Cấu trúc chủng nấm men Pichia Pastoris biểu hiện mini-Proinsulin dạng tiết ra môi trường nuôi cấy

TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 45 C4U TRÚC CHNG N4M MEN PICHIA PASTORIS BI<U HI
N MINI-PROINSULIN D NG TIT RA MÔI TRƯ=NG NUÔI C4Y Ngô Th3 Kim H:ng, Võ Minh Trí, Tr.n Linh Thư>c Trưng Đi hc Khoa hc T nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nh
n ngày 21 tháng 03 năm 2011, hoàn chnh sa cha ngày 09 tháng 04 năm 2012) TÓM T
T: Đái tháo ñư ng là mt trong nhng căn bnh ñang rt ñưc quan tâm hin nay. Nh m mc ñích sn xut insulin tái t hp phc v ñiu tr bnh ñái tháo ñư ng, chúng tôi dòng hóa và biu hin miniproinsulin trong Pichia pastoris. Đon DNA mang gen mã hóa miniproinsulin-6xHis (MPI-6xHis) ñưc dòng hóa vào vector pPICZαA to plasmid pPICZαA/h-mpi ñ cu trúc chng P. pastoris GS115::h-mpi biu hin MPI tái t hp dng tit ra ngoài môi trư ng. Kiu hình và kiu gen ca P. pastoris GS115::h-mpi ñưc xác ñnh b ng PCR và c,t hn ch. MPI ñưc biu hin * dng dung hp vi th 6xHis khi cm ng vi methanol vi n$ng ñ cu i cùng 0,5% sau 96 gi . T khóa: biu hin gen, Pichia pastoris, mini-proinsulin. M Đ(U Đái tháo ñưng (ĐTĐ) là mt trong nhng căn b nh ñang ñưc quan tâm hàng ñ$u hi n nay. B nh ĐTĐ, chim khong 60-70% trong các b nh ni tit, là nguyên nhân gây t vong ñng hàng th năm " các nưc phát tri n và ñang tăng ñt bin " nhiu nưc ñang phát tri n, các nưc công nghi p mi. Hàng năm trên th gii có khong 3,2 tri u ngưi cht vì b nh ĐTĐ [4]. Ngày nay, vi c s dng insulin ñưc xem là mt ph$n không th thiu ñi vi b nh nhân mc b nh ĐTĐ, ñ c bi t là ĐTĐ týp 1 [6]. Vì th, vi c sn xut insulin ngưi bng con ñưng protein tái t& hp ñã và ñang là gii pháp hi u qu nht hi n nay. Phương pháp sn xut insulin ngưi tái t& hp da trên mt chu8i protein (proinsulin) thay vì 2 chu8i ñã ñưc kh3ng ñnh ưu th v k thut và hi u qu thu nhn insulin có hot tính. G$n ñây, mô hình mini-proinsulin (MPI) ñã ñưc nghiên cu vi nhiu ưu ñi m. Mini- proinsulin có cu trúc tương t vi proinsulin, ch khác là có ci tin thay th ñon peptide ñ$u carboxyl (ñ$u C) t nhiên 31 amino acid trong proinsulin bng mt ñon peptide ngn hơn (9 amino acid), giúp d# dàng cho vi c tinh ch và gia tăng hi u qu gp cun d0n ñn tăng hi u sut hình thành insulin có hot tính hơn mô hình proinsulin. Đon peptide C ngn hơn làm tăng kh năng gp cun lên 20-40% so vi proinsulin " cùng n%ng ñ [1]. Pichia pastoris là h thng bi u hi n protein ngoi lai ñang ñưc các nhà khoa hc chú ý b"i nhng ñ c tính ưu vi t như có th thc hi n nhng bin ñ&i sau dch mã, nuôi cy " mt ñ cao to lưng sinh khi ln trong quá trình lên men, thao tác d# dàng [3]. Ngoài ra, h thng P. pastoris có th sn xut lưng ln protein Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 46 mc tiêu vi ngu%n nguyên li u methanol r9 tin và ít b tp nhi#m. Nhm mc ñích sn xut mt lưng ln insulin tái t& hp ca ngưi ñ phc v ñiu tr b nh ñái tháo ñưng, chúng tôi tin hành cu trúc chng nm men P. pastoris GS115::h-mpi bi u hi n MPI tái t& hp dng tit vào trong môi trưng nuôi cy. Ki u hình và ki u gen ca chng P. pastoris GS115::h-mpi cũng như kh năng bi u hi n protein dung hp MPI-6xHis dng tit ñưc xác ñnh. V!T LI
