Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme tiêu hóa tôm hùm bông (Panulirus ornatus) và tôm hùm xanh (Panulirus homarus)

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 23 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ pH LÊN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME TIÊU HÓA TÔM HÙM BÔNG (Panulirus ornatus) VÀ TÔM HÙM XANH (Panulirus homarus) EFFECT OF TEMPERATURE AND pH ON THE ACTIVITY OF DIGESTIVE ENZYMES OF ORNATE SPINY LOBSTER (Panulirus ornatus) AND SCALLOPED SPINY LOBSTER (Panulirus homarus) Lại Văn Hùng1, Đỗ Lê Hữu Nam2, Trần Văn Dũng3 Ngày nhận bài: 22/7/2014; Ngày phản b iện thông qua: 06/8/2014; Ngày duyệt đăng: 10/2/2015 TÓM TẮT Hoạt tính của enzyme tiêu hóa trên tôm hùm nói chung và giáp xác nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố bên trong và bên ngoài cơ thể. Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên hoạt tính của enzyme tiêu hóa là cơ sở quan trọng trong sản xuất thức ăn cho tôm hùm. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định ảnh hưởng của các mức nhiệt độ (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 và 900C) và pH (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10) khác nhau lên hoạt tính của các enzyme tiêu hóa tôm hùm bao gồm protease, amylase và lipase. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiệt độ và pH có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của các enzyme tiêu hóa tôm hùm. Protease hệ tiêu hóa tôm hùm hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 600C và pH 7. Hoạt tính của enzyme amylase thể hiện mạnh nhất ở nhiệt độ 500C và pH 7. Chỉ số nhiệt độ và pH thích hợp cho enzyme lipase lần lượt là 300C và 6. Các enzyme này hầu như bất hoạt ở các mức nhiệt độ 10 và 900C hay pH 2 và 9. Từ khóa: amylase, enzyme tiêu hóa, lipase, protease, tôm hùm ABSTRACT The activities of digestive enzymes in spiny lobsters in particular and crustaceans in general depend on several internal and external factors. Determining the effects of some environmental factors on the activities of the digestive enzymes is an important basis in producing pellet feeds for spiny lobsters. This study was carried out in order to evaluate the effects of different temperature levels (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 and 900C) and pH (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10) on the activities of the digestive enzymes of spiny lobsters including protease, amylase and lipase. The results show that temperature and pH had strong effects on activities of digestive enzymes of spiny lobsters. The optimal temperature and pH of protease were found to be 600C and 7. Amylase showed high activity at the temperature and pH of 500C and 7. The optimal temperature and pH of lipase were 300C and 6, respectively. The activities of enzymes were almost unactivated at the temperature of 10 and 900C or pH at 2 and 9. Keywords: amylase, digestive enzymes, lipase, protease, spiny lobster 1 PGS.TS. Lại Văn Hùng, 3 ThS. Trần Văn Dũng: Viện Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang 2 TS. Đỗ Lê Hữu Nam: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Tôm hùm bông (Panulirus ornatus) và tôm hùm xanh (Panulirus homarus) là những đối tượng giáp xác nuôi quan trọng, có giá trị kinh tế cao. Tôm hùm gai nói chung được nuôi phổ biến ở nhiều nước trên thế giới như: New Zealand, Nhật Bản, Việt Nam, Úc, Philippines, Singarpore và Đài Loan [14, 15, 16]. Ở Việt Nam, nghề