: 12 µl. Phản ứng PCR được thực hiện trên máy luôn nhiệt PTC-100 (MJ Research, Inc) với 35 chu kỳ: 94oC: 1 phút; 58oC: 1 phút, 72oC: 2 phút; kết thúc phản ứng ở 72oC trong 8 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Nhân dòng gen Ubi, propotor Ubiquitin và đọc trình tự: phân đoạn DNA nhân được sau phản ứng PCR có kích thước tương ứng với kích thước lý thuyết của Ubi1 được tinh sạch bằng bộ kit AccuPrep® Gel Purification (Bioneer) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi tinh sạch phân đoạn này được gắn vào vector nhân dòng pBT để tạo vector tái tổ hợp. Các quá trình tạo vector tái tổ hợp được thực hiện theo như mô tả của Sambrook et al. (1989) [11]. Vector tái tổ hợp chứa gen Ubi sau đó được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Kết quả biến nạp vào E. coli của vector tái tổ hợp có gắn gen Ubi với vector pBT được kiểm tra bằng phản ứng colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhân bản Ubi. Đồng thời, các khuẩn lạc làm khuôn cho phản ứng colony-PCR sẽ được nuôi lắc qua đêm ở 37oC trong 4 ml môi trường LB lỏng bổ sung 100 µg/ml kháng sinh Ampicillin hoặc 50 µg/ml kháng sinh Kanamycin để tách plasmid. Tách DNA plasmid và kiểm tra sự có mặt của gen Ubi bằng cắt bởi enzyme giới hạn BamHI được tiến hành theo như Sambrook et al. (1989) [11]. Trình tự nucleotide của gen Ubi được xác định bằng máy giải trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ kit BigDye® Terminator V3.1 Cycle Sequencing tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm về công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự gồm mồi, DNA plasmid đã được tinh sạch, BigDye, đệm tương ứng trong tổng thể tích 15 µl. Chu trình nhiệt trên máy luân nhiệt GenAmp® PCR System 9700 gồm 25 chu kỳ: 96oC: 1 phút, 96oC: 10 giây, 50oC: 5 giây, 60oC: 4 phút. Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch và điện di trong ống vi mao quản để đọc trình tự. Trình tự nucleotide nhận được của gen Ubi được so sánh với trình tự của Ubi1 (DQ141598.1) và một số trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế bằng phần công cụ BLAST của NCBI. Phân tích promoter: xác định vùng promoter, vùng phiên mã của gen Ubi nhận được bằng phần mềm TSSP/ Prediction of PLANT Promoters, Softberry, Inc. So sánh các vị trí của promotor, vùng phiên mã gen Ubi từ dòng ngô H240 và gen Ubi1 đã công bố (DQ141598.1) với dữ liệu các chuỗi gen tương đồng cùng loài trong gemone thực vật bằng chương trình PromH(W) (Promoter prediction using orthologous sequences ( xác định vùng kết thúc phiên mã bằng chương trình ARNold-Program Finding terminator (Gautheret and Lambert, 2001) [4]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả thiết kế mồi đặc hiệu Dựa trên trình tự gen Ubi1 trên Ngân hàng Gen NCBI với mã số DQ141598.1, bằng phần TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 114-121 116 mềm Primer 3 [10], trình tự của cặp mồi đặc hiệu cho nhân bản gen Ubi được thiết kế. Mồi xuôi UbiF có trình tự là 5’- TAGTGCAGCGTGACCCG - 3’ và mồi ngược UbiR có trình tự là 5’-TATGCAGAAGTAACA CCAAACAA-3’. Để thuận tiện cho việc nhân dòng trong vector pBT mồi xuôi và mồi ngược được gắn thêm trình tự các điểm cắt tương ứng của các enzyme giới hạn BamHI (GGATCC) và PstI (CTGCAG). Kết quả mồi xuôi (UbiF2) và mồi ngược (UbiR2) để nhân bản gen Ubi có trình tự tương ứng là: UbiF2: 5’-TACTGC AGGTGCAGCGT GACCCG-3’ và 5’-TAGG ATCCTGCAGAAGTAACACCAAACAA-3’ (bảng 1). Mồi xuôi có chiều dài 23 nucletide nhiệt độ nóng chảy (Tm) là 65,8 oC và tỷ lệ GC là 65.2%, còn mồi ngược có chiều dài 29 nucletide nhiệt độ nóng chảy (Tm) là 59,6 oC và tỷ lệ GC là 41,3%. Cặp mồi sẽ nhân được chuỗi nucleotide