Nghiên cứu đánh giá khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ người thành tế bào giống tế bào gan in Vitro - Nguyễn Thị Kim Nguyền

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 209-215 209 NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỆT HÓA CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ NGƯỜI THÀNH TẾ BÀO GIỐNG TẾ BÀO GAN IN VITRO Nguyễn Thị Kim Nguyền*, Trương Hải Nhung, Mai Thị Trang, Nguyễn Hải Nam, Phạm Văn Phúc Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp Hồ Chí Minh, *ntknguyen@hcmus.edu.vn TÓM TẮT: Nghiên cứu của chúng tôi trình bày kết quả khảo sát khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (adipose-derived stem cells-ADSCs) thành tế bào giống tế bào gan in vitro bằng môi trường biệt hóa sử dụng hóa chất. Bằng các phương pháp kiểm tra kết quả sau biệt hóa chúng tôi đã chứng minh được ADSCs có khả năng biệt hóa in vitro thành tế bào giống tế bào gan. Tế bào giống tế bào gan (hepatocyte-like cells-HPCs) có sự thay đổi hình thái từ dạng đặc trưng của tế bào gốc trung mô sang dạng đa giác với tỷ lệ giữa thể tích nhân tế bào và tế bào chất tăng lên, hình thái này tương tự với tế bào nhu mô gan. Ngoài ra, HPCs biểu hiện cao các gen hướng gan như: α-fetoprotein, albumin, CK18, CK19 so với ADSCs đối chứng. Đồng thời, kết quả nhuộm PAS (Periodic acid-Schiff stain) cho thấy HPCs có khả năng dự trữ glycogen. Từ khóa: Bệnh gan, biệt hóa tế bào, tế bào gan, tế bào gốc. MỞ ĐẦU Xơ gan là một trong những bệnh phổ biến và là nguyên nhân dẫn đến tử vong cao trong số các bệnh liên quan đến gan ở Việt Nam. Các phương pháp điều trị hiện tại đối với căn bệnh này là cấy ghép gan. Tuy nhiên, việc cấy ghép gan tồn tại các nhược điểm như khan hiếm nguồn cấy ghép, giá thành cao và khả năng gây thải loại miễn dịch. Tế bào gốc trung mô MSCs (mesenchymal stem cell) được xem như một nguồn vật liệu tiềm năng trong liệu pháp điều trị bệnh nhằm thay thế các tế bào hoặc cơ quan mất chức năng của cơ thể trong đó có tổn thương gan. Đến nay, MSCs có thể được phân lập từ rất rất nhiều nguồn khác nhau nhằm cung cấp nguồn vật liệu đa dạng và dồi dào cho liệu pháp cấy ghép. Trong số đó, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ADSCs (adipose- derived stem cells) là một ứng cử viên tiềm năng vì ngoài khả năng tự làm mới và tiềm năng biệt hóa đa dòng như tế bào gốc trung mô, ADSCs còn là một nguồn dồi dào cho liệu pháp cấy ghép tự thân khắc phục các vấn đề về thải loại miễn dịch trong cấy ghép dị cá thể [2]. Trong các báo cáo trước đó, hADSCs (human adipose-derived stem cells) đã được chứng minh có khả năng làm giảm xơ gan trong mô hình chuột bị xơ gan bằng TAA bởi khả năng biệt hóa thành tế bào gan nhằm thay thế cho các tế bào gan bị hư hỏng hoặc cảm ứng các tế bào nội sinh trong gan tăng sinh và thực hiện chức năng [6]. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng biệt hóa in vitro của tế bào ADSCs thành các tế bào giống tế bào gan để hướng tới các nghiên cứu tiếp theo nhằm ứng dụng chúng trong điều trị các bệnh thoái hóa tế bào gan. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tế bào hADSCs sử dụng trong nghiên cứu này được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Tế bào gốc, Trường đại học Khoa học tự nhiên. Nuôi cấy tăng sinh hADSCs Tế bào hADSCs sau khi được thu nhận và xác định đặc điểm của tế bào gốc trung mô sẽ được nuôi cấy thứ cấp trong môi trường MSC Cult Kit (Công ty GeneWorld, Việt Nam). Khi đạt mật độ 80-90% diện tích bề mặt bình nuôi cấy, tế bào được xử lý với trypsin/EDTA 0,25% (Công ty GeneWorld, Việt Nam) và được cấy chuyền sang bình nuôi cấy mới. Biệt hóa định hướng gan in vitro Quy trình biệt hóa: tế bào hADSCs được nuôi cấy tăng sinh đến P3. Khi tế bào đạt mật độ 80% bề mặt bình nuôi cấy tiến hành cấy chuyền qua đĩa 12 giếng được phủ với fibronectin 5 µg/ml để biệt hóa. Khi tế bào P4 đạt mật độ 80-90% bề mặt nuôi cấy, tiến hành Nguyen Thi Kim Nguyen et al. 210 biệt hóa với hai môi trường biệt hóa. Tế bào được biệt hóa qua hai giai đoạn: Giai đoạn 1: tế bào hADSC P4 được nuôi cấy 7 ngày trong môi trường cảm ứng với thành phần là môi trường nuôi cấy được bổ sung với HGF 20 ng/ml, bFGF 10 ng/ml và nicotiamide 4,9 mM. Giai đoạn 2: sau 7 ngày tiến hành thay bằng môi trường biệt hóa với thành phần gồm môi trường nuôi cấy bổ sung với OMS 20 ng/ml, dexamethasone 1 µmol/l và ITS 10 ng/ml trong 3 tuần. Kiểm tra đặc điểm của HPCs sau biệt hóa Trong quá trình biệt hóa tế bào sử dụng kính hiển vi quan sát hình thái và ghi nhận sự thay đổi hình thái mỗi ngày. Để so sánh mức độ biểu hiện gen định hướng của tế bào sau biệt hóa với tế bào đối chứng (tế bào hADSCs không biệt hóa và tế bào ung thư gan người HepG2), phản ứng RT-PCR (SuperScript® III One-Step RT-PCR System with Platinum®Taq, InvitrogenTM) được sử dụng cùng với các cặp mồi chuyên biệt cho các gen đặc trưng cho tế bào gan (bảng 1). Bảng 1. Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu (Sigma) Tên gen Trình tự Kích thước sản phẩm (bp) Mồi xuôi GAGATCGAGGCTCTCAAGGA CK18 Mồi ngược CAAGCTGGCCTTCAGATTTC 357 Mồi xuôi ATGGCCGAGCAGAACCGGAA CK19 Mồi ngược CCATGAGCCGCTGGTACTCC 328 Mồi xuôi TGCTTGAATGTGCTGATGACAG Albumin Mồi ngược AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTC 162 Mồi xuôi TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAA Anpha fetoprotrein Mồi ngược CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAG 217 Mồi xuôi TGAAGAGGGGCACATGCTGA Fibronectin Mồi ngược GTGGGAGTTGGGCTGACTCG 274 Kết quả điện di sản phẩm PCR được phân tích bằng phần mềm ImageJ (National Institutes of Health) nhằm so sánh mức độ biểu hiện các gen định hướng gan của các dòng tế bào. Kiểm tra chức năng dự trữ glycogen Để kiểm tra chức năng dự trữ glycogen của tế bào giống tế bào gan sau biệt hóa, tế bào hADSCs đối chứng, HepG2 và HPCs được cố định và nhuộm PAS ở bệnh viện Chợ Rẫy, thành phố Hồ Chí Minh. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nuôi cấy thứ cấp tế bào hADSCs Kết quả nhuộm Giemsa quan sát hình thái cho thấy, tế bào hADSCs không có sự thay đổi hình thái sau nhiều thế hệ từ P3, P4, P5 và P6 (hình 1). Kết quả biệt hóa thành tế bào giống tế bào gan Từ giai đoạn biệt hóa ngày 5, tế bào đã có sự thay đổi hình thái, cụ thể là chuyển từ dạng đặc trưng trung mô sang dạng tế với hình dạng đa giác đặc trưng với tế bào gan (hình 2). Bên cạnh đó, một số tế bào trong nghiên cứu này ở giai đoạn trưởng thành cũng xuất hiện 2 nhân tương tự nghiên cứu của Lotfi (2012) [3] và Schwartz (2002) [7]. Hình thái đa nhân của tế bào cảm ứng giai đoạn trưởng thành được kiểm tra thông qua phương pháp nhuộm H & E và Hoechst. Sự thay đổi hình dạng của tế bào cảm ứng theo thời gian (tế bào có hình thái giống tế bào gan) là một trong những tiêu chí ban đầu đánh giá quá trình biệt hóa của hADSCs thành tế bào giống tế bào gan. Dựa vào kết quả (hình 3a) chúng tôi nhận thấy sản phẩm RT-PCR gen CK19 xuất hiện ở giếng 2 và 3 với kích thước như dự đoán (357 bp), trong khi đó không có sản phẩm xuất hiện TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 