Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

ó độ nhớt nhất định; Không chứa các yếu tố độc hại; Hoàn toàn vô trùng. Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng. Nguyên tắc Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hoá các chất dinh dưỡng của từng loại sinh vật. Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật. Đảm bảo các điều kiện hoá lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. Pha môi trường Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự hướng dẫn trong tài liệu. + Môi trường lỏng: Cân, đong các chất rồi cho hoà tan vào nước. + Môi trường đặc: Cân agar và hoá chất cho vào bình tam giác hay becher rồi hoà tan trong nước, đun trên bếp hay hấp trong autoclave. Chuẩn bị môi trường a. Thạch nghiêng Cho vào ống nghiệm với một lượng môi trường đặc 1/3 đến 1/4 ống nghiệm. Để ống thạch ở vị trí nghiêng thích hợp cho đến lúc thạch đặc lại hoàn toàn. Vị trí đầu trên của mặt nghiêng không vượt quá 2/3 chiều cao ống nghiệm. Không để thạch chạm vào nút bông, khi làm nghiêng tốt, mặt thạch nghiêng bằng phẳng, không bị đứt, chiều dài vừa phải, không ngắn quá, dài quá. b. Thạch đứng Cho vào ống nghiệm với một lượng môi trường chiếm 1/2 đến 2/3 ống nghiệm. Thạch nguội sẽ đông lại và ta sẽ có ống thạch đứng. Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường chiếm 1/2 - 1/3 bình. c. Làm thạch hộp petri Đun thạch chảy lỏng, để nguội đến 50-600C. Tay phải cầm bình (hoặc ống) môi trường đã chảy lỏng, giữ hơi nghiêng, dùng tay trái xoay và rút nút bông ra, vô khuẩn miệng bình (hoặc miệng ống trên đèn cồn). Dùng tay trái hé mở nắp hộp vừa phải và nhanh tay rót vào hộp một lượng môi trường thích hợp. Nhanh chóng đậy nắp hộp lại, xoay tròn hộp từ từ trên bàn để thạch dàn thành một lớp đều trên đáy hộp. Không xoay mạnh làm thạch bắn tung lên. Hé mở nắp hộp và để yên cho đến lúc thạch đặc lại hoàn toàn. Đậy nắp lại, lật ngược hộp cho đáy lên trên. Hộp thạch đổ tốt, mặt thạch phải đều, bằng phẳng, lớp thạch không dày quá hoặc mỏng quá (thường khoảng 2mm). Hình 1: Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và đĩa petri Số môi trường chưa dùng đến phải bảo quản ở chỗ mát, nhiệt độ từ 0 - 50C, không để môi trường bị khô, bị tác dụng của ánh sáng. Dù môi trường mới chuẩn bị hay đã bảo quản lâu, trước khi đem dùng đều phải kiểm tra sự vô khuẩn. Muốn vậy, ta để môi trường trong tủ ấm có nhiệt độ từ 37 - 380C trong 2 – 3 ngày lấy ra quan sát và loại bỏ những ống (hoặc bình) môi trường có vi sinh vật phát triển (bị đục hoặc có khuẩn lạc). Điều chỉnh độ pH của môi trường: Điều chỉnh độ pH của môi trường dùng HCl 10% hay NaCl 10%. Ngoài ra có một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3... Lập nhãn môi trường vừa thực hiện: Tên môi trường: .................................................... Khử trùng: ngày ......... tháng ........... năm ............ DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG Dụng cụ Dụng cụ Số lượng Đơn vị Đèn cồn 6 Cái Đĩa petri 60 Cái Ống nghiệm 60 Cái Pipet 1ml 6 Cái Pipet 10ml 6 Cái Becher 100ml 12 Cái Hóa chất và môi trường Agar 30g Môi trường tổng hợp PCA (plate count agar) 23.5g Cồn 960 2 lít Nước cất 5 lít THỰC HÀNH Pha cồn 700 Đổ môi trường thạch ống nghiệm và đĩa petri Chuẩn bị môi trường PCA (plate count agar) àViết báo cáo CHUẨN BỊ Mẫu nước: sinh hoạt và nước thải Mẫu đất HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 1 1. Số liệu báo cáo ỐNG NGHIỆM . ỐNG NGHIỆM .. ỐNG NGHIỆM .. ĐẠT KHÔNG ĐĨA PETRI . ĐĨA PETRI .. ĐĨA PETRI .. ĐẠT KHÔNG ĐĨA PETRI (PCA) . ĐĨA PETRI (PCA) .. ĐĨA PETRI (PCA) .. ĐẠT KHÔNG Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: Tại sao phải vô trùng? Các phương pháp vô trùng và tiệt trùng? Tại sao lại mở nắp đĩa petri khi chuẩn bị môi trường thạch? Tại sao phải điều chỉnh độ pH? Có mấy dạng môi trường thạch ống nghiệm? Nêu các đặc trưng cho từng loại môi trường? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ Xác định hay định lượng vi sinh vật là xác định số lượng cá thể tồn tại trong một đơn vị vật phẩm hoặc canh trường. Để định lượng, cần phải thao tác đúng quy cách một số vấn đề như: lấy mẫu, pha loãng mẫu PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU Để đánh giá chính xác số lượng vi sinh vật, yêu cầu đầu tiên là mẫu phải được lấy và bảo quả đúng kỹ thuật. Tùy theo yêu cầu nghiên cứu, đối tượng nghiên cứu và các chỉ tiêu sinh học cần phân tích mà khối lượng mẫu cũng như quy cách lấy mẫu (số lượng, vị trí, thời gian) khác nhau.Tuy nhiên, việc lấy mẫu cần tuân theo những yêu cầu sau: Dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải vô trùng: đẩm bảo độ thuần khiết, tránh tạp nhiễm đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích. Dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải sạch, không độc hại với vi sinh vật, tránh làm chết hoặc ức chế vi sinh vật trong vận chuyển và bảo quản. Các yêu cầu về khối lượng và tính đặc thù của mẫu: + Đủ khối lượng theo yêu cầu phân tich + Đúng nơi quy định và vào thời điểm phù hợp với yêu cầu nghiên cứu + Mẫu trung bình và điển hình Bảo quản: mẫu lấy xong phân tích ngay. Nhiệt độ thường không để mẫu quá 30 phút. Nếu lấy mẫu xa, cần có thiết bị phân tích hiện trường hoặc bảo quản ở nhiệt độ thấp (0-50C), thời gian bảo quản không quá 24 giờ. Các yêu cầu khác: mẫu cần được dán nhãn và ghi rõ + Mã số của mẫu + Loại và mục đích lấy mẫu + Tên và chức năng của người lấy mẫu +Yêu cầu phân tích PHA LOÃNG MẪU Chuẩn bị mẫu Yêu cầu của việc lấy mẫu: - Lấy mẫu có tính chất đại diện. - Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý, hoá, sinh học. - Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng. - Lấy mẫu xong phải phân tích ngay và không được để quá 24h. - Ghi nhật ký của mẫu và nơi thu mẫu. Pha loãng mẫu : - Chuẩn bị một bình chứa mẫu cần phân tích - Một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng - Một số pipet vô trùng. - Pha loãng mẫu cần phải thực hiện trong tủ cấy hoặc phòng vô trùng a. Mẫu ở trạng thái lỏng : Pha loãng mẫu theo dãy thập phân 1/10 (10-1), 1/100 (10-2), 1/1000 (10-3), 10-n Hình 2.1: Phương pháp pha loãng mẫu nước theo dãy thập phân b. Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực phẩm) Môi trường đất nhìn chung rất thuận lợi cho nhiều nhóm vi sinh vật phát triển. Hệ vi sinh vật đất rất đa dạng gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn Số lượng vi sinh vật phụ thuộc vào hàm lượng chất hữu cơ, tính chất cơ lý cũng như độ ẩm của đất, số lượng cá thể thường rất lớn. Các bước tiến hành: - Lấy mẫu đất: mẫu đất mang phân tích có tính đại diện nên số lượng mẫu tùy theo yêu cầu nghiên cứu khác nhau. Mẫu đất lấy từ 10-20g cho mỗi vị trí, lấy 4 mẫu của 4 góc vuông và 1 mẫu ở tâm, độ sâu nhất định và mẫu phải được trộn đều trước khi sử dụng. - Chuẩn bị dụng cụ: Một bình tam giác 250 ml chứa 90ml nước cất vô trùng Một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng Một số pipet vô trùng. - Pha loãng mẫu: cân 10 g đất (hoặc mẫu) cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng. Lắc 10 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như trạng thái lỏng. Tuỳ theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít. Hình 2.2: Phương pháp pha loãng mẫu đặc theo dãy thập phân KỸ THUẬT TRẢI ĐĨA Hình 2.3: Minh họa kỹ thuật trải đĩa Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch (tương đương với 2 giọt dịch). Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều và khoảng 25-300 CFU (coliform unit: đơn vị khuẩn lạc). Sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch, que gạt thuỷ tinh được vô khuẩn bằng cách nhúng vào trong cồn, đốt cháy phần cồn còn lại trên que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Làm nguội que cấy bằng cách nhẹ nó vào bề mặt thạch, rồi dàn đều lượng chất lỏng chứa tế bào trên đó. Lớp chất lỏng trên thạch càng mỏng, sự hấp thu xảy ra càng nhanh. Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài ở nhiệt độ 300C và ủ trong 48 giờ. Kết quả: Số khuẩn lạc (CFU) x Độ pha loãng CFU/g = ------------------------------------------------- Thể tích mẫu (ml) THỰC HÀNH Dụng cụ Tên Số lượng Đơn vị Đèn cồn 6 Cái Đĩa petri 60 Cái Pipet 1ml 6 Cái Pipet 10ml 6 Cái Becher 100ml 12 Cái Que trang 6 Cái Ống nghiệm 30 Cái Hóa chất và môi trường Môi trường Plate count agar (PCA) tổng hợp 23,5g hay môi trường thành phần gồm: Trypton, 5.0g; Yeast extract, 2.5g; Glucose, 1.0g; Agar,15g. Cân chính xác khối lượng môi trường cho vào becher 1,5 lít và thêm vào 1 lít nước cất. Đun nóng hỗn hợp đến khi tan đều rồi cho vào erlen 1,5 lít đem hấp khử trùng. Lưu ý, trong khi đun môi trường cần phải khuấy thường xuyên để môi trường không bị lắng và khét. Sau đó, hấp khử trùng ở 1210C, 1atm và thời gian 30 phút. Chuẩn bị: Cồn 960 2 lít Nước cất 5 lít NaCl tinh khiết 10g Thực hành Pha nước muối sinh lý 0,9% Pha loãng mẫu (mẫu nước và đất) Đổ đĩa. Trải đĩa àĐọc kết quả và viết báo cáo HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 2 1. Số liệu báo cáo Nồng độ pha loãng 1 .. 2 3 . ĐẠT Số khuẩn lạc KHÔNG Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: Tại sao phải pha loãng mẫu? Các bước pha loãng mẫu? Vi sinh vật hiếu khí có ở đâu trong môi trường? ý nghĩa của việc xác định tổng vi khuẩn hiếu khí? Tại sao phải khử trùng hay sát trùng toàn bộ: môi trường, dụng cụ, tay trong quá trình thao tác? Ý nghĩa việc khử trùng và sát trùng? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi BÀI 3: XÁC ĐỊNH TỔNG VI KHUẨN KỴ KHÍ KỸ THUẬT ĐỔ MÔI TRƯỜNG VI KHUẨN KỴ KHÍ Phân lập các vi sinh vật kị khí trên môi trường đặc ở đĩa petri. Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không khí trong môi trường. Để nguội môi trường còn 45 - 500C. Hút 0,1 ml mẫu vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm. Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa petri và đậy thật nhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí. Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri. Nuôi trong bình yếm khí: sau khi cấy vi khuẩn xong, cho vào bình yếm khí. Thoa một lớp parafin lỏng lên miệng bình, đốt đèn cồn hay đèn cầy lên và đặt vào bình, đậy nắp lại, hoặc dùng máy hút chân không. Cho vào tủ ấm, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường, dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp. Ngoài ra, người ta còn sử dụng phương pháp xác định tổng vi khuẩn kị khí bằng ống nghiệm đậy nút cao su nhưng môi trường nuôi cấy phải bổ sung đầy đủ glucose, trypticase, yeast và một số các muối khoáng khác cho vi khuẩn phát triển, đặc biệt phải bổ sung các tác nhân khử như cystein và Na2S vào môi trường. Thao tác thực hiện: Môi trường sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-460C. Bổ sung vài giọt Na2S + NaHCO3 để khử hết O2 trong môi trường. Cân 1g mẫu đất và pha loãng mẫu bằng nước cất vô trùng theo dãy thập phân liên tiếp, tiến hành pha loãng đến nồng độ thích hợp sao cho khuẩn lạc mọc trên đĩa khoảng 30 - 300. Không để mẫu trong nước pha loãng lâu hơn 30 phút. Hút 1ml mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm vô trùng. Rót môi trường ở nhiệt độ 40-460C vào ống nghiệm có chứa mẫu. Rót môi trường nhẹ nhàng tránh không tạo bọt khí và không để môi trường tràn ra ngoài. Đậy ống nghiệm bằng nút cao su vô trùng. Chờ cho thạch đông cứng lại và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày đếm các khuẩn lạc riêng rẽ quan sát được. THỰC HÀNH Dụng cụ Tên Số lượng Đơn vị Đèn cồn 6 Cái Ống nghiệm 60 Cái Pipet 1ml 6 Cái Pipet 10ml 6 Cái Becher 100ml 12 Cái Hóa chất và môi trường Thành phần môi trường NH4NO3 2g KH2PO4 1g NaCl 10g MgSO4.7H20 3,3g Glucose 1g Pepton 5g Cao men 0,5g Agar 12g Sau khi khử trùng ở 1210C trong 15 phút, môi trường có pH 7.0 – 7.2. Cách pha hỗn hợp Na2S + NaHCO3: Cân 0,75g Na2S và 0,3g NaHCO3 pha trong 30ml nước cất. Môi trường sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-460C. Bổ sung vài giọt Na2S + NaHCO3 để khử hết O2 trong môi trường. Cồn 960 2 lít Nước cất 5 lít NaCl tinh khiết 10g Thực hành Pha loãng mẫu (mẫu nước và đất) Đổ ống nghiệm àĐọc kết quả và viết báo cáo CHUẨN BỊ Đổ môi trường PGA HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 2 1. Số liệu báo cáo Nồng độ pha loãng 1 .. 