nuôi tôm hùm bắt đầu từ năm 1992 và không ngừng phát triển cho đến nay. Tuy nhiên, nghề nuôi tôm hùm cũng gặp phải một số khó khăn liên quan đến các vấn đề ô nhiễm môi trường và dịch bệnh mà nguyên nhân được cho là việc sử dụng nguồn thức ăn cá tạp thay vì sử dụng thức ăn công nghiệp [3, 4]. Để khắc phục tình trạng trên, nhiều nỗ lực nghiên cứu sản xuất thức ăn cho tôm hùm được thực hiện trên thế giới và Việt Nam [4]. Hiện nay, thức ăn tổng hợp cho tôm hùm được sử dụng Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2015 24 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ở một số nước thay thế một phần cho nguồn cá tạp, đặc biệt khi nguồn cung gặp khó khăn trong mùa mưa bão [17]. Thức ăn cho tôm hùm nói chung bao gồm thành phần chính là protein, cacbonhydrat, lipid, sterol, cholesterol, lecithin và astaxanthin. Quá trình tiêu hóa thức ăn tôm hùm gồm một chuỗi các quá trình sinh hóa diễn ra trong miệng, dạ dày và ruột dưới tác dụng của các enzyme tiêu hóa. Cơ chế của quá trình tiêu hóa và hấp thụ thức ăn ở tôm hùm diễn ra phức tạp và cần có sự tham gia của các enzyme chính như protease, amylase và lipase [13]. Các enzyme có trong đường tiêu hóa của tôm hùm gai đã được nghiên cứu trên các giống Japonicus panulirus, J. edwardsii, Panulirus interruptus và P. argus [6, 7, 8, 9, 11, 12]. Perera và ctv. (2008) đã chỉ ra rằng tôm hùm gai trong giai đoạn lột xác có sự thay đổi rõ rệt về phương thức sống, nhu cầu sinh lý, sinh hóa trong cơ thể do đó ảnh hưởng đến hoạt động enzyme tiêu hóa cũng như khả năng hấp thụ thức ăn [12]. Hoạt tính của enzyme tiêu hóa ở giáp xác nói chung có sự biến đổi tùy theo giai đoạn phát triển, trạng thái sinh lý và phụ thuộc vào một số yếu tố môi trường. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vấn đề này trên tôm hùm ở Việt Nam hầu như chưa được đề cập. Chính vì vậy, việc nghiên cứu hoạt tính các enzyme hệ tiêu hóa tôm hùm góp phần quan trọng trong việc hoàn thiện công nghệ sản xuất thức ăn và gia tăng hiệu quả sử dụng thức ăn viên trong nuôi tôm hùm ở nước ta. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt tính của enzyme tiêu hóa của tôm hùm bông và tôm hùm xanh. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 12 năm 2012 đến tháng 4 năm 2013. Các thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm thuộc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang và Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh. Đối tượng nghiên cứu là hệ enzyme tiêu hóa của tôm hùm bông (Panulirus ornatus) và tôm hù m xanh (Panulirus homarus) giai đoạn thương phẩm (khối lượng 600 - 700 g/con với tôm hùm bông và 120 - 140 g/con với tôm hùm xanh). Tôm hùm được thu tại đảo Bình Ba, Cam Ranh và vận chuyển sống về phòng thí nghiệm. Tôm đưa vào thí nghiệm khỏe mạnh, vận động linh hoạt, màu sắc tự nhiên, đầy đủ các phần phụ và không có biểu hiện nhiễm bệnh. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm Phương pháp thu mẫu: Mẫu tôm hùm: Tôm hùm sống sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm được tiến hành giải phẫu tách bỏ phần vỏ, thân tôm và cơ quan tiêu hóa. Hình 1. Giải phẫu tôm hùm bông (trái) và tôm hùm xanh (phải) Trích ly enzyme: Tiến hành nghiền hệ tiêu hóa của tôm bằng máy xay. Trong quá trình xay, nhiệt độ được giữ ổn định khoảng 40C bằng đá vụn nhằm tránh sự biến tính của các enzyme tiêu hóa. Phối trộn nguyên liệu đã xay nghiền với dung môi đệm phosphate 0,1 M, pH 7,2 theo tỷ lệ mẫu/dung môi tối ưu là 1/3 [2]. Tiến hành khuấy liên