Nghiên cứu thành phần hóa học của dịch chiết lá cây chè xanh ở Truồi, Phú Lộc, Thừa Thiên Huế

Tạp chí Khoa học và Giáo dục, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế ISSN 1859-1612, Số 03(39)/2016: tr. 77-85 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY CHÈ XANH Ở TRUỒI, PHÚ LỘC, THỪA THIÊN HUẾ NGÔ DUY Ý Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế Tóm tắt: Chè xanh là một trong những sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, được sử dụng trong y học, mỹ phẩm, đồ uống nên ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người... Bài báo này trình bày về kết quả nghiên cứu xác định thành phần hóa học của dịch chiết từ lá chè xanh ở Truồi, Phú Lộc, Thừa Thiên Huế. Dựa trên kết quả thu được, chúng tôi xác định hàm lượng nước trong lá chè xanh 73,42% (tính theo khối lượng tươi), hàm hượng chất khô hòa tan 39,87%, polyphenol 12,82%, caffeine 2,9275% (tính khối lượng khô) và hàm lượng kim loại nặng là rất bé. Từ khóa: dịch chiết, kim loại nặng, lá chè, polyphenol, Truồi 1. MỞ ĐẦU Cây chè có tên khoa học học là Camellia sinensis L. được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, nhất là các nước châu Á: Ấn Độ, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam... Từ lâu, người ta đã xem cây chè như một vị thuốc quý, dịch chiết lá chè được sử dụng trong công nghiệp thuộc da. Nước chè là một thức uống ngon, bổ dưỡng, được xem là một thức uống truyền thống có tác dụng giảm nhiệt, giảm mệt mỏi, có khả năng kháng khuẩn, ngăn ngừa sự phát triển của các tế bào ung thư, hạn chế quá trình lão hóa Con người đã và đang khai thác nguồn tài nguyên sinh học quý báu ấy để làm thuốc chữa bệnh, mỹ phẩm, thực phẩm, [2], [4]. Cây chè Truồi ở huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế là một đặc sản nổi tiếng đã bao đời nay, nhưng các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây chè Truồi vẫn chưa đầy đủ. Nhằm góp phần vào việc nghiên cứu một cách sâu hơn và rộng hơn về cây chè của địa phương nên chúng tôi đã chọn hướng nghiên cứu này [2], [4]. 2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.1. Nguyên liệu Chè được thu hái ở làng Truồi, huyện Phú lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế vào tháng 12/2014 và tháng 04/2015. Sau khi thu hái, chè được rửa sạch (tránh dập nát), để ráo nước, đem sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 103oC với thời gian 30 giây để diệt men, hong khô ở nơi thoáng mát, xay nhỏ để chuẩn bị tiến hành chiết soxhlet. Hình 1. Lá chè trước, sau khi sấy và xay nhỏ 78 NGÔ DUY Ý 2.2. Sơ đồ quy trình tách chiết 2.2.1. Quy trình tách chiết polyphenol 2.2.2. Quy trình tách chiết Caffeine Cô quay chân không Nước nóng + NaOH: pH 9,5-10 Dịch chiết Dịch chiết Chiết với CHCl3: 2-3 lần, tỉ lệ 1:1 Phần kết tinh Chiết với EtOAc 2-3 lần, tỉ lệ 1:1 Dịch MeOH Cô cạn, tỉ lệ 1:10 để kết tinh Dịch chiết n-hexan MeOH/H 2 O = 9:1 Kiềm hóa đến pH=9 (dd Na2CO3) Dịch CHCl3 (caffein &.) Polyphenol Nguyên liệu khô Muối tanat tan trong H2O CHCl3 Caffeine tinh khiết Tinh chế Loại H2O H2O + Na2CO3 Lọc Đun nóng Đun nóng Dịch lá chè Bã Caffeine tan trong CHCl3 Đo nhiệt độ nóng chảy Caffeine thô Nguyên liệu lá chè NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY CHÈ XANH... 79 2.3. Thực nghiệm 2.3.1. Chiết soxhlet Tiến hành chiết soxhlet 10g lá chè đã được xay nhỏ với dung môi etanol-nước (60:40), V=200ml trong thời gian 90 phút, ở nhiệt độ 90oC, thu