2 3 . ĐẠT Số khuẩn lạc KHÔNG Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: Tại sao phải sử dụng dung dịch Na2S + NaHCO3 ? Vi sinh vật kỵ khí có ở đâu trong môi trường? ý nghĩa của việc xác định tổng vi khuẩn kỵ khí? Phân biệt sự khác nhau giữa vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí? Ý nghĩa việc xác định tổng vi khuẩn kỵ khí trong môi trường? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi BÀI 4: XÁC ĐỊNH TỔNG VI NẤM NGUYÊN TẮC Nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển trong khoảng 20 – 280C, một số ít là ưa nóng và ưa lạnh. Vi nấm có khả năng sinh trưởng trong vùng pH từ 2-9, nhưng pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 – 6,5. Hầu hết vi nấm đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí. Mật độ vi nấm trong mẫu được xác định dưới dạng tổng vi nấm bằng kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường thích hợp. THỰC HÀNH Dụng cụ Tên Số lượng Đơn vị Đèn cồn 6 Cái Đĩa petri 60 Cái Pipet 1ml 6 Cái Pipet 10ml 6 Cái Becher 100ml 12 Cái Hóa chất và môi trường Thành phần môi trường: Khoai tây 300g Glucose 20g Agar 15g Pha chế môi trường: Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ và lọc lấy dịch lọc, sau đó bổ sung đường và agar vào hấp khử trùng. Sử dụng acid lactic chỉnh pH đến 5,5 để ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Chuẩn bị: Cồn 700 2 lít Cồn 960 2 lít Nước muối sinh lý 1 lít Nước cất 5 lít Thực hành Đổ môi trường Trải đĩa àĐọc kết quảvà viết báo cáo CHUẨN BỊ Chuẩn bị môi trường Lauryl Sulphate broth (LSB) HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 4 1. Số liệu báo cáo Nồng độ pha loãng 1 .. 2 3 . ĐẠT Số khuẩn lạc KHÔNG Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: Vi nấm là gì? Phương pháp xác định tổng vi nấm? Phân biệt khuẩn lạc vi khuẩn và vi nấm? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP MPN CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT Đếm trên lam phết kính Tiêu bản vi sinh vật đã được nhuộm màu (nhuộm đơn). Hình 5.1: Diện tích hình vuông phết kính Sơ đồ: Di chuyển vật kính trong hình vuông phết kính, để đếm số VSV/1VT a. Phết kính: - Dùng lam sạch và bút chì mỡ (bút lông kim), kẻ một hình vuông S = 400 mm2, ở mặt trên lam. Mục đích không cho vi sinh vật lan ra khỏi diện tích đếm. - Hút 0.02-0.2 ml dung dịch pha loãng , nhỏ vào giữa hình vuông, ở mặt trên lam. - Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy ở đầu que dàn đều giọt mẫu ra xung quanh, vừa chạm vào cạnh hình vuông. - Cố định tiêu bản, nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm blue methylen. - Nhỏ một giọt dầu soi, xem ở vật kính x100. b. Cách đếm - Đếm số tế bào VSV/ 1VT (VT: vi trường). - Đếm hết tất cả từ 30 – 50 VT/ hình vuông phết kính. Theo sơ đồ hình vẽ. c. Công thức tính Trong đó: X = Số VK đếm được trong một vi trường 400 = diện tích hình vuông phết kính, bằng 400mm2 0.0004 = diện tích của vi trường, πR2 = 0.0004 mm2 àSố vi trường có được trong S: 4cm2 V = thể tích giọt VK phết kính H = hệ số pha loãng mẫu Đếm trong buồng đếm: a. Cấu tạo buồng đếm. - Buồng đếm là một phiến kính trong, dày, hình chữ nhật. - Giữa là phần lõm phẳng, có kẻ một hoặc hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ. Bên ngoài có ghi tên loại buồng đếm, và ghi các thông số kỹ thuật như hình trên. Hình 5.2: Cấu tạo buồng đếm b. Cấu tạo khung đếm. Hình 5.3 Cấu tạo khung đếm Cấu tạo một khung đếm có: - Trường hợp1: 1 khung có 16 ô lớn, 1 ô lớn có 25 ô nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ. - Trường hợp 2: 1 khung có 25 ô lớn, 1 ô lớn có 16 ô nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ. - Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400 mm2. Vậy Vô nhỏ = 0.1 mm x 1/400 mm2 = 1/4000mm3. c/ Cách tiến hành. - Đặt lammen sạch phủ lên khung đếm. - Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch nấm men đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu, bơm nhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm và lammen. - Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lammen, hơi thừa một ít. Nếu bị bọt kẹt lại trong lammen thì phải làm lại. - Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm. - Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó dùng vật kính x40 để đếm. - Đếm số tế bào trong 5 ô lớn (4 ô ở cạnh, 1 ô ở giữa), đếm lần lượt từng ô nhỏ trong 1 ô lớn. Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm số tế bào nằm ở cạnh phía trên và cạnh bên phải ô. - Đếm tất cả 80 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (T/h: 1 ô lớn có 16 ô nhỏ). - Hoặc đếm 125 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (T/h: 1 ô lớn có 25 ô nhỏ). d. Công thức tính. Trong đó: a = số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ (V = 1/ 4.000 mm3) 4.000 = số qui đổi từ 1/4.000 mm3 thành 1 mm3. 