tục hỗn hợp trên máy khuấy từ trong 40 phút. Trong quá trình này, enzyme trong cơ quan tiêu hóa của tôm hùm sẽ hòa tan và khuyếch tán vào dung môi. Sau đó, tiến hành ly tâm lạnh hỗn hợp ở 40C với tốc độ 9.000 vòng/10 phút nhằm mục đích loại bỏ tạp chất không tan có trong dịch enzyme và thu dịch ly tâm. Kết tủa enzyme từ dịch ly tâm bằng cách bổ sung các dung môi hữu cơ (ethanol 960) vào dịch chiết theo tỷ lệ tối ưu dịch chiết/dung môi là 1/4 [2, 5]. Hỗn hợp được giữ ở 40C trong 60 phút, ly tâm với vận tốc 6.000 vòng/10 phút để thu nhận phần kết tủa là chế phẩm emzyme dạng thô. Sau đó, tiến hành hòa tan lại enzyme và lấy dịch enzyme để xác định sự phụ thuộc của hoạt tính enzyme protease, lipase và amylase vào hai yếu tố nhiệt độ và pH. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 25 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme: Xác định hoạt tính của enzyme protease: Enzyme tiêu hóa của tôm hùm sau khi ly trích được ủ với casein 2%, pH 7,0 trong vòng 60 phút ở các mức nhiệt độ: 100C, 200C, 300C, 400C, 500C, 600C, 700C, 800C và 900C. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến [1]. Xác định hoạt tính của enzyme amylase: Enzyme tiêu hóa của tôm hùm sau khi ly trích được ủ với tinh bột 1%, pH 7,0 trong vòng 4 giờ ở các mức nhiệt độ: 100C, 200C, 300C, 400C, 500C, 600C, 700C, 800C và 900C. Xác định hoạt tính amylase theo phương pháp Heinkel [1]. Xác định hoạt tính của enzyme amylase: Enzyme tiêu hóa của tôm hùm sau khi ly trích được ủ với nhũ tương dầu đậu phộng, pH 7,0 trong vòng 2 giờ ở các mức nhiệt độ: 100C, 200C, 300C, 400C, 500C, 600C, 700C, 800C và 900C. Xác định hoạt tính lipase theo phương pháp chuẩn độ Cherry-Crandall [1]. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme: Xác định hoạt tính của enzyme protease: Enzyme tiêu hóa của tôm hùm sau khi ly trích được ủ với casein 2%, trong vòng 60 phút ở các mức pH: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến [1]. Xác định hoạt tính của enzyme amylase: Enzyme tiêu hóa của tôm hùm sau khi ly trích được ủ với tinh bột 1% trong vòng 4 giờ ở các mức pH: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10. Xác định hoạt tính amylase theo phương pháp Heikel [1]. Xác định hoạt tính của enzyme lipase: Enzyme tiêu hóa của tôm hùm sau khi ly trích được ủ với nhũ tương dầu đậu phộng trong vòng 2 giờ ở các mức pH: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10. Xác định hoạt tính lipase theo phương pháp chuẩn độ Cherry-Crandall [1]. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp. 2.2. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0. Sử dụng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (oneway - ANOVA) và phép kiểm định Duncan để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) về ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme protease, amylase và lipase. Toàn bộ số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình (TB) ± sai số chuẩn (SE). III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme tiêu hóa của tôm hùm Hình 2. Trích ly, kết tủa và chuẩn độ hoạt tính của enzyme Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme protease Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2015 26 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Enzyme amylase của tôm hùm thể hiện hoạt tính cao trong khoảng nhiệt độ 50 - 600C. Trong đó, enzyme của tôm hùm xanh hoạt động tốt hơn so với tôm hùm bông trong khoảng nhiệt độ tối ưu này (hình 4). Trên cả hai loài tôm