được dịch chiết chè, cô đuổi dung môi thu được chất lỏng sệt có màu nâu sáng. 2.3.2. Điều kiện tối ưu trích ly polyphenol từ lá chè xanh [3], [7] Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết. Bằng thực nghiệm và tham khảo chúng tôi tìm được điều kiện tối ưu như sau: Kích thước nguyên liệu từ 1-5mm; tỷ lệ nguyên liệu-dung môi: 2g:50ml; tỷ lệ dung môi nước-ethanol (40:60); thời gian trích ly: 90 phút, nhiệt độ 90oC. 2.3.3. Định tính sự có mặt của các hợp chất polyphenol Định tích các nhóm hợp chất polyphenol có mặt trong dịch chiết lá chè bằng các phản ứng hóa học đặc trưng. 2.3.4. Khảo sát các hợp chất có trong polyphenol toàn phần Tiến hành sắc kí lớp mỏng silicagel 60-F254 tráng sẵn (Merck-Đức), hệ dung môi triển khai CHCl3:CH3OH : H2O = 10:4: 0,4 (v/v). Kiểm tra bằng thuốc thử Dragendorff và đèn UV để phát hiện các hợp chất có mặt trong polyphenol tổng. 2.4. Các chỉ tiêu cần xác định 2.4.1. Xác định hàm lượng nước Cân 5,0g mẫu thử vào chén sứ, cho vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 70oC trong 120 phút, sau đó nâng lên nhiệt độ 103oC, giữ ở nhiệt độ đó khoảng 180 phút. Hàm lượng % nước được tính như sau: Trong đó: m là khối lượng mẫu thử G1 là khối lượng chén sứ và mẫu thử trước khi sấy (g) G2 là khối lượng chén sứ và mẫu thử sau khi sấy (g) 2.4.2. Xác định hàm lượng tro Cân 5,0g mẫu thử vào cốc nung, cho vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 103oC cho đến khi khối lượng không đổi. Sau đó cho vào lò nung ở nhiệt độ 600oC trong khoảng thời gian 6 giờ. Hàm lượng % tro được tính như sau: m2 - m1 WTr (%) = X 100 m G2 - G1 WTr (%) = X 100 m 80 NGÔ DUY Ý Trong đó: m là khối lượng mẫu cân (g) m1 là khối lượng cốc nung (g) m2 là khối lượng cốc nung và tro (g) 2.4.3. Xác định hàm lượng kim loại nặng Tro thu được sau khi nung, hòa tan bằng acid HNO3 loãng và định mức bằng nước cất trong bình định mức 100ml, xác định hàm lượng các kim loại nặng bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại Đài khí tượng thủy văn khu vực Trung Trung Bộ, số 666, Trưng Nữ Vương, Đà Nẵng. 2.4.4. Kết quả khảo sát hàm lượng chất khô Lá chè xanh được sấy khô và nghiền vụn. Hàm lượng chất khô được xác định bằng lượng cân còn lại sau khi sấy ở 100oC cho đến trọng lượng không đổi. 2.4.5. Xác định hàm lượng chất khô hòa tan Hàm lượng chất khô hòa tan của dịch chiết được xác định bằng khúc xạ kế cầm tay Model: REF-103, hãng Index, Anh sản xuất. Dùng bình tia chứa nước cất rửa sạch mặt kính, dùng giấy thấm khô. Dùng ống nhỏ giọt lấy vài giọt dịch chiết nhỏ lên mặt kính của khúc xạ kế, đậy nắp lại. Đưa khúc xạ kế về hướng có ánh sáng. Vạch ngăn cách giữa hai vùng xanh và trắng chỉ vào giá trị nào thì giá trị đó chính là nồng độ chất khô hòa tan của dịch chiết. 2.4.6. Tách và xác định nhiệt độ nóng chảy caffeine Caffeine được tách và tinh chế theo sơ đồ 2.2.2. Nhiệt độ nóng chảy của caffeine được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy, Model: M-560 Buchi, Index, Nhật. 2.4.7. Xác định hàm lượng polyphenol toàn phần theo phương pháp Folin-Ciocalteu Bảng 1. Các dung dịch chuẩn acid gallic pha loãng Dung dịch chuẩn acid gallic A B C D E Thể tích của dung dịch gốc acid gallic (ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Nồng độ của chất chuẩn pha loãng (g/ml) 10 20 30 40 50 Hóa chất: Acid gallic của hãng Sigma, Mỹ sản xuất. Hàm lượng polyphenol tổng số % theo chất khô có được khi dựa vào hàm số tuyến tính của đường chuẩn acid gallic và được tính theo công thức: (Dm -Do) *Vm*d WT = x 100 S*m*10.000* Wm Trong đó: Dm: Mật độ quang thu được của dung dịch mẫu Do: Mật độ quang khi x = 0 S: Giá trị hệ số góc (a) NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY CHÈ XANH... 81 m: Khối lượng mẫu phân tích (g) Vm: Thể tích dịch chiết (ml) (10ml) d: Hệ số pha loãng (100) Wm: Hàm lượng chất khô của mẫu phân tích (%) 2.5. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu nhận được xử lý theo phương pháp thống kê và phần mềm MS. Excel. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát hàm lượng nước Bảng 2. Khối lượng nguyên liệu sau khi sấy khô Mẫu Khối lượng mẫu (g) Khối lượng sau khi sấy(g) Mẫu chè 12/2014 5,0 1,330 Mẫu chè 4/2015 5,0 1,328 Trung bình: 1,329 Khối lượng nước có trong 5,0g nguyên liệu: 3,671 Hàm lượng nước (%): 73,42 Nhận xét: Nước là thành phần chính, quan trọng không thể thiếu để duy trì sự sống của cây xanh. Hàm lượng nước chiếm tỷ lệ cao và có sự thay đổi ít nhiều do ảnh hưởng bởi điều kiện sống của cây. 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng tro Bảng 3. Khối lượng và hàm lượng tro Mẫu nung Khối lượng ban đầu (g) Khối lượng sau nung (g) Mẫu chè 12/2014 5,0 0,193 Mẫu chè 4/2015 5,0 0,199 Trung bình: 0,196 Hàm lượng tro (%): 3,92 Nhận xét: Kết quả cho thấy hàm lượng tro trung bình là 3,92%. Trong thành phần của tro có thể có các muối của một số kim loại nặng như Fe, Cu, Pb, Hg, Zn, Sự có mặt của các kim loại này sẽ ảnh hưởng đến tính chất của dịch chiết của lá chè xanh và chất lượng của các sản phẩm làm ra từ lá chè xanh. 3.3. Xác định hàm lượng kim loại nặng Bảng 4. Hàm lượng một số kim loại nặng TT Kim loại Hàm lượng (mg/kg) Tiêu chuẩn hàm kim loại nặng cho phép trong rau quả khô (QCVN 8-2-2011/BYT) (mg/kg) 1 Pb 0,3722 2 2 Cu 1,6415 20 82 NGÔ DUY Ý Nhận xét: Căn cứ vào quyết định QCVN 8-2-2011/BYT của Bộ Y tế về tiêu chuẩn hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép có trong rau quả khô đối với Pb: 2 mg/kg, Cu: 20 mg/kg. Theo kết quả thu được hàm lượng kim loại nặng có trong lá chè Truồi nằm trong giới hạn cho phép đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người khi sử dụng. 3.4. Kết quả khảo sát hàm lượng chất khô Bảng 5. Hàm lượng chất khô Mẫu chè Mẫu tươi (g) Khối lượng khô (g) Hàm lượng chất khô (%) Mẫu chè 12/2014 5 1,328 26,56 Mẫu chè 4/2015 5 1,330 26,60 Trung bình 26,58 Nhận xét: Hàm lượng chất khô trong mẫu chè thu hái ở tháng 12thấp hơn so với hàm lượng chất khô trong mẫu chè được thu hái vào tháng 4 của năm, bởi hai mẫu chè nghiên cứu được thu hái vào hai khoảng thời gian khác nhau trong năm. 3.5. Kết quả hàm lượng chất khô hòa tan (tanin) Bảng 6. Kết quả khảo sát hàm lượng chất khô hòa tan Mẫu lá chè thu hái Hàm lượng chất khô hòa tan (%) Mẫu chè thu hái 12/2014 39,09 Mẫu chè thu hái 4/2015 40,65 Trung bình: 39,87 Nhận xét: Hàm lượng chất khô hòa tan trong mẫu chè được thu hái vào tháng 12/2014 thấp hơn so với mẫu chè được thu hái vào 4/2015. 3.6. Tách caffeine và xác định nhiệt độ nóng chảy của nó Bảng 7. Kết quả xác định hàm lượng caffeine Mẫu chè Lượng caffeine (g) Hàm lượng caffeine % Mẫu chè 12/2014 0,2920 2,920 Mẫu chè 4/2015 0,2935 2,935 Trung bình 2,9275 Nhận xét: Hàm lượng caffeine trung bình thu được trong mẫu chè Truồi có hàm lượng (2,9275%), so với các tài liệu đã từng được công bố là cao hơn không đáng kể. - Caffeine tinh khiết thu được là chất rắn, tinh thể hình kim, màu trắng. - Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của caffeine: Đnc 237oC (tài liệu 235-238oC) 3.7. Kết quả thử sự hiện diện polyphenol trong dịch chiết lá chè Dịch chiết được định tính bằng các thuốc thử cho kết quả như sau: - Thử bằng dung dịch gelatin mặn, cho kết tủa trắng. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY CHÈ XANH... 83 - Thử bằng dung dịch acetate chì bảo hòa, cho kết tủa màu vàng nhạt. - Thử bằng dung dịch FeCl3 1% vào dịch chiết, cho phức màu nâu đen. Nhận xét: Từ kết thu được quả trên chứng tỏ có sự hiện diện của các hợp chất polyphenol trong dịch từ chiết lá chè. 3.8. Khảo sát các hợp chất có trong polyphenol tổng [1], [5], [6], [7] Tiến hành SKLM với bản mỏng silicagel 60-F254 tráng sẵn (Merck-Đức), hệ dung môi triển khai CHCl3:CH3OH:H2O = 10:4:0,4 (v/v). Kiểm tra bằng thuốc thử Dragendorff và đèn UV (=254nm) để phát hiện các hợp chất có trong polyphenol tổng. Kết quả thu được ở dịch chiết lá chè là 3 cấu tử: Cấu tử 1: (Rf = 0,75), cấu tử 2: (Rf = 0,62), cấu tử 3 (Rf = 0,51). Từ kết quả trên, chúng tôi dự đoán trong polyphenol tổng có ít nhất là 3 trong 6 hợp chất catechin: Epigallocatechin gallate (EGCG), Epicatechin gallate (ECG), Epigallo catechin (EGC), Epicatechin (EC), Catechin (C), Gallocatechin (GC). 3.9. Xác định hàm lượng polyphenol toàn phần bằng phương pháp Folin-Ciocalteu 3.9.1. Xây dựng phương trình đường chuẩn acid gallic Bảng 8. Kết quả đo độ hấp thụ quang (OD) của dung dịch chuẩn acid gallic Nồng độ dung dịch acid gallic 0 10 20 30 40 50 OD 0,011 0,165 0,310 0,453 0,612 0,754 3.9.2. Đồ thị và phương trình đường chuẩn Đồ thị 1. Đường chuẩn của acid gallic 3.9.3. Xác định hàm lượng polyphenol trong dịch chiết Tiến hành đo độ hấp thụ quang (OD) của mẫu dịch chiết bằng UV-VIS, tại =765nm, sử dụng cuvete thạch anh với độ dày l=1cm. y = 0.0149x + 0.0128 R² = 0.9998 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 0 10 20 30 40 50 60 Đường chuẩn acid gallic (Phương pháp Folin-Ciocalteu) OD Linear (OD) Nồng độ acid gallic (C) Đ ộ h ấ p t h ụ ( O D ) 84 NGÔ DUY Ý Bảng 9. Kết quả đo độ hấp thụ quang của dịch chiết lá chè Truồi Tính hàm lượng polyphenol % có trong lá chè: Dựa vào kết quả có được ở bảng 3.8 và công thức ở 2.4.7. chúng ta sẽ tính được hàm lượng polyphenol % có trong lá chè Truồi. Bảng 10. Hàm lượng % của polyphenol trong lá chè Truồi Mẫu chè Khối lượng polyphenol (mg)/ 0,2g nguyên liệu Hàm lượng polyphenol % Mẫu chè 12/2014 42,203 12,336 Mẫu chè 4/2015 45,710 13,308 Trung bình 12,822 Nhận xét: Hàm lượng polyphenol toàn phần trong mẫu chè Truồi được thu hái vào tháng 12/2014 thấp hơn so với mẫu chè được thu hái vào thời điểm 4/2015. Khi đối chiếu với hàm lượng polyphenol toàn phần đã từng được công bố trong một số công trình nghiên cứu trước đây thì có hàm lượng thấp hơn. Điều này được giải thích bởi chè Truồi thường được thu hái là những lá chè già chứ không phải là lá non. 4. KẾT LUẬN Trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài, chúng tôi đã đạt được một số kết quả như sau: 4.1. Đã trích ly được dịch chiết lá chè Truồi trong dung môi ethanol-nước, đã tiến hành định tính polyphenol, cho các phản ứng màu đặc trưng với các thuốc thử, chứng tỏ trong dịch chiết lá chè có mặt các hợp chất polyphenol 4.2. Từ kết quả SKLM cho dự đoán có ít nhất 3 cấu tử catechin có mặt trong thành phần polyphenol tổng. 4.3. Đã xác định được một số chỉ tiêu sau đây: Hàm lượng nước của chè Truồi chiếm 73,42%; hàm lượng tro chiếm 3,92%; hàm lượng chất khô hòa tan 39,87%. 