209-215 211 ở giếng số 1. Kết quả của (hình 3b) chứng tỏ tế bào biệt hóa thành tế bào giống tế bào gan đang ở giai đoạn sớm vì CK19 là gen đặc trưng của tế bào mật, các tế bào tiền thân của gan, tế bào ung thư gan [11]. Kết quả ở hình 3 cho thấy, gen α-fetoprotein xuất hiện ở giếng số 1, 2, 3 với một vạch có kích thước như dự đoán. So sánh cường độ sáng của sản phẩm RT-PCR gen α-fetoprotein bằng phần mềm ImageJ, chúng tôi nhận thấy, cường độ sáng của α-fetoprotein ở giếng số 2, 3 gấp 8 lần so với giếng số một (hADSCs). Cùng với kết quả kiểm tra sự biểu hiện của gen CK19, sự biểu hiện của gen α-fetoprotein ở nhóm biệt hóa góp phần khẳng định các tế bào biệt hóa thành tế bào giống tế bào gan đang trải qua giai đoạn sớm trong quá trình trưởng thành của tế bào gan. Hình 1. Hình thái tế bào hADSCs ở thế hệ thứ 3 (a), thứ 4 (b), thứ 5 (c) và thứ 6 (d) Hình 2. Hình thái tế bào hADSCs sau khi biệt hóa ngày 0 (a), ngày thứ 5 (b), ngày thứ 15 (c), ngày thứ 21 (d) Nguyen Thi Kim Nguyen et al. 212 Hình 3. a. Kết quả điện di kết quả RT-PCR sau 5 ngày biệt hóa: giếng 1. Đối chứng (ADSC chưa biệt hóa); giếng 2. ADSC biệt hóa sau 5 ngày; giếng 3. Chứng dương (tế bào ung thư gan HepG2); b. Kết quả phân tích độ sáng của các gen chuyên biệt giữa các lô thí nghiệm bằng phần mềm ImageJ: 1. ADSCs đối chứng; 2. ADSC biệt hóa ngày 5; 3. HepG2. Hình 4. a. Kết quả RT-PCR gen albumin và CK18: 1. ADSCs đối chứng; 2. ADSC biệt hóa ngày 21; 3. HepG2; b. Kết quả phân tích độ sáng của các gen chuyên biệt giữa các lô thí nghiệm bằng phần mềm ImageJ: 1. ADSCs đối chứng; 2. ADSC biệt hóa ngày 21; 3. HepG2. So sánh với các kết quả nghiên cứu sự biểu hiện các gen albumin, CK18 của Schwartz et al. (2002) [7]; Seo et al. (2005) [8]; Banas et al. (2007) [1] kết quả mà chúng tôi đạt được cũng tương tự như các kết quả đã công bố trong các nghiên cứu của các tác giả trên (hình 4). Ngoài ra, chúng tôi còn phân tích thêm sự biểu hiện của Bcl-2, là gen mã hóa cho protein kháng apoptosis ở tế bào ung thư gan [9], bên cạnh chức năng kháng sự tự chết của tế bào (apoptosis), Bcl-2 còn có chức năng kháng stress oxy hóa và biểu hiện mạnh ở tế bào ung thư hay khi gan bị tổn thương. a b a b TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 209-215 213 Hình 5. (a) Kết quả RT-PCR gen Bcl2 và Gapdh: (1) ADSCs đối chứng; (2) ADSC biệt hóa ngày 21; (3) HepG2; (b) Kết quả phân tích độ sáng của các gen chuyên biệt giữa các lô thí nghiệm bằng phần mềm ImageJ: (1) ADSCs đối chứng; (2) ADSC ngày biệt hóa 21; (3) HepG2 Hình 6. Kết quả nhuộm PAS: tế bào hADSCs P4 (a), tế bào HepG2 (b), tế bào HPC (c) Kết quả RT-PCR gen Bcl-2 (hình 5a) ở nhóm đối chứng và nhóm biệt hóa có vạch mờ như nhau, còn ở lô HepG2 vạch sáng và rõ hơn có kích thước đúng như dự đoán (101 bp). Kết quả điện so sánh cường độ sáng của gen sử dụng phần mềm ImageJ (hình 5b) cho thấy, cường độ sáng của gen Bcl-2 ở nhóm HepG2 gấp đôi cường độ sáng ở nhóm đối chứng (tế bào hADSCs không biệt hóa) và lô biệt hóa. Kết quả này cho thấy quá trình cảm ứng biệt hóa hADSCs thành tế bào giống tế bào gan bằng môi trường chứa nhân tố cảm ứng dexamethasone và ITS không làm cho hADSC biểu hiện gen ung thư. Kết quả nhuộm PAS cho thấy, tế bào HPC có tế bào chất bắt màu hồng với thuốc nhuộm so với đối chứng hADSCs. Tuy nhiên, cường độ màu vẫn còn thấp hơn nhiều so với HepG2, kết quả này chứng tỏ HPC có khả năng dự trữ glycogen tương tự như tế bào gan (hình 6). Trong giai đoạn 1 của quá trình biệt hóa, chúng tôi sử dụng các nhân tố biệt hóa