1.000 = số qui đổi từ 1 mm3 thành 1ml (1ml = 1.000 mm3) H = hệ số pha loãng (ví dụ: H = 10-2) e. Chú ý: - Phương pháp này chỉ sử dụng để quan sát những vi sinh vật có kích thước lớn như bào tử của nấm men và nấm mốc. - Chỉ đếm được tổng số tế bào, không thể biết tế bào nào còn sống hay đã chết. - Nên nhuộm màu (methylene blue) để dễ quan sát và đếm chính xác. - Nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10 tế bào. - Sử dụng xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô. - Để đạt độ chính xác cao, thì số tế bào trung bình đếm được trong 1 ô nhỏ: 2.5 < a <10. Phương pháp trải đĩa Tương tự thao tác trải đĩa, số lượng tế bào vi sinh vật được xác định qua khuẩn lạc. Khuẩn lạc là các cá thể hay tế bào vi sinh vật được nuôi cấy trong các điều kiện môi trường thích hợp, sau đó phân chia tạo thành nhiều cá thể hay quần thể vi sinh vật mà mắt thường nhìn thấy được. Phương pháp MPN (Most Probable Number) Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất; số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục ), ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng. Cụ thể là xác định số lượng Coliforms trong thực phẩm, nước uống, nước sinh hoạt hoặc nước thải. Thao tác: Bước 1: Lấy mẫu và pha loãng mẫu đến 3 nồng độ liên tiếp thích hợp. Bước 2: Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 3 ống nghiệm môi trường Lauryl Sulphate broth (LSB). Hút 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ 3 ống nghiệm. Bước 3: Ủ ấm từ 35 – 370C, thời gian 24 - 48 giờ. Bước 4: Ống dương tính là có bọt khí trong ống durham. Bước 5: Tra bảng Mac Crady – loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ liên tiếp. Bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10 ml, 1ml và 0,1ml tương đương MPN/ml của mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2 và 10-3 dùng phân tích. Kết quả tra bảng MPN/ml = kết quả tra bảng x f/10 ( f độ pha loãng thấp nhất 10n) Lưu ý: Các ống nghiệm có khả năng hiện diện của coliform là dương tính cả hai môi trường LSB và BGBL. THỰC HÀNH Dụng cụ Tên Số lượng Đơn vị Đèn cồn 6 Cái Ống nghiệm 100 Cái Đĩa petri 20 Cái Pipet 1ml 6 Cái Pipet 10ml 6 Cái Becher 100ml 12 Cái Hóa chất và môi trường Môi trường LSB và BGBL Cân chính xác khối lượng môi trường tổng hợp hay thành phần của từng môi trường. đun nóng cho môi trường đồng nhất rồi phân phối vào các ống thí nghiệm có ống durham. Lưu ý: lượng môi trường trong ống nghiệm phải cao hơn ống durham. Cần loại bỏ các ống durham có bọt khí sau khi hấp khử trùng. Hấp khử trùng môi trường ở 1210C, 1atm, 15 phút. Chuẩn bị: Cồn 960 2 lít Nước cất 5 lít Thực hành Mẫu nước: nước thải và nước sinh hoạt Mẫu đất Định lượng trực tiếp số lượng tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu. Định lượng E.coli và Coliforms bằng phương pháp MPN. àĐọc kết quả àViết báo cáo CHUẨN BỊ Violet Red Bile Agar (VRBA) HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 5 1. Số liệu báo cáo 1.1. Kết quả quan sát trên buồng đếm hồng cầu: Nồng độ pha loãng 1 .. 2 . 3 .. Số tế bào 1.2. Kết quả đếm bằng phương pháp MPN Nồng độ pha loãng 1 .. 2 3 . ĐẠT Tra bảng . KHÔNG Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: Nhược điểm của phương pháp điếm tế bào vi sinh vật bằng buồng đếm hồng cầu là gì? Thao tác sử dụng kính hiển vi quan sát và đếm tế bào vi sinh vật? Tại sao phải sử dụng môi trường BGBL sau khi xác định bằng môi trường LSB? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi BÀI 6: XÁC ĐỊNH E.COLI VÀ COLIFORM TỔNG QUAN Vi khuẩn Coli (Total coliform) tồn tại trong tự nhiên, trong phân người, phân gia súc, trong nước, trong nước thải hay trong các vật phẩm có nguồn gốc khác nhau. Theo đặc tính nuôi cấy, người ta chia chúng làm hai nhóm: Fecal Coli (Escherichia coli - E.coli) có nguồn gốc từ phân (người, động vật, cá..) Non fecal Coli (Bacterium coli) có nguồn gốc khác (đất, cây cỏ, nước thải) Vi khuẩn E.coli thuộc nhóm vi trùng đường ruột Enterobacteriaceae, chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng. Vi khuẩn E.coli nhiễm vào đất, nước từ phân của động vật. Sự có mặt của chúng chứng tỏ nước bị nhiễm phân hoặc nước thải sinh hoạt. Chúng sẽ gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chúng. - Hình dạng: Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không có độc lực không có capsul. Kích thước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu tròn. Một số dòng có lông bám (pili). - Đặc điểm nuôi cấy và sinh hóa: Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp 370C nhưng có thể mọc trên 400C, pH 7,4. - Trên môi trường VRBA tạo khuẩn lạc màu tím. - E.coli gây bệnh truyền nhiễm tiêu chảy hay nhiễm trùng huyết trẻ sơ sinh Ngoài ra, nước thải nhiễm E.coli còn có thể nhiễm các vi sinh vật khác có trong đường ruột như vi khuẩn tả (Vibrio choleras), vi khuẩn lỵ (Shigella), DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG Dụng cụ Tên Số lượng Đơn vị Đèn cồn 6 Cái Đĩa petri 60 Cái Pipet 1ml 6 Cái Pipet 10ml 6 Cái Becher 100ml 12 Cái Hóa chất và môi trường Môi trường VRB Cân môi trường tổng hợp hay thành phần sau đó thêm nước nước cất thích hợp rồi đun nóng cho hòa tan các chất với nhau. Đổ môi trường thạch đĩa mà không cần phải hấp khử trùng. Chuẩn bị: Cồn 700 1 lít Cồn 960 2 lít Nước cất 5 lít Nước muối sinh lý 1 lít THỰC HÀNH Mẫu nước và mẫu đất: - Pha loãng mẫu theo dãy nồng độ thập phân - Chọn nồng độ thích hợp, lấy một lượng mẫu vừa phải cho vào đĩa petri có chứa môi trường VRB. - Trải đĩa và đem ủ ở nhiệt độ thích hợp, sau 24 giờ đọc kết quả. àĐọc kết quả: Sau 24 giờ các khuẩn lạc đặc trưng là E.coli và Coliform có màu đỏ tía, đường kính 0.5mm hoặc hơn, đôi khi được bao quanh bởi một vùng hơi đỏ của mật kết tủa. àViết báo cáo CHUẨN BỊ Môi trường NA HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 6 1. Số liệu báo cáo 1 .. 