hùm, hoạt tính của enzyme amylase đều đạt giá trị tối ưu ở 500C. Khi tăng hay giảm quanh nhiệt độ tối ưu này 100C, hoạt tính amylase tôm hùm giảm rõ rệt. Enzyme amylase hoạt động yếu ở nhiệt độ 100C, tăng đều và mạnh lên cho đến khi đạt giá trị cực đại ở 500C. Khi tăng nhiệt độ từ 60 - 900C, hoạt tính của enzyme amylase giảm đều và gần như bất hoạt ở 900C. Kết quả nghiên cứu cho thấy, protease của tôm hùm thể hiện hoạt tính tốt ở khoảng 50 - 700C, đạt giá trị tối ưu ở 600C. Hoạt tính protease ở nhiệt độ tối ưu này của tôm hùm xanh cao hơn tôm hùm bông. Protease hoạt động yếu ở nhiệt độ 100C, tăng đều và mạnh lên cho đến khi đạt giá trị cực đại ở 600C. Khi nhiệt độ tăng từ 70 - 900C, hoạt tính của enzyme protease giảm nhanh và gần như bất hoạt ở 900C. Hình 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme amylase Hình 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme lipase Enzyme lipase của tôm hùm thể hiện hoạt tính tốt ở khoảng nhiệt độ từ 30 - 500C, đạt giá trị tối ưu ở nhiệt độ 300C. Hoạt tính của enzyme lipase tăng mạnh trong khoảng nhiệt độ từ 10 - 300C nhưng giảm chậm đều khi mức nhiệt tăng từ 50 - 900C. Lipase hoạt động yếu ở nhiệt độ 100C. Nhiệt độ tăng trong khoảng 70 - 900C làm giảm rõ rẹt hoạt tính của enzyme lipase và gần như bất hoạt ở nhiệt độ 900C. 2. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme hệ tiêu hóa tôm hùm Hình 6. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme protease Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 27 Hoạt tính của enzyme protease ở tôm hùm tăng dần trong khoảng pH từ 2 - 6. Khi tăng pH trong vùng này bằng cách giảm dần độ a xít thì hoạt tính protease tăng đều nhưng chậm điều này có thể là do protease tôm hùm cũng giống các loài tôm he nói chung đều không có pepsin hoạt động trong môi trường a xít [2]. Hoạt tính của enzyme protease tôm hùm đạt giá trị cực đại ở pH 7. Việc tăng hay giảm pH từ giá trị tối ưu về phía kiềm hay a xít đều làm giảm đáng kể hoạt tính của enzyme này. Hình 7. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme amylase Amylase của tôm hùm thể hiện tăng dần trong khoảng pH từ 2 đến 6, đạt giá trị cực đạt tại pH 7 đến 8. Khi tiếp tục gia tăng pH, hoạt tính của enzyme amylase giảm đột ngột và gần như bất hoạt ở mức pH 10. Hoạt tính lipase tôm hùm đạt giá trị cực đại ở pH 6, quanh giá trị pH tối ưu này về cả hai phía kiềm và a xít, hoạt tính của enzyme lipase đều giảm đi rõ rệt (hình 8). IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Enzyme protease hệ tiêu hóa tôm hùm hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 60˚C và pH 7. Amylase hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 500C và pH 7. Lipase hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 300C và pH 6. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung xác định độ bền nhiệt của enzyme hệ tiêu hóa tôm hùm. Đồng thời, nghiên cứu ảnh hưởng một số yếu tố khác lên hoạt tính của enzyme tiêu hóa như nồng độ muối, ion kim loại, probiotics và kháng sinh. Hình 8. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme lipase TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: 1. Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Như Nhứt, 2006.Phương pháp kiểm tra một số enzyme dùng trong chăn nuôi. Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2015 28 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 2. Nguyễn Lệ Hà, 2010. Nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus monodon vào chế biến thủy sản, Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật, Trườ ng Đạ i họ c Nha Trang. 