như HGF, FGF và nicotinamide. Ở giai đoạn 2, dexamethasone và ITS được dùng tiếp tục trong việc cảm ứng biệt hóa và trưởng thành các tế bào hADSCs thành tế bào giống tế bào gan. Theo nhiều báo cáo, dexamethasone là một hormone glucocorticoid tổng hợp, tác động lên các thụ thể trong tế bào chất, xúc tiến sự tổng hợp glucose và glycogen ở gan, ức chế sự phát triển của nguyên bào sợi và các tế bào ung thư gan. Trong nuôi cấy in vitro, dexamethasone thường được bổ sung vào môi trường nuôi để làm tăng khả năng sống sót và chức năng của tế a b Nguyen Thi Kim Nguyen et al. 214 bào gan. Thêm vào đó, ITS thúc đẩy sự tăng sinh và trưởng thành cũng như duy trì sự sống và chức năng của tế bào gan. Các nhân tố biệt hóa như HGF, FGF, nicotinamide được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu biệt hóa tế bào gan từ tế bào gốc trung mô ở giai đoạn định hướng. Taléns-Visconti et al. (2006) [10] đã tiến hành biệt hóa BMSCs và hADSCs thành tế bào giống tế bào gan qua 2 giai đoạn: giai đoạn 1 cảm ứng biệt hóa bằng HGF, FGF; giai đoạn 2 cảm ứng biệt hóa và trưởng thành bằng dexamethasone, ITS và OSM. Sau 21 ngày cảm ứng biệt hóa, các tế bào biệt hóa cũng có hình thái và chức năng giống tế bào gan [10]. Tương tự, Banas et al. (2007) [1] sử dụng môi trường cảm ứng gồm nhiều nhân tố cảm ứng (trong đó cũng có dexamethasone và ITS) để cảm ứng biệt hóa hADSCs thành tế bào giống tế bào gan. So sánh với các nghiên cứu trên, nghiên cứu của chúng tôi biến đổi qui trình của Taléns-Visconti (2006) [10], chỉ sử dụng 2 nhân tố cảm ứng là dexamethasone và ITS trong giai đoạn 2 để cảm ứng hADSCs thành tế bào giống tế bào gan, và kết quả cũng rất khả thi, đó là các tế bào này có khả năng thay đổi hình thái, biểu hiện gen, và có một số chức năng giống tế bào gan (bảng 2). Tuy nhiên, về hiệu quả biệt hóa thì có thể không giống nhau giữa các nghiên cứu do nhiều yếu tố về kỹ thuật, điều kiện phòng thí nghiệm. Bảng 2: Bảng tổng kết sự biểu hiện gen của tế bào ADSC sau cảm ứng biệt hóa thành tế bào giống tế bào gan Gen Giai đoạn trước biêt hóa Biệt hóa ngày thứ 5 Biệt hóa ngày thứ 21 α-fetoprotein - + - CK18 - - + CK19 - + - Albumin - - + Bcl-2 + - - GADPH + + + KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, vì tế bào biệt hóa in vitro chưa được chứng minh hoàn toàn về cấu trúc và chức năng của một tế bào gan thực thụ nên chúng tôi gọi đây là tế bào giống tế bào gan. Tuy nhiên, với những kết quả về hình thái, về biểu hiện gen và về khả năng tích trữ glycogen, đã phần nào có thể chứng minh tế bào gốc đa năng thu từ mô mỡ hoàn toàn có khả năng chuyển biệt hóa thành tế bào giống tế bào gan và mở ra tiềm năng to lớn trong điều trị các bệnh về thoái hoá ở gan. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Banas A., Teratani T., Yamamoto Y., Tokuhara M., Takeshita F., Quinn G., Okochi H., Ochiya T., 2007. Adipose tissue- serived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology, 46: 219- 228. 2. Kim S. J., Park K. C., Lee J. U., Kim K. J., Kim D. G., 2011. Therapeutic potential of adipose tissue-derived stem cells for liver failure according to the transplantation routes. J. Korean Surg. Soc., 81(3): 176- 186. 3. Lotfi A. S., Khoshdel A., Soleimani M., Daliri M., Adibi B., 2011. High yield generation of hepatocyte like cells from adipose derived stem cells. Scientific Research and Essays, 7(10): 1141-1147. 4. Peng L., Zhu H., Zheng Y., Xie C., Chong Y., Gao Z., 2011. Mesenchymal stem cells differentiate into hepatocyte-like cells under different induction systems in hepatitis B patients with liver failure. Afr. J. Biotechnol., 10(5): 840-847. 