2 3 . ĐẠT Số khuẩn lạc KHÔNG Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: Coliform là gì? E.coli là gì? Tại sao phải nhận biết Coliform và E.coli? Môi trường và điều kiện nuôi cấy Coliform? Các phương pháp xác định E.coli đã học, ưu điểm và nhược điểm của mỗi phương pháp? So sánh mẫu phân tích theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN)? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi BÀI 7: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN VI SINH VẬT KHÁI NIỆM Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đươc tạo ra từ 1 tế bào ban đầu. Nguyên tắc: - Tách rời các tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau. - Sau khi phân lập vài lần, từ khóm thuần cấy truyền sang ống môi trường thạch nghiêng hay ống nghiệm canh để gia tăng số lượng vi sinh vật. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT Môi trường thạch đĩa Kỹ thuật hộp ria - Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống. - Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T và ria bốn góc). Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo. - Bao gói đĩa petri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm. Hình 7.1: Kỹ thuật hộp ria Kỹ thuật hộp trải - Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri. - Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 960, hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa. Hình 7.2: Cách dàn vi sinh vật trên bề mặt môi trường bằng que gạt Drigalxki. - Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường. - Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm. Kỹ thuật hộp đổ - Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri. - Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đã đun chảy và để nguội đến 45 - 550C vào đĩa petri đã cấy mẫu. - Xoay nhẹ đia petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống được trộn đều trong môi trường cấy. - Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên. Phương pháp cấy truyền Cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác - Tay trái cầm 2 ống nghiệm: 1 ống giống và 1 ống môi trường - Tay phải cầm que cấy và khử trùng bằng đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy - Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống giống ra - Khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm - Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống. - Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa ống vào môi trường để thực hiện các thao tác cấy truyền. - Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông - Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong Chú ý: Nếu ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipet hút canh trường thay que cấy. Phương pháp cấy trên thạch nghiêng Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí. + Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm. + Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu: Hình chữ chi; Hình vòng xoắn; Hình vạch ngang song song Hình 7.3: Các kiểu cấy chuyền trong ống nghiệm Phương pháp cấy trên thạch đứng Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kị khí. - Sử dụng que cấy hình kim - Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ, đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát thành ống tuỳ yêu cầu. - Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường Hình 7.4: Kỹ thuật cấy trên thạch đứng CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN VI SINH VẬT Các phương pháp nuôi cấy Kết quả của việc nuôi cấy: Sau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật: - Trong môi trường lỏng: Vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường. - Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng: Nấm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên vệt nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục. Nấm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy. - Trong môi trường thạch đứng: Các vi khuẩn kị khí phát triển ở đáy của cột môi trường. Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Phương pháp cấy truyền định kỳ lên môi trường mới: Phương pháp này áp dụng để bảo quản tất cả các loại vi sinh vật. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng: Đối với vi sinh vật kị khí. Đối với vi sinh vật hiếu khí: + Cung cấp thường xuyên và đầy đủ O2. + Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải + Các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxi cho vi sinh vật. + Nếu nuôi cấy trong môi trường có khối lượng lớn phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ. Đối với vi sinh vật kị khí, để hạn chế sự tiếp xúc với oxi bằng cách: + Đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vaselin. + Cấy trích sâu vào môi trường đặc. + Nuôi cấy trong bình hút chân không. + Nuôi trong ống nghiệm đặc biệt sau khi rút hết không khí và hàn kín lại. Đun sôi môi trường một thời gian để loại hết O2, để nguội 450C. Dùng ống hút cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm. Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với O2. Phương pháp giữ giống trên đất, cát: Dùng để bảo quản các chủng tạo bào tử tiềm sinh (hoặc bào tử vô tính) với thời gian bảo quản từ một đến nhiều năm. Trên hạt: Dùng để bảo quản các chủng có dạng hình sợi sinh bào tử hoặc không. Thời gian bảo quản có thể tới 1 năm. Phương pháp đông khô: làm cho tế bào mất nước ở trạng thái tự do. Đồng thời làm giảm, thậm chí làm ngừng hẳn quá trình phân chia của vi sinh vật. Thời gian bảo quản lên tới vài chục năm. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG Dụng cụ Tên Số lượng Đơn vị Đèn cồn 6 Cái Đĩa petri 60 Cái Ống nghiệm 60 Cái Pipet 1ml 6 Cái Pipet 10ml 6 Cái Becher 100ml 12 Cái Hóa chất và môi trường Môi trường NA 2lít Cồn 960 2 lít Nước cất 5 lít THỰC HÀNH Mẫu vi khuẩn đã nuôi cấy từ các bài trước được đem đi phân lập. àĐọc kết quả: àViết báo cáo CHUẨN BỊ Thuốc nhuộm Gram Cồn 960 và 700 HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 7 1. Số liệu báo cáo 1 .. 