3. Đỗ Thị Hòa, 2000. Thức ăn trong nuôi tôm hùm tại Khánh Hòa : Thực trạng và tiềm năng. Trong: Báo cáo của hội thảo khoa học về nuôi lồng trên biển. 4. Lại Văn Hùng, 2007. Nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng để sản xuất thức ăn dạng viên nuôi tôm Hùm (Panulirus ornatus) bằng lồng từ giai đoạn giống đến cỡ thương phẩm tại vùng biển Khánh Hò a. Báo cáo tổng kết đề tài, Trường Đại học Nha Trang. 5. Đỗ Văn Ninh, 2004. Tối ưu hóa quá trình phân giải protein của proteza trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phâm. Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật, Trườ ng Đạ i họ c Nha Trang. Tiếng Anh 6. Celis-Gerrero, L. E., García-Carreño, F. L., Navarrete del Toro, M. A., 2004. Characterization of proteases in the digestive system of spiny lobster (Panulirus interruptus). Mar. Biotechnol., 6: 262-269 7. Iida, Y. , Nakagawa, T., Nagayama, F., 1991. Properties of collagenolytic proteinase in Japanese spiny lobster and horsehair crab hepatopancreas. Comp. Biochem. Physiol. B 98: 403–410. 8. Johnston, D. J. 2003. Ontogenetic changes in digestive enzymology of the spiny lobster, Jasus edwardsii Hutton (Decapoda, Palinuridae). Marine Biology 143: 1071-1082. 9. Navarrete del Toro, M. A., García-Carreño, F. L., Díaz-López, M., Celis-Gerrero, L., Saborowski, R., 2006. Aspartic proteinases in the digestive tract of marine decapod crustaceans. J. Exp. Zool., 305 A: 645-654 10. Patrícia F. Castro, Augusto C. V. Freitas Jr., Werlayne M. Santana, Helane M. S. Costa, Luiz B. Carvalho Jr., and Ranilson S. Bezerra, 2012. Comparative study of amylases from the midgut gland of three species of Penaeid shrimp, Journal of Crustacean Biology: 607-613. 11. Perera E., Iliana F., Olimpia C., Eugenio D., Raul C., Marysabel B.,, Germa´n S.G., 2004. Evaluation of practical diets for the Caribbean spiny lobster Panulirus argus (Latreille, 1804): effects of protein sources on substrate metabolism and digestive proteases. Aquaculture 244: 251-262. 12. Perera, E., Moyano, F.J., Díaz, M., Perdomo-Morales, R., Montero-Alejo, V., Rodriguez- Viera, L., Alonso, E., Carrillo, O., Galich, G.S., 2008. Changes in digestive enzymes through developmental and molt stages in the spiny lobster, Panulirus argus. Comp. Biochem. Physiol. B Comp. Biochem. 151: 250-256. 13. Simon, C.J., 2009. Digestive enzyme response to natural and formulated diets in cultured juvenile spiny lobster, Jasus edwardsii. Aquaculture, 294: 271-281. 14. Smith D.M., Williams K.C., Irvin S., Barclay M. and Tabrett S., 2003. Development of a pelleted feed for juvenile tropical spiny lobster (Panulirus ornatus): response to dietary protein and lipid. Aquaculture Nutrition 9: 231-237. 15. Tuan L.A. and Mao N.D., 2004. Present status of lobster cage culture in Vietnam. In: Williams, K.C. (ed). Spiny lobster ecology and exploitation in the South China Sea Region. ACIAR Proceeding, Vol. 120. Australia Centre fo International Agriculture Research, Canberra, Australia: 21-25. 16. Williams K.C., Smith D.M., Irvin S.J., Barclay M.C. and Tabrett S.J. 2005. Water immersion time reduces the preference of juvenile tropical spiny lobster Panulirus ornatus for pelleted dry feeds and mussel fl esh. Aquaculture Nutrition 11: 415-426. 17. Williams K.C. 2007. Nutritional requirements and feeds development for post-larval spiny lobster: A review. Aquaculture 263: 1-14.