có chiều dài theo lý thuyết khoảng 2 kb tương đương với chiều dài của gen Ubiquitin. Bảng 1. Trình tự mồi dùng cho nhân bản promoter Ubiquitin Tên Trình tự mồi thiết kế nhân bản gen Ubiquitin Tm (oC) Tỷ lệ GC (%) Chiều dài UbiF2 5’ - TACTGCAGGTGCAGCGTGACCCG - 3’ 65,8 65,2 23 UbiR2 5’- TAGGATCCTGCAGAAGTAACACCAAA CAA-3’ 59,6 41,3 29 Kết quả nhân bản gen Ubi và promoter Ubiquitin Với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế, gen Ubi và promoter Ubiquitin đã được nhân bản từ DNA genome dòng ngô H240 (hình 1). Kết quả điện di trên hình 1 cho thấy, sản phẩm PCR chỉ có một băng duy nhất có kích thước khoảng 2 kb, tương đương với kích thước của gen Ubiquitin và promoter theo lý thuyết. Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen Ubi M. DNA marker 1 kb (Biolabs); 1. Đối chứng âm (phản ứng PCR không có DNA của H240); 2. sản phẩm PCR nhân bản gen Ubiquitin từ DNA genome dòng ngô H240 với cặp mồi UbiF2 và UbiR2 được thiết kế. Kết quả nhân dòng gen Ubi và promoter Sau khi nhân bản, băng có kích thước tương tự độ dài của gen Ubiquitin được tinh sạch và được gắn vào plasmid pBT và biến nạp vào chủng E. coli DH5α. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu UbiF2 và UbiR2 được trình bầy trên hình 2. Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen Ubi từ plasmid trong các khuẩn lạc 2, 3 và 4; M. DNA marker 1 kb (Biolabs); 1. Đối chứng âm (phản ứng PCR không có khuẩn lạc); 2, 3, 4. tương ứng với plasmid từ các dòng khuẩn lạc 2, 3 và 4. Nguyen Duc Thanh, Le Hoang Duc 117 Hình 3. Kết quả cắt kiểm tra phân đoạn gen Ubi từ dòng ngô H240 trong plasmid pBT. M: DNA marker 1 kb (Biolabs); 2 , 3, 4: tương ứng với plasmid từ các dòng khuẩn lạc 2, 3, và 4 được cắt bằng enzyme BamHI Như vậy là phân đoạn gen Ubi đã được gắn vào plasmid pBT và nhân dòng trong E. coli DH5α. Kết quả này cũng được khẳng định bằng kết quả cắt plasmid pBT có chứa phân đoạn gen Ubi bằng enzyme BamHI. Sau khi cắt bằng enzyme này và phân lập các đoạn cắt trên gel agorose 1%, trên ảnh điện di có thể nhìn rõ hai băng : băng 3 kb tương ứng với độ dài của plasmid pBT và băng 2 kb tương ứng với độ dài của gen Ubi (hình 3). Kết quả so sánh trình tự và phân tích promoter Ubiquitin Kết quả so sánh trình tự phân đoạn đoạn gen Ubi mang promoter Ubiquitin từ dòng ngô H240 với trình tự gen trên Ngân hàng Gen NCBI và trình tự Ubi1 có mã số DQ141598.1 (Zea mays cultivar Nongda 105 polyUbiquitin-1 (Ubi-1) gene, promoter region and 5' UTR) được trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự gen Ubi mang promoter Ubiquitin tách từ dòng ngô H240 và gen Ubi1 với vùng promoter đã công bố với mã số DQ141598.1 Mã số Ngân hàng gen Tên gen Mức độ so sánh Giá trị E Mức độ tương đồng DQ141598.1 Gen polyUbiquitin-1 (Ubi-1) từ dòng ngô Nongda 105 Zea mays, vùng promoter và không phiên mã đầu 5' 99% 0,0 94% Bảng 3. Kết quả so sánh trình tự gen Ubi mang promoter Ubiquitin từ dòng ngô H240 với một số trình tự trên Ngân hàng Gen quốc tế khác Mã số Tên gen, vector Mức độ so sánh Giá trị E Mức độ tương đồng Tác giả AB201314.1 Cloning vector pSB4U DNA, complete sequence 99% 0.0 93% Kuraya et al. (2004) [7] FJ750577.1 Cre-lox Univector acceptor vector pCR701 complete sequence 99% 0.0 93% Jia et al. (2009) [5] AY452753.1 Reporter vector pUbiGUSPlus; pUbiSXR, complete sequence 99% 0.0 93% Vickers et al. (2003) [15] S94464.1 polyUbiquitin [maize, Genomic, 3841 nt] 99% 0.0 93% Christensen et al. (1992) [1] U29159.1 Zea mays clone MubG1 Ubiquitin gene, complete cds 99% 0.0 93% Liu et al. (1995) [8] AY342393.1 Zea diploperennis polyUbiquitin-1 (Ubi-1) gene, promoter region and 5' UTR 98% 0.0 94% Streatfield et al. (2003) [13] TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 114-121 118 Kết quả trên bảng 2 cho thấy, mức độ nucleotide tương đồng giữa gen Ubi tách từ dòng ngô H240 nhân dòng được với trình tự gen polyUbiquitin-1 (Ubi-1) từ dòng ngô Nongda 105 Zea mays, vùng promoter và vùng không phiên mã đầu 5' (DQ141598.1) là 94%. Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành so sánh với các trình tự nucleotide khác trên Ngân hàng Gen quốc tế và thu được các kết quả thể hiện trong bảng 3. Qua bảng 3 có thể thấy, trình tự của gen Ubi nhân dòng được có độ tương đồng cao với trình tự một số gen và vector mang promoter Ubiquitin đã công bố, đặc biệt là trình tự gen Ubiquitin trong các dòng ngô chuyển gen. Như vậy, có thể khẳng định gen Ubi nhân dòng được có độ tin cậy cao. Gen Ubi từ dòng ngô H240 đã được đăng ký trên Ngân hang Gen quốc tế NCBI với mã số JX947345.1 (Zea mays ubiquitin 1 (Ubi) gene, promoter region). >gi_410109644_gb_JX947345.1_ Zea mays ubiquitin 1 _Ubi_ gene, promoter region TACTGCAGGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGCTCTAGAGTAGAGCATTG 60 CATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTACACTTGTGTTTGAAGTGCA 120 GTTTATCTATCTCTATACATATATTTAAACTTCACTATATGAATAATATAGTCTATAGTA 180 TTAAAATAATATCAATGTTTTAGATGATTATATAACTGAGCTGCTAGACATGGTCTAAAG 240 GACAACCGAGTATTTTGACAACATGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCGTGTGTT 300 CTTTTTACTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATC 360 CATTTACTAAATTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAAC 420 TTAAACTCTATTTTAGTTTTTTATTTAATAATTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGT 480 GACTAAAAAATAACTAAATACCTTTTTAAGAAATAAAAAAACTAAGGAACCATTTTTCTT 540 GTTCCGAGTAGATAATGACAGCCTGTTCAACGCCGTCGACGAGTCTAACCGGAACACCCC 600 ATCAGCGAACCCAGGCAGCGTCGCGTCCGGTTCAAGCGAAGCAGAACGCCACGGGCATCT 660 TCTGTAGCTGCCCTTTCTGGACCCCCTCTCTCCGAGAGAAGGTTTCCGCTCCCACCGTTG 720 GACTTGCTCCCGCTGTTCGGCATCCCAGAAAATTGCGTGGGCGGGAGCGGCAGACGTGAG 780 CCGGCACGGGCAGGCGGCCTTCCTTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCCTTTC 840 CCACCGCTCCTTTCGCTTTTCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCCCTCCC 900 Hộp TATA ACACCCTCTTTCCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCC 960 CCCCAAACCCACCCGTCGGCACCTCCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCC 1020 CCCCTCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCCCCGGTAGTTC 1080 TACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTC 1140 GTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTC 1200 TTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTT 1260 TTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCA 1320 Chuỗi kết thúc CTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTG 1380 GTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATT 1440 AATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGA 1500 TGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGGTGCATATACA 1560 GAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCG 1620 TTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACT 1680 GTATGTGTGTGTCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCT 1740 AGGATAGGTATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAG 1800 CATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTA 1860 TAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTT 1920 TTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTGTCCGATGCTC 1980 ATCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAGGATCCTA 2040 Hình 4. Vị trí promoter, hộp TATA và chuỗi kết thúc của gen Ubi từ dòng ngô H240 Nguyen Duc Thanh, Le Hoang Duc 119 Sử dụng phần mềm chuyên dụng dự đoán chức năng (vùng promoter, vùng