U VÀ PHƯƠNG PHÁP Chng vi sinh v9t, plasmid và m?i Chng ch E. coli DH5α [F-, φ80lacZ∆M15, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1] ñưc dùng ñ dòng hóa các gen (Takara). Chng Pichia pastoris GS115 [Mut+, his4] ñưc s dng ñ bi u hi n protein mc tiêu. Plasmid pMZZIn có ngu%n gc t' plasmid pUC19 mang ñon gen h-mpi ñưc dùng làm khuôn trong PCR thu nhn gen h-mpi. pPICZαA (Invitrogen) là vector sát nhp vào P. pastoris có kích thưc khong 3,6 kb, mang gen kháng Zeocin, trình t tit α-factor cho phép bi u hi n protein mc tiêu " dng tit. Gen mc tiêu ñưc ñiu khi n b"i promoter 5’AOX1. C p m%i 3’PHTI_Xba (GTA CTC TAG ATT AGT TAC AGT AGT TCT CCA G) và 5’PHTI_Xho (ATG CCT CGA GAA AAG AGA AGA AGC TGA AGC TGA AGC TCC AAA GCA TCA CCA TCA CCA TCA CGG TGG AAG ATT TGT CAA CCA ACA TCT GTG) ñưc dùng ñ khuch ñi gen h-mpi. C p m%i 5’AOX1 và 3’AOX1 (Invitrogen) ñưc dùng ñ sàng lc và ki m tra plasmid tái t& hp, gii trình t ñ%ng thi ki m tra ki u gen th bin np P. pastoris. C8u trúc chng E. coli DH5α mang plasmid tái t, hp pPICZαA/h-mpi Quy trình to dòng E. coli DH5α mang plasmid tái t& hp pPICZαA/h-mpi ñưc thc hi n như sau: thu nhn gen h-mpi mã hóa protein mini-proinsulin dung hp vi th 6x histidine (6xHis-MPI) bng PCR t' khuôn là plasmid pMZZIn s dng c p m%i ñ c hi u 5’PHTI_Xho và 3’PHTI_Xba. Chương trình chy PCR: 95 C/5′; 30 chu kỳ: 94 C/1′, 55 C/45″, 72 C/2′; kt thúc: 72 C/10′. Sn ph!m PCR ñưc ct vi XhoI và XbaI ñ to ñ$u dính; thc hi n phn ng ni gen h-mpi vào pPICZαA ñã ñưc ct m" vòng bng enzyme tương ng ñ hình thành plasmid tái t& hp pPICZαA/h-mpi. pPICZαA/h-mpi ñưc bin np vào E. coli DH5α bng phương pháp bin np calcium lnh [8]. Dòng t bào E. coli DH5α mang pPICZαA/h-mpi ñưc sàng lc trên môi trưng LB agar cha Zeocin n%ng ñ cui là 25 fg/ml và ki m tra dòng mc tiêu bng PCR khu!n lc vi c p m%i 5’AOX1 và 3’AOX1. Chương trình chy PCR: 95 C/5′; 30 chu kỳ (94 C/1′, 55 C/45″, 72 C/2′); 72 C/10′. Dòng t bào mang pPICZαA/h-mpi cho sn ph!m PCR vi kích thưc 751 bp ñưc ki m tra trên gel 1% agarose. Các th bin np ñưc tách chit plasmid bng phương pháp SDS kim [8]. Plasmid sau khi thu nhn ñưc ki m tra bng PCR plasmid (s dng c p m%i 5’AOX1 và 3’AOX1) và phương pháp ct hn TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 47 ch vi XhoI và XbaI. Nhng plasmid dương tính ñưc gii trình t vi kit BigDyeTM Terminator (Macrogen Inc., Hàn Quc). Kt qu gii trình t ñưc so sánh ñ tương ñ%ng vi trình t lý thuyt bng ph$n mm Jellyfish. C8u trúc chng P. pastoris GS115::h-mpi mang plasmid tái t, hp pPICZαA/h-mpi Nhm tăng hi u sut thành công trong quá trình sát nhp plasmid vào b gen P. pastoris, pPICZαA/h-mpi ñưc x lý vi SacI thành dng th3ng. Sau ñó, plasmid này ñưc bin np vào P. pastoris GS115 bng xung ñi n vi hi u ñi n th 2,5 kV, ñi n tr" 200 g và thi gian phát sung là 5 mili giây. Dòng t bào