Khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA ở các điều kiện bảo quản khác nhau

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 85 KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ĐỘT BIẾN GEN purA Ở CÁC ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN KHÁC NHAU ASSESSTMENT OF DEVELOPMENT OF purA GENE KNOCKED-OUT EDWARDSIELLA ICTALURI STRAIN IN THE DIFFERENT STORE CONDITATIONS Nguyễn Thị Chi1, Võ Văn Nha2 Ngày nhận bài: 10/11/2014; Ng ày phản biện thông qua: 21/12/2015; Ngày duyệt đăng: 25/12/2015 TÓM TẮT Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) từ chủng E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam (E. ictaluri WT). Kết quả nghiên cứu cho thấy sự phát triển của chủng E. ictaluri PAM ở các điều kiện bảo quản khác nhau cũng tương tự như sự phát triển của chủng E. ictaluri WT. Số lượng tế bào chủng E. ictaluri PAM có thể tồn tại ở mật độ khoảng 108 cfu/ống ở điều kiện bảo quản bằng lạnh sâu -300C, nhiều hơn so với việc bảo quản bằng thạch BHI nghiêng có và không có phủ dầu khoáng ở 40C sau 90 ngày bảo quản. Từ khóa: Edwardsiella ictaluri đột biến gen purA, gen purA, vắc xin ABSTRACT The study was conducted to determine the growth of purA gene knocked-out Edwardsiella ictaluri strain (E. ictaluri PAM) from pathogenic strains of E. ictaluri ESC catfi sh in the Mekong Delta, Vietnam (E. ictaluri WT). The results showed that in different storage conditions, the purA gene knocked-out strain (E. ictaluri PAM) had similar growth as the E. ictaluri WT. The number of E. ictaluri PAM strain cells was about 108 cfu/ tube in cold storage conditions at -300C, that was higher than in inclined BHI agar none or under oil at 40C after 90 days. Keywords: purA gene knocked-out Edwardsiella ictaluri, purA gene, vaccine 1 Nguyễn Thị Chi: Cao học Nuôi trồng thủy sản 2011 – Trường Đại học Nha Trang 2 TS. Võ Văn Nha: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thế giới, các nghiên cứu đã phát hiện ra rằng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là một tác nhân gây bệnh quan trọng trên cá nheo ở Mỹ, cá trê trắng ở Thái Lan và trên một số loài cá da trơn khác ở Indonesia, Trung Quốc [1]. Ở Việt Nam, tạ i hộ i thả o bà n về tá c nhân gây bệ nh gan thậ n mủ trên cá tra do Bộ NN&PTNT tổ chứ c tạ i thà nh phố Hồ Chí Minh cũ ng đã đi đế n kế t luậ n rằ ng: Vi khuẩ n E. ictaluri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi tạ i Việ t Nam. Bệnh nhiễm khuẩn gây bởi E. ictaluri đã làm tổn thất lớn cho nghề nuôi cá da trơn ở Mỹ hàng năm từ 20-30 triệu USD [6]. Ở Việt Nam, E. ictaluri làm chết cá tra nuôi từ 10-90%, gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá tra hàng năm [4]. Vi khuẩn E. ictaluri có đặc tính sinh miễn dịch rất mạnh [7]. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 86 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Thune và cộng sự (1997) đã tạ o ra chủng vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA (LSU-E2), chủ ng chủng E. ictaluri đột biến gen purA (LSU-E2) đượ c đem thử nghiệ m độ c lực cho thấ y, cá thí nghiệ m tiêm chủ ng LSU-E2 ở nồng độ 105 và 106 cfu/cá , có tỷ lệ chết tích lũy của cá là 0% , trong khí đó vớ i nồ ng độ tiêm tương tự đố i vớ i chủ ng E. ictaluri hoang dạ i ban đầ u thì tỷ lệ nà y tương ứ ng là 96,7% và 100% [6]. Nghiên cứu này đã cung cấp thêm căn cứ cho thấy khả năng phòng bệnh gan thận mủ cá tra của chủng E. ictaluri đột biến gen purA bằng công nghệ đột biến gen là chấp nhận được. Năm 2010-2012, chương trình công nghệ sinh học cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì đã tạo được dòng E. ictaluri đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) nhược độc, có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch, làm nguyên liệu sản xuất vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng công nghệ đột biến gen (knocked-out gene) [4].Tuy nhiên, cho đến nay việc lưu giữ, bảo quản chủng E. ictaluri đột biến gen purA chưa thấy có tài liệu đề cập. Nghiên cứu này nhằm xác định khả năng phát triển của chủng vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA ở các điều kiện bảo quản khác nhau. Từ đó có được điều kiện bảo quản phù hợp, phục vụ sản xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh gan thận mủ cá tra. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu Chủng E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) từ chủng E. ictaluri chưa đột biến, gây bệnh gan thận mủ cá tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long (E. ictaluri WT) có độc lực cao được cung cấp bởi đề tài cấp Nhà nước ở Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III. Môi trường phân lập, nuôi cấy tăng sinh, đã được sử dụng, gồm: Môi trường nuôi cấy không chọn lọc BHIA (Brain Heart Infusion Agar), hãng Biorad - Mỹ và môi trường nuôi cấy chọn lọc EIM (Edwardsiella Ictaluri Medium) theo Shotts và Waltman (1990) cho phân lập chủng E. ictaluri; Môi trường BHIB (Brain Heart Infusion Broth), hãng Biorad - Mỹ được sử dụng để nuôi cấy tăng sinh chủng E. ictaluri. Ngoài ra, một số hóa chất, kháng sinh: Kanamycin, colistin sulphate, thuốc nhuộm Gram (cồn, acetone, fucsine, crystian violet), chlorin, NaCl, paraffi n, cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu này. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Xác định các chỉ tiêu về hình thái của E. ictaluri Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri: Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường BHIA (Peptone: 10 g; Veal Brain heart extract: 12,5 g; Beef Brain heart extract: 5 g; NaCl: 5 g; Disodium phosphate: 2,5 g; Glucose: 2 g; Agar: 15 g; Nước cất cho đủ 1000 ml) ở nhiệt độ 28oC, sau 48 giờ, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc bằng mắt thường và đo kích thước khuẩn lạc bằng thước đo có độ chính xác đến mm. Hình dạng, kích thước vi khuẩn E. ictaluri: Được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram [5], soi và đo kích thước vi khuẩn trên kính hiển vi (Olympus CX 31, Nhật) có gắn trắc vi thị kính, quan sát ở độ phóng đại 1000 lần. 2.2 Khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn được lưu giữ trên thạch nghiêng BHI ở 40C + Vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) và E. ictaluri chưa đột biến (E. ictaluri WT) giữ đông ở -800C được đem nuôi cấy phục hồi trên môi trường EIM, ủ ở 280C sau 48 giờ. Sau đó chọn một khuẩn lạc đơn (có màu xanh lá, trong mờ) trên môi trường EIM, tăng sinh trong môi trường BHIB chứa 50 µg/ml Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 87 colistin (đối với chủng E. ictaluri WT) và môi trường BHIB chứa 50µg adenine/ml, 50 µg/ml colistin + 50 µg/ml kanamycin (đối với chủng E. ictaluri PAM). Tiến hành nuôi cấy lắc ở 280C, 250 vòng/phút trong 24 giờ. + Lấy 10ml dịch vi khuẩn li tâm ở 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C thu phần huyền phù cặn (vi khuẩn) sao cho đạt giá trị OD600nm khoảng 1,0 (tương đương khoảng 109CFU/ ml); kiểm tra mật độ vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo phương phá p gián tiếp của Koch để xác định mật độ vi khuẩn ban đầu đem bảo quản, đồng thời nhuộm gram để xác định hình dạng và kích thước khi đem bảo quản. + Chia dịch huyền phù (vi khuẩn) với thể tích 1ml vào ống thạch nghiêng BHI đã được chuẩn bị sẵn, sau đó đem bảo quản ở nhiệt độ 40C. + Sau mỗi 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ 40C, 3 ống thạch nghiêng đem bảo quản được lấy ra nuôi cấy để kiểm tra hình dạng, kích thước vi khuẩn trên môi trường thạch BHI theo phương pháp gián tiếp của Koch để xác định mật độ vi khuẩn sau 30 ngày bảo quản. Thí nghiệm được tiến hành theo dõi trong 90 ngày. 2.3. Khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn được lưu giữ trên thạch nghiêng BHI có phủ lớp dầu khoáng (paraffi n) ở 40C + Phương pháp được tiến hành tương tự như mục 2.2 nhưng dịch huyền phù vi khuẩn sau khi được đưa vào các ống thạch nghiêng BHI đã được chuẩn bị trước được đem phủ một lớp dầu khoáng dày 1 – 2 cm rồi mới đem bảo quản ở nhiệt độ 40C. + Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như mục 2.2. 