2 3 . ĐẠT Số khuẩn lạc KHÔNG Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: Tại sao phải ria theo hình zic zắc? Mục đích của việc phân lập và bảo quản giống vi sinh vật? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi BÀI 8: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT BẰNG KÍNH HIỂN VI GIỚI THIỆU CÁC LOẠI KÍNH HIỂN VI. Kính hiển vi nền đen. Nguyên tắc: Ánh sáng thường chiếu từ dưới lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu hắt vào xung quanh tiêu bản, những tia sáng này bị tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật kính. Tiêu bản được soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia sáng mạnh chiếu vào, giúp thấy rõ từng hạt bụi trong không khí bị tia sáng chiếu vào. Chức năng: quan sát hình thái và đặc tính của một số vi khuẩn mà kính hiển vi thường khó quan sát. Kính hiển vi đổi pha. Nguyên tắc: ánh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt của tụ quang kính, vật kính và thị kính. Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như tiên mao, các lớp màng. Kính hiển vi huỳnh quang. Nguyên tắc: chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnh quang. Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau. Chức năng: quan sát và phân biệt cấu trúc tế bào vi sinh vật. Kính hiển vi điện tử. Nguyên tắc: chùm tia điện tử bước sóng rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ phân giải cao, giúp phân biệt 2 điểm rất gần nhau. Chức năng: dùng quan sát virus, cấu trúc phân tử của tế bào. Kính hiển vi quang học Nguyên tắc Dùng ánh sáng có bước sóng từ 500nm – 560 nm trong chùm ánh sáng thường để tạo năng suất phân ly lớn giúp phân biệt 2 điểm cách nhau khoảng 0.2 µm trở lên. Hệ thống phóng to của kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận: Vật kính (quay về phía vật quan sát) và thị kính (quay về phía mắt nhìn). Mỗi bộ phận này là một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp, mẫu vật cần quan sát AB được đặt trước vật kính một khoảng cách lớn hơn tiêu cự của vật kính một chút. Ảnh thật đảo ngược A’B’ của vật sẽ thu được ở bên kia vật kính, nằm trong khoảng tiêu cự của thị kính. Thị kính hoạt động như một kính lúp. Qua thị kính, người ta sẽ thấy ảnh ảo A’’B’’ được phóng to lên của ảnh thật A’B’. Hình 9.1: Nguyên tắc quang học của kính hiển vi. Chức năng Quan sát tế bào vi sinh vật, ký sinh trùng, tế bào động vật, thực vật. Cấu tạo Hình 9.2: Các bộ phận KHV quang học – dùng gương. Hình 9.3: Các bộ phận KHV quang học- dùng đèn. Cách sử dụng. Trước khi sử dụng phải kiểm tra tất cả các bộ phận của kính, dùng khăn mềm để lau các bộ phận của kính (Chú ý: chỉ lau bên ngoài, không tháo rời các bộ phận của kính), để kính ngay ngắn vừa với tầm ngồi, sau đó tiến hành tuần tự các bước tiếp theo để soi tiêu bản. Bước 1: Lấy ánh sáng. Bước 2: Đặt tiêu bản vào mâm kính. Bước 3: Quan sát. Hình 9.4: Hình vẽ và hình chụp kính hiển vi các vi nấm. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Bacillus spp. Lactobacillus subtilis. E.coli : KHV X100 KHV ĐIỆN TỬ Hình 9.5: Hình chụp kính hiển vi các vi khuẩn. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN TẠM THỜI Cách làm tiêu bản giọt ép - Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi. - Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí. Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống. - Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi. Cách làm tiêu bản giọt treo Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích - Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa. - Bôi vaseline quanh phần lõm của phiến kính. - Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính. - Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính. Cách làm tiêu bản nhuộm màu a. Nguyên tắc Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu. b. Cách nhuộm + Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên phiến kính. + Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm. + Đậy lá kính lên giọt dịch. + Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) rồi (x 40) PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH Nhuộm tế bào vi khuẩn dùng để phân biệt hình dáng tế bào vi khuẩn (cầu, trực, xoắn) hay để phân biệt các thành phần riêng biệt trên một tế bào vi khuẩn. Có 2 phương pháp nhuộm cơ bản: - Nhuộm đơn: Dùng một loại thuốc nhuộm để quan sát hình dạng tế bào. - Nhuộm kép: Dùng 2 thuốc nhuộm để phân biệt vi khuẩn G+ và G-, phân biệt tế bào dinh dưỡng và bào tử, hay phân biệt vi khuẩn lao với các vi khuẩn khác... Nguyên tắc chung làm tiêu bản nhuộm - Phết kính tiêu bản Lau nhẹ tiêu bản sạch bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn. Dùng bút chì mỡ hoặc bút lông ghi tên mẫu, và vẽ vòng tròn ϕ khoảng 15mm, ở mặt dưới lame kính để đánh dấu vết khuẩn phía trên lame. Đốt nóng đỏ que cấy (trước và sau khi thao tác), mở nút bông, hơ nhanh miệng ống nghiệm. Trường hợp 1: mẫu nuôi cấy trong canh dinh dưỡng, đưa đầu que cấy vào miệng ống nghiệm (vẫn giữ gần ngọn lửa), nhúng vào dung dịch canh cấy, lấy 1 vòng que cấy. Lấy que cấy ra, hơ nhanh miệng ống nghiệm và nút bông, đậy nút bông lại. Phết canh khuẩn trên vòng que cấy vào mặt trên lam, giữa vòng tròn, dàn đều ra xung quanh. Trường hợp 2: mẫu nuôi cấy trong thạch dinh dưỡng, nhỏ giọt dung dịch NaCl 9‰ lên giữa vòng tròn (mặt trên lam). Thao tác giống trường hợp 1, nhưng dùng cạnh vòng tròn của đầu que cấy đặt nhẹ lên khuẩn lạc vi khuẩn, rồi đặt vào giọt NaCl 9‰ trên lam, dàn mỏng và đều. - Cố định mẫu Mục đích giết chết vi khuẩn và làm cho vi khuẩn bám chặt vào lame. Cố định mẫu bằng cách để khô tự nhiên. Chú ý: Nếu cố định không tốt vi khuẩn sẽ trôi đi trong quá trình nhuộm. Khi cố định mẫu, chỉ hơ nhanh chứ không đốt trên ngọn lửa. Không được chạm vào thành khi đưa đầu que cấy vào và ra khỏi ống nghiệm vi khuẩn. Hình 9.6: Sơ đồ thứ tự phết kính. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM. Phương pháp nhuộm gram (Christian Gram): Nguyên tắc: Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram [+] sẽ giữ được phức hợp tím Gentian-iode không bị tẩy màu bởi alcool, trong khi vi khuẩn Gram [-] không giữ được phức hợp màu này, do vậy kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram [+] vẫn giữ được màu tím của gentian, còn vi khuẩn Gram [-] ăn màu hồng của phẩm màu safranin hay fushin. b. Thao tác: - Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa. - Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính. - Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc. Để từ 1 – 2 phút (nếu vi khuẩn lấy từ canh lỏng để 2 phút, lấy từ thạch dinh dưỡng để 1 phút). Rửa nước, thấm khô. - Tẩy cồn 960 từ 15 – 30 giây (từ canh lỏng tẩy 15 giây, từ thạch dinh dưỡng tẩy 30 giây). Rửa nước, thấm khô. Tẩy cồn bằng cách để nghiêng tiêu bản, cho cồn chảy từ từ ở mép trên phiến kính. Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt cồn vừa mất màu tím. - Cố định màu tím bằng iodine là dung dịch lugol. - Đặt miếng giấy lọc lên vết khuẩn, nhỏ dung dịch Fuschin kiềm loãng (hoặc Safranin O), để 1 phút. Rửa nước, thấm khô. - Quan sát bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1.000 lần. Vi khuẩn Gr+ bắt màu tím Crystal violet Vi khuẩn Gr- bắt màu hồng Fuschin (Safranin O) Hình 9.7: Sơ đồ thứ tự nhuộm Gram c. Đọc kết quả: - Quan sát phết nhuộm Gram qua kính hiển vi, dưới vật kính dầu, chúng ta sẽ thấy vi khuẩn Gram [+] ăn màu tím, còn vi khuẩn Gram [-] ăn màu hồng. - Khi trả lời một kết quả nhuộm Gram, phải trả lời các chi tiết sau: + Hình dáng vi khuẩn. + Cách sắp xếp các vi khuẩn. + Cách ăn màu của vi khuẩn, tức là vi khuẩn Gram [+] hay Gram [-]. Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen: Dùng phân biệt vi khuẩn Lao với các vi khuẩn khác Do tế bào vi khuẩn kháng acid có lớp vỏ sáp bao bọc nên khi đã nhuộm được phức hợp màu carbolfuchsin, phức hợp này sẽ không bị tẩy màu bởi dung dịch tẩy màu mạnh (acid, alcool acid). Tuy nhiên để phức hợp màu này có thể thấm xuyên qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn, có hai cách: - Đun nóng phết nhuộm với dung dịch màu carbolfuchin, nhờ đó carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn để nhuộm màu vi khuẩn; đây là phương pháp nhuộm nóng Ziehl Neelsen. - Phương pháp thứ hai là phương pháp nhuộm lạnh còn gọi là phương pháp Kinyoun, trong phương pháp này người ta dùng dung dịch carbolfuchsin đậm đặc, nhờ vậy khi phủ dung dịch màu đậm đặc này lên phết nhuộm với thời gian lâu, carbolfuchsin vẫn có thể thấm qua lớp vỏ sáp để nhuộm màu vi khuẩn. Nhuộm bào tử Một số vi khuẩn như Bacillus hay Clostridium có khả năng tạo thành bào tử. Bào tử có thể tồn tại trong môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chịu được nhiệt và một số các hóa chất mà thể sinh dưỡng không thể. THỰC HÀNH Quan sát hình thái vi sinh vật được phân lập và nuôi cấy từ các bài trước. àVẽ lại hình đã quan sát àViết báo cáo HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 8 1. Số liệu báo cáo 1.1. Kết quả quan sát hình thái vi nấm trên kính hiển vi: Mẫu vi sinh vật 1 .. 2 . 3 .. Hình dạng 1.2. Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn Mẫu 1 .. 2 3 . Hình dạng Bắt màu ( ) Nhận xét kết quả: 2. Câu hỏi ôn bài: Trình bày thao tác sử dụng kính hiển vi quang học? nêu sự khác biệt khi thao tác quan sát vi nấm và vi khuẩn, tại sao? Tại sao phải nhuộm Gram khi quan sát vi khuẩn? Phân loại vi khuẩn bắt màu nhuộm Gram? Trình bày thao tác nhuộm Gram? 3. Yêu cầu bài học - Nắm vững nội dung bài học - Lập báo cáo kết quả và nhận xét - Trả lời câu hỏi PHỤ LỤC A. HÓA CHẤT. 1. Cồn – Ether Tỷ lệ về thể tích 3:1. Đong 750 ml cồn 960 + 250 ml ether, ta được dung dịch cồn – ether tỷ lệ 3:1. Dung dịch này dùng để tẩy sạch vật kính dầu, hoặc các dụng cụ dính dầu soi. 2. Cồn – acid (dùng để nhuộm Ziehl Neelsen ) Cách pha: Đong 97 ml cồn 960 + 3 ml acid HCl hoặc H2SO4 đậm đặc. 3. Dung dịch sunfo – cromic: K2Cr2O7 + H2SO4 Công thức: K2Cr2O7 60g H2SO4 đậm đặc 66ml Nước 1000ml Cách pha: Cân 60g K2Cr2O7, hào vào 500ml nước. Thêm từ từ 66ml H2SO4 đậm đặc, cuối cùng lại thêm 500ml nước nữa. Bicromate kali sẽ tác dụng với acid sulfuric và làm sinh ra acid cromic. Chất này có tác dụng oxi hóa mạnh do đó có thể tẩy sạch các vết bẩn trên dụng cụ thủy tinh. Thời gian ngâm dụng cụ thủy tinh từ 1 – 2 ngày, xả thật kỹ bằng nước sạch, rửa bằng savon bột, rồi rửa lại bằng nước sạch. Dung dịch này có thể dùng nhiều lần cho đến khi dung dịch từ màu đỏ cam biến thành màu lục đen thì bỏ đi. Lưu ý: Dung dịch này rất độc. Do đó khi ngâm phải đậy kín, lúc rửa nên đeo khẩu trang, mang găng cao su và kính bảo hiểm. 4. Cồn 700: Dùng để sát khuẩn tay, bàn , ghế, tủ cấy, Cách pha: cồn 700 từ cồn 960. Vì không đòi hỏi chính xác, nên có thể áp dụng công thức: V1C1 = V2C2 5. Nước muối sinh lý 9‰ vô khuẩn: Cân chính xác 9g NaCl tinh khiết cho vào cốc có chứa 991ml nước cất (vừa đủ 1000ml ), dùng đũa thủy tinh khuấy đều. Đem hấp vô khuẩn ở t0 = 1210C, 1atm, 15 – 20 phút. B. THUỐC NHUỘM. 1. Crystal violet (C25H30N3Cl . 9H2O = 570,11 ): Công thức: a) Crystal violet 0,4g Cồn 960 10ml b) Phenol 1g Nước cất 100ml Cách pha: Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc. Chú ý: dung dịch thuốc nhuộm này luôn bảo quản trong chai màu, tránh ánh sáng. 2. Lugol: Công thức: KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300ml Cách pha: Hòa 2g KI vào 5ml nước cất, sau đó thêm 1g iod. Chờ cho iod tan hết mới thêm nước vừa đủ 300ml. 3. Fuchsine kiềm ( C19H18N3Cl = 323,82 ): Công thức: a) Fuchsine kiềm 0,3g Cồn 960 10ml b) Phenol 5g Nước cất 35ml Cách pha: Trộn dung dịch a và b với nhau, khuấy cho tan đều à đem lọc. Bảo quản trong chai màu. Trước khi dùng pha loãng 5 lần (dịch pha loãng không giữ được lâu còn dịch đặc có thể giữ được trong nhiều tháng ). 