phiên mã, chuỗi kết thúc) và so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen, chúng tôi đã xác định được một số vùng trình tự đặc biệt như vị trí promoter từ 870 đến 920, hộp TATA nằm ở vị trí từ 877 đến 885 bp và chuỗi kết thúc ở vị trí từ 1266 đến 1291 (bảng 4 và hình 4). Kết quả so sánh các vị trí của vùng phiên mã gen Ubi của dòng ngô H240 và gen Ubi1 đã công bố với mã số DQ141598.1 với dữ liệu các chuỗi gen tương đồng cùng loài trong gemone thực vật được thể hiện ở bảng 5. Bảng 4. Kết quả phân tích vùng promoter Ubiquitin từ dòng ngô H240 Mã số Tên gen Vị trí promoter Vị trí hộp TATA Vị trí chuỗi kết thúc JX947345.1 Gen Ubiquitin 1 (Ubi) từ dòng ngô H240, vùng promoter 870-920 877-885 1266-1291 Bảng 5. Mức độ tương đồng các vùng của gen Ubi từ dòng ngô H240 và gen Ubi1 từ Ngân hàng Gen (mã số DQ141598.1) so với các chuỗi gen tương đồng cùng loài trong gemone thực vật Mã số Mức độ tương đồng chung trong vùng so sánh (PHa) Mức độ tương đồng trong vùng phiên mã (PHs) Mức độ tương đồng chuỗi bên phải vùng phiên mã (PHss) Mức độ tương đồng của vùng hộp TATA (PHt) Mức độ tương đồng trung bình của yếu tố phiên mã trong vùng so sánh (PHr) JX947345.1 (gen Ubiquitin từ dòng ngô H240 88% 100% 95% 100% 85% DQ141598.1 (gen Poly Ubiquitin1 từ Ngân hàng Gen) 89% 88% 97% 100% 98% Kết quả trong bảng 5 cho thấy mức độ tương đồng của vùng hộp TATA của hai gen so với các chuỗi gen tương đồng cùng loài trong gemone thực vật là 100%, trong khi mức độ tương đồng trong vùng phiên mã của gen Ubi từ dòng ngô H240 cao hơn so với gen Ubi1 đã công bố (100% so với 88%) còn mức độ tương đồng chung trong vùng so sánh là tương đương nhau (88 và 89%). KẾT LUẬN Từ những kết quả nhân dòng gen và phân tích promoter Ubiquitin từ dòng ngô H240 chúng tôi rút ra kết luận sau: Đã nhân dòng thành công gen Ubiquitin với mức độ chính xác cao. Gen Ubi từ dòng ngô H240 có độ tương đồng cao với các gen Ubiquitin tách từ các dòng ngô khác đã công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế. Đã xác định được vùng promoter Ubiquitin trên gen. Mức độ tương đồng về vùng promoter, vùng phiên mã và vùng hộp TATA của gen Ubi nhân dòng được có độ tương đồng cao so với các chuỗi gen tương đồng cùng loài trong gemone thực vật. Kết quả nhận được trong nghiên cứu này sẽ góp phần đáng kể trong việc nghiên cứu và sử dụng promoter Ubiquitin trong chuyển gen ở các cây một lá mầm nói chung và cây ngô nói riêng. Lời cám ơn: Công trình được thực hiện trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu tạo dòng ngô bố mẹ được tăng cường khả năng tổng hợp tinh bột bằng công nghệ gen” thuộc Chương trình Trọng TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 114-121 120 điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ Sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Christensen A. H., Sharrock R. A, Quail P. H., 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689. 2. Cornejo M. J., Luth D., Blankenship K. M., Anderson O. D., Blechl A. E., 1993. Activity of a maize Ubiquitin promoter in transgenic rice. Plant Mol. Biol., 23(3): 567- 81. 3. Dalton S. J., Heywood E., Timms E. J., Morris P., 2007. A comparison of maize and rice Ubiquitin promoter activity using the uidA (Gus) gene in maize: An enhanced rice Ubiquitin promoter increases transgene expression in maize compared with the native maize Ubiquitin promoter. Plant Transformation Technologies Conference, Vienna, Austria, 4-7 February 2007. 4. Gautheret D., Lambert A., 2001. Direct RNA Motif Definition and Identification from Multiple Sequence Alignments using Secondary Structure Profiles. J. Mol. Biol. 313:1003-1011. 