2.4. Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn được lưu giữ bằng phương pháp lạnh sâu (âm 300C) + Các bước chuẩn bị vi khuẩn đem bảo quản tương tự như mục 2.2. Tuy nhiên, vi khuẩn sau khi ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút được trộn với 10% glycerol đã được thanh trùng (về thể tích) như là chấ t chố ng đông. + Dùng pipet Pasteur hút khoảng 1ml dịch huyền phù đưa vào trong ống lạnh sâu và đóng nắp. Bao ống lạnh sâu bằng paraffi n. + Toàn bộ các ống lạnh sâu đem bảo quản được để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào vi khuẩn. + Các ống lạnh sâu đem bảo quản được làm lạnh từ từ (thang 50C/lần) đến -300C và cuối cùng bảo quản ở - 300C. + Sau mỗi 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ -300C, kiểm tra hình dạng, kích thước và mật độ vi khuẩn đem bảo quản tương tự như phương pháp bảo quản bằng thạch nghiêng. Thí nghiệm được tiến hành theo dõi trong 30 ngày. Lưu ý: khi đem các ống lạnh sâu bảo quản ở nhiệt độ -300C để kiểm tra hình dạng, kích thước và mật độ vi khuẩn thì cần phải được hoạt hóa bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (đưa ngay vào tủ ấm 370C trong 40 giây). III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Kết quả khảo sát kích thước của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) theo thời gian và điều kiện bảo quản khác nhau Vi khuẩn E. ictaluri PAM sau mỗi 30 ngày bảo quản ở các điều kiện khác nhau: Thạch BHI nghiêng và thạch BHI nghiêng có phủ dầu khoáng ở nhiệt độ 40C, bảo quản lạnh sâu -300C được kiểm tra kích thước trên kính hiển vi. Kết quả khảo sát kích thước của chủng E. ictaluri bị đột biến gen purA theo thời gian và điều kiện bảo quản khác nhau được thể hiện ở bảng 1. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 88 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Kết quả từ bảng 1 cho thấy: + Chiều dài vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) ở các điều kiện bảo quản khác nhau không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Tuy nhiên, theo thời gian bảo quản: 0, 30, 60 và 90 ngày lại cho sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05) ở điều kiện bảo quản bằng thạch BHI nghiêng và bảo quản bằng thạch BHI nghiêng có bổ sung dầu khoáng (ngoại trừ giai đoạn 30 đến 60 ngày) (Bảng 1); còn ở điều kiện bảo quản lạnh sâu -300C trong 30 ngày bảo quản, không cho sự khác biệt về kích thước vi khuẩn so với ban đầu, nhưng lại khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05) sau 60 ngày bảo quản (bảng 1). + Kích thước khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo thời gian và điều kiện bảo quản khác nhau không cho sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Sở dĩ trong cùng một thời gian bảo quản, ở các điều kiện bảo quản khác nhau kích thước của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) không cho sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p>0,05), có thể là do ở điều kiện bảo quản bằng thạch BHI nghiêng và thạch BHI nghiêng phủ dầu khoáng ở nhiệt độ 40C là tương tự nhau, việc phủ một lớp dầu khoáng dày 1 – 2 cm chỉ giúp vi khuẩn không thể tiếp xúc trực tiếp được với không khí nên không thể phát triển được. Còn bảo quản ở lạnh sâu -300C do đã được bổ sung glycerol – chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh, đồng thời nhờ vào việc giảm nhiệt độ từ từ trong quá trình bảo quản mẫu nên đã hạn chế được rất nhiều việc tế bào vi khuẩn có thể bị vỡ do quá trình làm lạnh và làm tan mẫu (do việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào vi khuẩn). Do vậy, vi khuẩn E. ictaluri PAM được bảo quản ổn định. Bảng 1. Kích thước chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) và E. ictaluri chưa bị đột biến gen (E. ictaluri WT) theo thời gian và điều kiện bảo quản khác nhau Điều kiện bảo quản Thời gian bảo quản (ngày) Thạch nghiêng Thạch nghiêng + dầu khoáng Lạnh sâu Thạch nghiêng Thạch nghiêng + dầu khoáng Lạnh sâu Kích thước khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri PAM sau 24 giờ (mm) Kích thước (chiều dài) vi khuẩn E. ictaluri PAM sau 24 giờ (µm) 0 2,42 ± 0,14 2,42 ± 0,14 2,42 ± 0,14 3,0 ± 0,25 3,0 ± 0,25 3,0 ± 0,255 30 2,17 ± 0,38 2,18 ± 0,52 2,25 ± 0,25 2,88 ± 0,033 2,75 ± 0,25 2,92 ± 0,380 60 1,92 ± 0,29 2,00 ± 0,25 1,67 ± 0,29 2,33 ± 0,52 2,50 ± 0,25 2,67 ± 0,14 90 1,42 ± 0,29 1,58 ± 0,14 2,33 ± 0,14 2,50 ± 0,25 Kích thước khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri WT sau 24 giờ (mm) Kích thước (chiều dài) vi khuẩn vi khuẩn E. ictaluri WT sau 24 giờ (µm) 0 2,43 ± 0,21 2,43 ± 0,21 2,43 ± 0,21 2,80 ± 0,30 2,80 ± 0,30 2,80 ± 0,30 30 2,20 ± 0,10 2,20 ± 0,26 2,40 ± 0,10 2,6 ± 0,40 2,60 ± 0,4 2,8 ± 0,40 60 2,23 ± 0,21 2,33 ± 0,21 2,17 ± 0,38 2,6 ± 0,30 2,80 ± 0,30 2,9 ± 0,40 90 2,10 ± 0,26 2,13 ± 0,06 - 2,40 ± 0,14 2,80 ± 0,29 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 89 Kết quả từ hình 1 cho thấy, không có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p>0,05) giữa số lượng tế bào vi khuẩn chủng E. ictaluri đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) và chủng E. ictaluri chưa bị đột biến (E. ictaluri WT) theo thời gian bảo quản bằng thạch BHI nghiêng ở 40C. Tuy nhiên, số lượng tế bào vi khuẩn của chủng E. ictaluri PAM và chủng E. ictaluri WT giảm nhanh theo thời gian bảo quản, đặc biệt sau 90 ngày bảo quản, mật độ tế bào cả hai chủng đều là 0 CFU/ml. Như vậy, có thể thấy rằng thời gian lưu giữ chủng vi khuẩn E. ictal- uri PAM (đột biến gen purA) bằng phương pháp thạch BHI nghiêng chỉ duy trì trong 60 ngày, sau thời gian bảo quản trên, bắt buộc phải được cấy truyền sang môi trường mới. Kết quả kiểm tra kích thước chủng vi khuẩn E. ictaluri PAM (đột biến gen purA) sau 60 ngày bảo quản (bảng 1) cũng cho thấy kích thước vi khuẩn E. ictaluri PAM bị giảm dần theo thời gian bảo quản và chủng vi khuẩn E. ictaluri PAM bị chết đi sau 90 ngày. Điều này cũng đúng với những thông báo trước đây của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2001) [2], Nguyễn Đức Hùng và cộng sự (2004) [3] cho rằng, phương pháp bảo quản bằng thạch nghiêng (phương pháp cấy truyền vi sinh vật) chỉ bảo quản được vi sinh vật trong một thời gian ngắn (không quá 3 tháng), sau đó vi sinh vật phải được cấy truyền sang môi trường mới trước khi già và chết đi. 2.2. Ở điều kiện bảo quản bằng thạch nghiêng có phủ dầu khoáng ở 40C Kết quả theo dõi khả năng phát triển của chủng vi khuẩn E. ictaluri PAM (đột biến gen purA) và chủng vi khuẩn vi khuẩn E. ictaluri WT (chưa đột biến) ở điều kiện bảo quản bằng thạch BHI nghiêng có phủ dầu khoáng ở 40C trong 90 ngày thể hiện ở hình 2: 2. Kết quả khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) ở các điều kiện bảo quản khác nhau 2.1 Ở điều kiện bảo quản bằng thạch nghiêng ở 40C Kết quả theo dõi khả năng phát triển của chủng E. ictaluri PAM và E. ictaluri chưa đột biến (E. ictaluri WT) ở điều kiện bảo quản bằng thạch BHI nghiêng ở 40C trong 90 ngày thể hiện ở hình 1. Hình 1. Đồ thị kết quả khảo sát số lượng tế bào E. ictaluri PAM và E. ictaluri WT theo thời gian bảo quản bằng thạch BHI nghiêng ở 40C Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 90 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Kết quả từ hình 2 cho thấy số lượng tế bào vi khuẩn chủng E. ictaluri đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) và chủng E. ictaluri chưa đột biến (E. ictaluri WT) giảm dần theo thời gian bảo quản bằng thạch BHI nghiêng có phủ dầu khoáng ở 40C, tuy nhiên sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Khác với bảo quản bằng thạch BHI nghiêng