5. Piryaei A., Valojerdi M. R., Shahsavani M., Baharvand H., 2010. Differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells on nanofibers and their transplantation into a carbon TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 209-215 215 tetrachloride induced liver fibrosis model. Stem Cell Rev. Rep., 7: 103-118. 6. Puglisi M. A., Saulnier N., Piscaglia A. C., Tondi P., Agnes S., Gasbarrini A., 2011. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and hepatic differentiation: old concepts and future perspectives. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci., 15: 355-364. 7. Schwartz R. E., Reyes M., Koodie L., Jiang Y., Blackstad M., Lund T., Lenvik T., Johnson S., Hu W. S., Verfaillie C. M., 2002. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. J. Clin. Invest., 109: 1291-1302. 8. Seo M. J., Suh S. Y., Bae Y. C., Jung J. S., 2005. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo. Biochem. Bioph. Res. Com., 328: 258-264. 9. Takahashi M., Saito H., Miyashita T., Kosuga M., Sumisa F., Yamada M., Ebinuma H., Ishii H., 1999. Overexpression of Bcl-2 protects human hepatoma cells from Fas-antibody-mediated apoptosis. J. Hepatol., 31(2): 315-322. 10. Taléns-Visconti R., Bonora A., Jover R., Mirabet V., Carbonell F., Castell J. V., Gómez-Lechón M. J., 2006. Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. World J. Gastroentero., 12(36): 5834-5845. 11. Yang X. R., Xu Y., Shi G. M., 2008. Cytokeratin 10 and Cytokeratin 19: Predictive Markers for Poor Prognosis in Hepatocellular Carcinoma Patients after Curative Resection. Clin. Cancer Res., 14: 3850-3859. EXPERIMENTAL RESEARCH ON EVALUATING DIFFERENTIATION ABILITY OF ADIPOSE- DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS INTO HEPATOCYTE- LIKE CELLS IN VITRO Nguyen Thi Kim Nguyen, Truong Hai Nhung, Mai Thi Trang, Nguyen Hai Nam, Pham Van Phuc University of Science, Viet Nam National University Ho Chi Minh city SUMMARY Mesenchymal stem cells (MSCs) have many properties that suggest considerable potential utility in cellular therapy of many disorders. It was proved that MSCs have characteristics including extensive proliferative potential and the ability to undergo multilineage differentiation. In previous publications, it was demonstrated that hADSCs (human adipose-derived stem cells) could alleviate liver fibrosis in CCl4 induced - liver fibrosis mouse model by differentiating into hepatocytes replacing damaged hepatocytes or inducing proliferation of endogenous cells in liver for functioning. In this experiment, hADSCs isolated from Vietnamese women’s adipose tissue were used to evaluate ability of differentiation into hepatocyte-like cells in vitro. After differentiation, properties of hADSCs-derived hepatocyte-like cells were determined by changes of morphology, hepatocyte-specific gene expression (α-fetoprotein, albumin, cytokeratin 18, cytokeratin 19) and functionally tested by cytoplasmic accumulation of glycogen. The results showed that hADSCs differentiated into hepatocyte-like cells in vitro successfully by changes of morphology, increase in gene expression and ability of cytoplasmic glycogen accumulation. This study is the fundamental experiment for further experiments on using transplantation of hADSCs as treatment methods of liver disorders. Keywords: Cirrhosis, hepatocytes, hepatic differentiation, stem cells. Ngày nhận bài: 15-7-2013