P. pastoris tái t& hp ñưc sàng lc trên môi trưng YPDS agar b& sung Zeocin ñ ñt n%ng ñ cui 100 fg/ml. Sau ñó các th bin np ñưc ki m tra ki u hình da trên s phát tri n ñ%ng ñu trên môi trưng MDH (minimal dextrose with histidine) và MMH (minimal methanol with histidine); ki m tra ki u gen bng PCR vi c p m%i 5’AOX1 và 3’AOX1. Chương trình chy tương t như PCR khu!n lc. Xác ñ3nh kh năng biAu hin MPI dng tit ra ngoài môi trư0ng nuôi c8y Cm ng bi u hi n P. pastoris GS115::h-mpi bng methanol: Cy mt khu!n lc ñơn vào 50 ml BMGY và nuôi cy lc " 30 C qua ñêm cho ñn khi OD580 ñt 2-6. Ly tâm 4000 rpm, 5 phút " 4 C. Chuy n sang 200 ml BMMY ñ cm ng s bi u hi n protein mc tiêu (OD580 = 1 " thi ñi m 0 h). Sau m8i 24 gi b& sung methanol vào môi trưng BMMY nuôi cy ñ ñt n%ng ñ cui 0,5%. Sau 96 gi thu dch môi trưng, b& sung PMSF (phenyl methyl sulphonyl fluoride) ñ ñt n%ng ñ cui là 1 mM và gi " -30 C. S bi u hi n protein mc tiêu MPI-6xHis ñưc ki m tra bng SDS-PAGE và kh3ng ñnh li bng lai Western s dng kháng th ñ c hi u kháng insulin HUI018 (ñưc cung cp t' tin s Peer Nobert Jorgensen (Novo Nordisk, Đan Mch)) và phát hi n nh kháng th anti- mouse IgG-HRP (Abcam). KT QU VÀ THO LU!N C8u trúc chng E. coli DH5α mang pPICZαA/h-mpi Plasmid pMZZIn mang gen h-mpi ñưc dùng làm khuôn trong PCR thu nhn gen h-mpi bng c p m%i 5’PHTI_Xho và 3’PHTI_Xba. Sn ph!m PCR cho kích thưc khong 250 bp phù hp vi kích thưc d kin là 263 bp (Hình 1, ging 2). Các th bin np ñưc sàng lc bng PCR khu!n lc vi c p m%i 5’AOX1 và 3’AOX1. Plasmid t' nhng th bin np cho kt qu PCR khu!n lc dương tính ñưc tách chit ñ ki m tra bng PCR và ct hn ch (Hình 2). S hi n di n ca gen h-mpi ñưc ki m tra bng PCR vi các c p m%i 5’AOX1 và 3’AOX1 (bt c p ñ c hi u trên vector) và 5’PHTI-Xho và 3’PHTI-Xba (bt c p ñ c hi u trên gen h-mpi). Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 48 Hình 1. Đi n di ñ% sn ph!m PCR gen h-mpi t' plasmid pMZZIn (2), thang chu!n DNA 1 kb (1). Hình 2. Đi n di ñ% sn ph!m PCR ca pPICZαA (2), pPICZαA/h-mpi bng c p m%i 5’AOX1_3’AOX1 (3), pPICZαA/h-mpi bng c p m%i 5’PHTI-Xho và 3’PHTI- Xba (4), Sn ph!m ct pPICZαA bng XhoI (5), Sn ph!m pPICZαA/h-mpi bng XhoI (6), pPICZαA/h-mpi bng XhoI và XbaI (7), thang chu!n DNA 1 kb (1). Sn ph!m PCR ca pPICZαA/h-mpi (Hình 2, ging 4) có kích thưc khong 250 bp, tương ng vi kích thưc gen h-mpi ñưc khuch ñi bng m%i ñ c hi u 5’PHTI-Xho và 3’PHTI-Xba (263 bp). Bên cnh ñó, sn ph!m PCR plasmid tái t& hp vi c p m%i 5’AOX1 và 3’AOX1 có kích thưc khong 751 bp tương ng vi gen h-mpi (263 bp) cng 1 ph$n trình t gia hai m%i trên vector (Hình 2, ging 3). Sn ph!m pPICZαA/h-mpi ct bng XhoI và XbaI cho hai vch tương ng vi kích thưc pPICZαA (3505 bp) và gen h-mpi (263 bp) (Hình 2, ging 7). Trong khi ñó, sn ph!m PCR pPICZαA (không mang gen h-mpi) bng c p m%i 5’AOX1 và 3’AOX1 có kích thưc 589 bp (Hình 2, ging 2). pPICZαA/h-mpi cha gen mc tiêu h-mpi ñưc gii trình t ñ ki m tra ñ chính xác v trình t cũng như ñ ñ%ng khung dch mã. Trình t nhn ñưc có