ở 40C, 2 chủng vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA và E. ictaluri chưa đột biến bảo quản bằng thạch BHI nghiêng có phủ dầu khoáng ở 40C không cho sự giảm nhanh về số lượng tế bào vi khuẩn theo thời gian bảo quản, đặc biệt ở 30 ngày đầu khi bảo quản. Sở dĩ vậy có thể là do lớp dầu khoáng ở bề mặt thạch BHI nghiêng đã hạn chế được sự tiếp xúc của vi khuẩn đối với oxy không khí và hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch. Do vậy, chủng vi khuẩn đem bảo quản giảm sự phát triển và không bị già và chết đi, nên số lượng tế bào vi khuẩn chỉ giảm ít so với ban đầu theo thời gian bảo quản. 2.3. Ở điều kiện bảo quản bằng lạnh sâu -300C Kết quả theo dõi khả năng phát triển của chủng vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA và E. ictaluri chưa đột biến ở điều kiện bảo quản bằng lạnh sâu -300C trong 90 ngày thể hiện ở hình 3. Kết quả từ hình 3 cho thấy không có sự giảm đáng kể về số lượng tế bào vi khuẩn của chủng E. ictaluri đột biến gen purA và E. ictaluri chưa đột biến ở điều kiện bảo quản bằng lạnh sâu -300C theo thời gian. Sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Theo Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2001) [2], phương pháp bảo quản lạnh sâu vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-300C). Trong quá trình bảo quản lạnh sâu, chủng vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA và E. ictaluri chưa đột biến được trộn glycerol nên đã làm hạn chế tốc độ lạnh sâu (trước khi đưa mẫu vào bảo quản) và làm tan nhanh (khi lấy mẫu bảo quản ra sử dụng); đồng thời với đó là việc sử dụng kỹ thuật giảm nhiệt độ từ từ (thang 50C/ lần) cho đến -300C và kỹ thuật hoạt hóa mẫu bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (khi lấy mẫu bảo quản ra sử dụng) nên đã hạn chế được rất nhiều tế bào vi khuẩn bị vỡ và bị chết do quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Do vậy, số lượng vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA Hình 2. Đồ thị kết quả khảo sát số lượng tế bào E. ictaluri PAM và E. ictaluri WT theo thời gian bảo quản bằng thạch BHI nghiêng có phủ dầu khoáng ở 40C Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 91 2.4. Kết quả khảo sát khả năng phát triển của chủng E. ictaluri đột biến gen purA ở các điều kiện bảo quản khác nhau Khi khảo sát khả năng phát triển của chủng E. ictaluri đột biến gen purA ở các điều kiện bảo quản khác nhau: Bằng thạch BHI nghiêng, bằng thạch BHI nghiêng có phủ dầu khoáng ở 40C và bằng lạnh sâu (-300C) trong 90 ngày, kết quả thể hiện ở hình 4 và bảng 2. Kết quả từ hình 4 và bảng 2 cho thấy, theo thời gian và điều kiện bảo quản khác nhau thì số lượng tế bào vi khuẩn chủng E. ictaluri đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Cụ thể, chủng E. ictaluri PAM bảo quản bằng thạch BHI nghiêng có số lượng tế bào vi khuẩn và giá trị OD giảm đáng kể sau 60 – 90 ngày bảo quản. Kết quả này cũng phù hợp với những nhận định của Nguyễn Lân Dũng (2001) [2], Nguyễn Đức Hùng và cộng sự (2004) [3] về bảo quản chủng vi sinh vật bằng thạch nghiêng. Trong khi đó, số lượng tế bào vi khuẩn và giá trị OD của chủng E. ictaluri PAM giảm không đáng kể trong điều kiện bảo quản bằng lạnh sâu ở -300C. và E. ictaluri chưa đột biến được duy trì ổn định. Hình 3. Đồ thị kết quả khảo sát số lượng tế bào E. ictaluri PAM và E. ictaluri WT theo thời gian bảo quản bằng lạnh sâu ở -300C Hình 4. Đồ thị kết quả khảo sát mật độ tế bào vi khuẩn E. ictaluri PAM bảo quản ở các điều kiện khác nhau theo thời gian Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 92 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tóm lại, sự phát triển của chủng vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) ở các điều kiện bảo quản khác nhau cũng tương tự như sự phát triển của chủng E. ictaluri chưa bị đột biến (E. ictaluri WT) ban đầu. Đồng thời, ở điều kiện bảo quản bằng lạnh sâu -300C vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA có thể tồn tại ở mật độ 108CFU/ống sau thời gian bảo quản 90 ngày. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Kí ch thướ c khuẩ n lạ c vi khuẩn E. ictaluri bị đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo thời gian và điều kiện bảo quản khác nhau không cho sự sai khác. Kí ch thướ c chiều dài vi khuẩn E. ictaluri PAM giảm dần theo thời gian bảo quản, nhưng lại như nhau ở các điều kiện bảo quản khác nhau. Trong cùng môi trường bảo quản bằng thạch BHI nghiêng ở 40C, số lượng tế bào vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) và chưa đột biến (E. ictaluri WT) giảm nhanh theo thời gian bảo quản và vi khuẩn không còn sống sau 90 ngày bảo quản. Còn trong điều kiện bảo quản bằng thạch BHI nghiêng có phủ thêm dầu khoáng ở 40C, số lượng tế bào chủng vi khuẩn E. ictaluri PAM, E. ictaluri WT chỉ giảm ít so với ban đầu theo thời gian bảo quản và vi khuẩn vẫn còn sống sau 90 ngày bảo quản. Trong khi đó, ở điều kiện bảo quản lạnh sâu (-300C), số lượng tế bào vi khuẩn E. ictaluri PAM và E. ictaluri WT không giảm nhiều theo thời gian bảo quản. Sự phát triển của chủng vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA (E. ictaluri PAM) ở các điều kiện bảo quản khác nhau cũng tương tự như sự phát triển của chủng chưa E. ictaluri bị đột biến (E. ictaluri WT). Số lượng tế bào vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA (E. ictaluri ) theo thời gian và điều kiện bảo quản khác nhau có sự khác nhau. Ở điều kiện bảo quản bằng lạnh sâu -300C, vi khuẩn E. ictaluri PAM có thể tồn tại ở mật độ khoảng 108 CFU/ống, nhiều hơn so với việc bảo quản bằng thạch BHI nghiêng có và không có phủ dầu khoáng ở 40C sau 90 ngày bảo quản. 2. Kiến nghị Cần tiếp tục nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA qua nhiều thế hệ cấy chuyền. Nghiên cứu qui trình bảo quản chủng vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen purA trên những môi trường khác nhau. Bảng 2. Kết quả khảo sát sự phát triển của chủng E. ictaluri PAM ở các điều kiện bảo quản khác nhau Thời gian bảo quản (ngày) Mật độ tế bào (x 106 CFU/ống) Thạch BHI nghiêng ở 40C Thạch BHI nghiêng + dầu khoáng ở 40C Lạnh sâu ở -30 0C 0 383,33 ± 11,54 383,33 ± 11,54 383,33 ± 11,54 30 101,67 ± 10,41 183,67 ± 10,01 310,00 ± 10,00 60 1,73 ± 0,32 3,80 ± 0,62 201,67 ± 10,41 90 0,00 ± 0,00 1,23 ± 0,35 17,33 ± 9,71 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Từ Thanh Dung, Crumlish M., Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh, Đặng Thị Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí Khoa học - Đại học Cần Thơ, tr. 137-142. 2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến & Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội. 3. Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng, Huỳnh Lê Tâm, 2004, Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thức phẩm thủy sản, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 4. Võ Văn Nha, 2010. Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dùng làm vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng kỹ thuật đột biến gen, Báo cáo kết quả thực hiện đề tài cấp Nhà nước năm 2010, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III. Tiếng Anh 5. Barrow G. I., and Feltham R. K. A., 1993. Cowan and Steel’s manual for the indentifi cation of medical bacteria, 3rd ed., Cambridge University Press, Cambridge, p. 262. 6. Thune R.L., Hawke J.P., Fernandez D.H., Lawrence M.L., and Moore M.M., 1997. Immunization with bacterial antigens: edwardsiellosis, In: Fish Vaccinology, Gudding R., Lillehaug A., Midtlyng P.J. and Brown P.J., eds. Dev. Biol. Stand., Karger, Basel, Switzerland, (90), pp. 125-134. 7. Thune R. L., D. H. Fernandez, and J. R. Battista, 1999. An aroA mutant of Edwardsiella ictaluri is safe and effi cacious as a live, attenuated vaccine, Journal of Aquatic Animal Health, 11(4), pp. 358-372.