5. Jia F., Gampala S. S., Mittal A., Luo Q., Rock C. D., 2009. Cre-lox univector acceptor vectors for functional screening in protoplasts: analysis of Arabidopsis donor cDNAs encoding Abscisic Acid INSENSITIVE1-like protein phosphatases. Plant Mol. Biol., 70(6): 693-708. 6. Kamo K., Joung Y. H., Green K., 2009. GUS expression in Gladiolus plants controlled by twoDladiolus Ubiquitin Promoter. Floricul. Ornam. Biotechnol., 3(1): 10- 14. 7. Kuraya Y., Ohta S., Fukuda M., Hiei Y., Murai N., Hamada K., Ueki J., Imaseki H., Komari T., 2004. Suppresion of transfer of T-DNA 'vector backbone' sequences by multiple left border repeats in vectors for transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens. Mol. Breed., 14: 309-320. 8. Liu L., Maillet D. S., Frappier J. R., Walden D. B., Atkinson B. G. 1995. Characterization, chromosomal mapping, and expression of different polyubiquitin genes in tissues from control and heat- shocked maize seedlings. Biochem. Cell Biol. 73 (1-2): 19-30. 9. Rooke L., Byrne D., Salgueiro S. 2000. Marker gene expression driven by the maize Ubiquitin promoter in transgenic wheat. Ann. Appl. Biol., 136: 167-172. 10. Rozen S., Skaletsky H. J., 2000. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386. 11. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition). Cold Spring Harbor Laboratory, NY. 12. Saghai Maroof M. A., Biyashev R. M., Yang G. P., Zhang Q., Allard R. W., 1994, Extraordinarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosome location, and population dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 5466-5470. 13. Streatfield S. J., Love R.T., 2003. Analysis of the maize polyubiquitin-1 promoter heat shock elements and generation of promoter variants with modified expression characteristics. Unpublished 14. Toki S., Takamatsu S., Nojiri C., Ooba S., Anzai H., Iwata M., Christensen A. H., Quail P. H., Uchimiya H., 1992. Expression of a Maize Ubiquitin Gene Promoter-bar Chimeric Gene in Transgenic Rice Plants. Plant Physiol., 100:1503-1507. 15. Vickers C. E., Xue G. P., Gresshoff P. M., 2003. A synthetic xylanase as a novel reporter in plants. Plant Cell Rep., 22(2): 135-140. Nguyen Duc Thanh, Le Hoang Duc 121 CLONING UBIQUITIN GENE WITH PROMOTER REGION FROM ZEA MAYS L. Nguyen Duc Thanh, Le Hoang Duc Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY Ubiquitin is a protein in eukaryote cells and its sequence is highly conserved. The protein has been involved in many cellular processes, such as protein turnover, chromatin structure, cell cycle control, DNA repair and response to heat shock and other stresses. The gene codes for this protein (Ubiquitin gene) and its promoter have been cloned. The function of the gene and its promoter from many plants like rice, maize and gladiolus plants has been studied. Ubiquitin promoter plays an important role in gene expression in monocot. In this article, we present the results on cloning the gene coding for Ubiquitin protein (Ubi gene) and its promoter from maize line H240 for genetic engineering studies in maize. The data obtained showed that the promoter region, transcription region and TATA box region of cloned Ubi gene from maize line H240 have high level of homology comparing to orthologous sequenes in plant genome. The cloned Ubi gene was submited to the GenBank with assession number JX947345.1. The results of this study will, considerablely, contribute to the study and application of Ubiquitin promoter in gene transfer of monocot, in general, and maize, in particular. Keywords: Zea mays, homology, maize plant, promoter, TATA box, transcription region, Ubiquitin gene. Ngày nhận bài: 24-5-2013