ñ tương ñ%ng 100% và ñ%ng khung dch mã vi trình t lý thuyt. C8u trúc P. pastoris GS115::h-mpi mang pPICZαA/h-mpi sát nh9p vào b gen pPICZαA thuc dng vector sát nhp, khi bin np nó sát nhp vào b gen ca t bào ch thông qua tái t& hp tương ñ%ng. pPICZαA/h- mpi ñưc bin np vào P. pastoris GS115 bng ñi n bin np. Các th bin np ñưc sàng lc da trên kh năng kháng kháng sinh zeocin. Nhng khu!n lc d tuy n ñưc thu nhn và tip tc ki m tra ki u gen và ki u hình s dng methanol. KiAu hình và kiAu gen các P. pastoris GS115::h-mpi Sau khi sàng lc trên môi trưng YPDS- Zeo100, các th bin np ñưc ki m tra ki u hình bng cách ria ñ%ng thi lên môi trưng MDH và MMH. Da vào tc ñ phát tri n ca chúng trên c hai môi trưng ñ xác ñnh ki u hình (Hình 3). TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 49 Hình 3. Ki u hình th bin np GS115::h-mpi trên môi trưng MDH (A) và MMH (B). MDH là môi trưng ti thi u cha dextrose còn MMH là môi trưng cha methanol làm ngu%n carbon duy nht. Th bin np ñưc tri trên hai môi trưng, nu tc ñ tăng trư"ng ñ%ng ñu thì chng t* th bin np có kh năng s dng methanol mnh hay nói cách khác, chúng có ki u hình Mut+ (Methanol utilization plus). Ngưc li, nu th bin np tăng trư"ng chm trên môi trưng MMH thì s+ có ki u hình Muts. Qua kt qu tăng trư"ng trên hai môi trưng MDH và MMH, cho thy các th bin np chn lc ñưc có ki u hình Mut+. Đ xác nhn s phù hp gia ki u hình và ki u gen mang gen h-mpi, DNA b gen ñưc ly trích t' các th bin np và thc hi n PCR bng c p m%i 5’AOX1 – 3’AOX1. Sn ph!m PCR vi khuôn là b gen t' các chng Mut+ và c p m%i 5’AOX1 – 3’AOX1 có kích thưc khong 2200 bp (cha gen AOX1) (Hình 4, ging 3) còn t' chng MutS thì không có. Đ%ng thi ñi vi các chng mang gen h-mpi xut hi n vch DNA có kích thưc 751 bp (Hình 4, ging 4) Các th bin np có ki u hình Mut+ cho hai sn ph!m PCR: 751 bp (do c p m%i bt c p vi trình t tương ñ%ng 5’AOX1 và 3’AOX1 trên plasmid pPICZα/h-mpi ñã sát nhp vào b gen) và 2200 bp (do c p m%i bt c p vi trình t 5’AOX1 và 3’AOX1 shn có trên b gen ca P. pastoris GS115) (Hình 4, ging 4). Trong khi ñó, b gen ca P. pastoris không ñưc sát nhp b"i pPICZα/h-mpi cho mt vch 2200 bp do m%i ch bt c p vi trình t 5’AOX1 và 3’AOX1 shn có trên b gen (Hình 4, ging 3). Nhng th bin np có ki u hình Mut+ cho kt qu ki u gen như d ñoán. Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 50 Hình 4. Đi n di ñ% sn ph!m PCR ca pPICZαA/h-mpi (2), DNA b gen P. pastoris (3), DNA b gen P. pastoris GS115::h-mpi có ki u hình Mut+ (4), thang chu!n DNA 1 Kb (1). Hình 5. Đi n di SDS-PAGE (1-4) và lai Western (5-8). Thang chu!n protein (1, 5); P. pastoris GS115::pPICZαA (2, 6); P. pastoris GS115::h-mpi không ñưc (3, 7) và ñưc cm ng methanol (4, 8). BiAu hin MPI ngoi bào ; P. pastoris GS115::h-mpi Dòng t bào P. pastoris GS115::h-mpi ñưc cm ng bi u hi n gen h-mpi bng methanol có vch protein vi kích thưc khong 8 kDa (Hình 5, ging 4). Các m0u ñi chng (Hình 5, ging 2 và 3) không thy xut hi n vch protein này. Sau ñó protein bi u hi n (dng