4.4. Bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) đã xác định được hàm lượng các kim loại nặng có mặt trong lá chè Truồi là rất bé. Với hàm lượng này thì chè Truồi là một sản phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm khi sử dụng. 4.5. Bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang (UV-VIS), đã xây dựng được phương trình đường chuẩn hồi quy tuyến tính từ đó đã xác định được hàm lượng polyphenol tổng chiếm 12,822% có trong dịch chiết lá chè. Chè Truồi OD C (mg/ml) Độ pha loãng V dịch chiết (ml) Tổng polyphenol (mg)/tổng V dịch chiết từ 0,2g nguyên liệu 12/2014 0,988 65,450.10-3 10 100 65,450 4/2015 1,065 45,710.10-3 10 100 70,617 Hàm lượng polyphenol toàn phần trung bình 68,033 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY CHÈ XANH... 85 4.6. Đã tách được caffeine tinh khiết, đó là những tinh thể hình kim, màu trắng, có nhiệt độ nóng chảy ở 237oC với hàm lượng chiếm 2,9275%. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Hùng Việt (1985). Các phương pháp sắc ký, NXB Khoa học Kỹ thuật. [2] Đỗ Tất Lợi (2006). Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật. [3] Mai Thanh Nga (2013). Nghiên cứu quá trình tương tác oxi hóa của polyphenol chiết xuất chè xanh đến đến polianilin và khả năng ứng dụng chống ăn mòn, Luận án tiến sĩ. [4] Trịnh Xuân Ngọ (2009). Cây chè & kỹ thuật chế biến chè, NXB Khoa học Kĩ thuật và Công nghệ. [5] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB TPHCM. [6] TCVN 9745-1: 2013 ISO 14502-1: 2005. Chè- xác định các chất đặc trưng của chè xanh và chè đen – Phần 1: hàm lượng polyphenol tổng số trong chè – phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu, Hà Nội. [7] Ann E. Hagerman (1998). Tanin Chemistry, Department of Chemistry and Biochemistry, Miani University, Ofoxd, USA. [8] S. Azam, N. Hadi, N.U. Khan, S.M. Had (2004). Prooxidant property of green tea polyphenols epicatechin and epigallocatechin-3-gallate: implications for anticancer properties, Toxicology in Vitro, 18, pp. 555-561. [9] Taha M. Rababah, Navam S. Hettiarachchy and Ronny Horax (2004). “Total Phenolics and Antioxidant Activities of Fenugreek, Green Tea, Black Tea, Grape Seed, Ginger, Rosemary, Gotu Kola, and Ginkgo Extracts, Vitamin E, and tert-Butylhydroquinone”, J. Agric. Food Chem, 52, pp. 5183-5186. [10] Yukihiko Hara Shizuoka (1986). Process for the production of tea catechins, US patent 4, pp. 613- 672. Title: STUDY ON THE CHEMICAL COMPOSITION OF GREEN TEA LEAVES EXTRACT IN TRUOI, PHU LOC, THUA THIEN HUE Abstract: Green tea is one of the products of natural origin, highly affecting on human health. It is used in medicine, cosmetics, beverages... This paper presents the results of determining the chemical composition of the extract from the green tea leaves in Truoi, Phu Loc, Thua Thien Hue province. Based on the obtained results, the water content (in fresh weight), the soluble dry substances, polyphenol, and tanin (dry weight) were found to be 73.42%, 39.87%, 12.82 % and caffeine 2.9275% respectively; the heavy metal content was very small. Keywords: extract, heavy metal, polyphenol, tea leaves, Truoi ThS. NGÔ DUY Ý Khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Huế (Ngày nhận bài: 03/10/2015; Hoàn thành phản biện: 26/10/2015; Ngày nhận đăng: 15/01/2016)