dung hp 6xHis-MPI) ñưc lai Western vi kháng th ñ c hi u kháng insulin HUI018 và phát hi n nh kháng th anti-mouse IgG-HRP. Vch lai Western (Hình 5, ging 8) có v trí tương ng vi v trí vch protein d ñoán là MPI-6xHis (Hình 5, ging 4). Như vy dòng P. pastoris GS115::h-mpi ñã bi u hi n MPI-6xHis ngoi bào khi cm ng bng methanol. KT LU!N Chng nm men P. pastoris GS115::h-mpi ñã ñưc cu trúc thành công và bi u hi n ñưc protein mc tiêu 6xHis-MPI dng ngoi bào. Bưc ñ$u th nghi m kh năng lên men mt ñ cao bng h thng lên men t ñng BioTron- LiFlus GX GX-05-12302 " quy mô 1 lít ñt hàm lưng khong 178,4mg/l sau 96 gi lên men (D li u không trình bày). Kt qu này nu so vi kt qu ñưc công b b"i Jose M. Paıs và cng s (1,5g/l) v0n còn thp. Tuy nhiên, kt qu nghiên cu ca chúng tôi có th ci thi n sau khi tin hành kho sát các ñiu ki n lên men ti ưu. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 51 CONSTRUCTION OF YEAST PICHIA PASTORIS EXPRESSING SECRETED MINI- PROINSULIN INTO CULTURE Ngo Thi Kim Hang, Vo Minh Tri, Tran Linh Thuoc University Science, VNU-HCM ABSTRACT: Diabetes is one of the diseases, which have recently gained significant attention. In order to produce the recombinant insulin for treating diabetics, we have cloned and expressed a mini- proinsulin in Pichia pastoris. The DNA fragment containing a gene encoding the fusion protein of miniproinsulin-6xhis was cloned into the integrative plasmid pPICZαA resulting in pPICZαA/h-mpi to construct the strain P. pastoris GS115::h-mpi expressing the recombinant MPI as secreted protein into culture. Phenotype and genotype of P. pastoris GS115::h-mpi were confirmed by PCR and restriction pattern. MPI was expressed as a fusion protein with 6xhis tag by supplementing methanol at a final concentration of 0.5% in BMMY culture medium for 96 hours after inducing. Key words: gene expression, mini-proinsulin, Pichia pastoris TÀI LI
U THAM KHO [1]. S. G. Chang, D. Y. Kim, K. D. Choi, J. M. Shin, H. C. Shin. Human insulin production from a novel mini-proinsulin which has high receptor-binding activity, Biochem J. 329, 631-635 (1998). [2]. J. M Cregg, Vedvick, Raschke WC. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Bio/Technology, 11, 905-910 (1993). [3]. R. Daly, M. T. Hearn, Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production, J. Mol. Recognit, 18, 119-138 (2005). [4]. International Diabetes Institute. What is diabetes?, Diabetes fact sheet (2004). [5]. S. Macauley-patrick, M. L. Fazenda, B. McNeil, L. M. Harvey, Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system, Yeast, 22, 249-270 (2005). [6]. N.H. Cưng. Bnh ni tit chuyn hóa ñái tháo ñư ng, Nxb Y Hc Hà Ni (2002). [7]. J. M. Pais-Chanfrau, Y. Garcia, L. Licor, V. Besada, Castellanos-Serra L, Cabello CI, et al, Improving the expression of mini-proinsulin in Pichia pastoris, Biotechnol. Lett, 26, 1269-1272 (2004). [8]. J. Sambrook, D. W. Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Habor, NewYork (2001).