4. Safranin O ( C20H19N4Cl = 350,80 ): Công thức: Safranin O ( dung dịch 2,5% trong cồn 960 ) 25ml Nước cất 75ml Bảo quản trong chai màu. 5. Methylene blue ( C37H27N2S2 = 799,80 ): Công thức: a) Methylen blue 3g Cồn 96% 30ml b) Dung dịch KOH 0.01% 1000ml Cách pha: Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau à khuấy hoà tan đều à đem lọc. Bảo quản trong chai màu. MÔI TRƯỜNG I. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM MỐC VÀ NẤM MEN. Môi trường Sabouraud: (để nuôi cấy nấm mốc và nấm men) Công thức: Pepton 20g Mantose hay glucose 40g Agar 18g Nước cất vừa đủ 1000ml ( pH: 5,5 – 6,0 khử khuẩn trong nồi áp suất ở t0 = 1210C (1atm)/ 15- 20 phút). Môi trường PGA Thành phần môi trường PGA: Khoai tây 300g Glucose 20g Agar 15g Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ và lọc lấy dịch lọc, sau đó bổ sung đường và agar vào hấp khử trùng. Sử dụng acid lactic chỉnh pH đến 5,5 để ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Khử trùng ở 1210C trong 15 phút Môi trường PGA sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-460C và đổ đĩa để nguội. II. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐỐI VỚI VI KHUẨN. 1. Môi trường Nutrient Broth (NB): Công thức: Cao thịt 5g Pepton bột 10g NaCl 5g Nước cất 1000ml ( pH: 7,4 – 7,6 ). Cân 13g bột môi trường NB hòa vào 1000ml nước cất, khuấy đều. Đem hấp khử trùng ở 1210C (1am)/ 15 – 20 phút. 2. Môi trường Nutrient Agar (NA): Thành phần môi trường như môi trường NB nhưng có bổ sung 18g agar trong 1000ml môi trường. Cân 13g bột môi trường NB + 18g agar hòa vào 1000ml nước cất, rồi khuấy đều. Khử khuẩn trong nồi áp suất ở t0 = 1210C (1atm)/ 15 – 20 phút. 3. Môi trường thạch bán lỏng di động: Công thức: Nutrient broth 13g Agar 5g Nước cất 1000ml pH: 7,2 Pha chế: Đem các thành phần của môi trường trên hòa tan trong nước cất, rồi đun cách thủy cho agar hòa tan đều. Phân vào trong các ống nghiệm 16 x 120 mm, mỗi ống khoảng 5ml. Đem hấp khử khuẩn ở 1210C (1atm)/ 15 – 20 phút. Lấy ra để đứng cho môi trường đông lại. 4. Môi trường Plate Count Agar (PCA): Thành phần: Trypton 5g Yeast extract 2.5g Glucose 1g Agar 15g Nước cất 1000ml Pha chế: Đem các thành phần của môi trường trên hòa tan trong nước cất, rồi đun cách thủy cho agar hòa tan đều. Đem hấp khử khuẩn ở 1210C (1atm)/ 15 – 20 phút. Phân phối vào các đĩa petri, mỗi đĩa dầy khoảng 10 - 20mm, Để nguội cho môi trường đông lại. 5. Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) Peptone 10g Lactose 10g Mật bò 20g Brilliant green 0,0133g Nước cất 1000 ml Hòa tan peptone va lactose vào trong 500ml nước cất, cho mật bò vào trong khoảng 200ml và brilliant green vào trong khoảng 100ml nước cất. Trộn đều 3 dung dịch và thêm nước đủ 1000 ml, chỉnh pH khoảng 7,4. Rót vào ống nghiệm có ống Durham 10ml môi trường BGBL. Hấp 1210C, 1atm trong 15 phút. 6. Môi trường Lauryl Sulphate Broth (LSB) Tryptose 20g Lactose 5g Sodium chloride 5g KH2PO4 2,75g K2HPO4 2,75g Lauryl sulphate 0,1g Nước cất 1000ml Hòa tan các chất vào 1000 ml, chỉnh pH khoảng 7,4. Rót vào ống nghiệm có ống Durham 10ml môi trường LSB. Hấp 1210C, 1atm trong 15 phút. 7. Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB hoặc VRBA) Cao nấm men 3g Peptone hoặc gelysate 7g NaCl 5g Muối mật 1,5g Lactose 10g Neutral red 0,03g Crystal violet 0,002g Agar 15g Nước cất 1000ml Hòa tan các thành phần trong nước, điều chỉnh pH 7,4. Đun sôi trong 2 phút, không hấp khử trùng. Sử dụng vào môi trường đổ đĩa 8. Môi trường Potato Glucose Agar (PCA): Thành phần môi trường: Khoai tây 300g Glucose 20g Agar 15g Pha chế môi trường: Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ và lọc lấy dịch lọc, sau đó bổ sung đường và agar vào hấp khử trùng. Sử dụng acid lactic chỉnh pH đến 5,5 để ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Khử trùng ở 1210C trong 15 phút. TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Linh Thước (2005), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục. Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh, Giáo trình THỰC TẬP VI SINH CƠ SỞ, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, Khoa Công nghệ sinh học. Nguyễn Thị Sơn, Trần Lệ Minh, Tài liệu hướng dẫn thí nghiệm VI – HÓA SINH ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG, NXB Bách Khoa Hà Nội. Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón, cây trồng. BẢNG TRA MPN BẢNG TRA MPN DÙNG CHO LOẠT 3 ỐNG NGHIỆM Ở 3 NỒNG ĐỘ PHA LOÃNG LIÊN TIẾP Số lượng ống dương tính Số MPN/100ml Số lượng ống dương tính Số MPN/100ml Số ml mẫu sử dụng Số ml mẫu sử dụng 10 1 0,1 10 1 0,1 0 0 0 - 2 0 0 9 0 0 1 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15 0 1 1 6 2 1 1 20 0 1 2 9 2 1 2 27 0 1 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6 2 2 0 21 0 2 1 9 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 4 3 0 0 23 1 0 1 7 3 0 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 7 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 1 3 3 29 3 3 3 - BẢNG TRA MPN DÙNG CHO LOẠT 5 ỐNG NGHIỆM Ở 3 NỒNG ĐỘ PHA LOÃNG LIÊN TIẾP Số lượng ống dương tính Số MPN/100ml Số lượng ống dương tính Số MPN/100ml Số ml mẫu sử dụng Số ml mẫu sử dụng 10 1 0,1 10 1 0,1 0 0 0 0 4 0 2 20 0 0 1 2 4 0 3 25 0 0 2 4 4 1 0 17 0 1 3 2 4 1 1 20 0 1 0 4 4 1 2 25 0 1 1 6 4 2 0 20 0 2 2 4 4 2 1 25 0 2 3 6 4 2 2 30 0 3 0 6 4 3 0 25 1 0 1 2 4 3 1 35 1 0 2 4 4 3 2 40 1 0 3 6 4 4 0 35 1 0 0 8 4 4 1 40 1 1 1 4 4 4 2 45 1 1 2 6 4 5 0 40 1 1 3 8 4 5 1 50 1 2 0 6 4 5 2 55 1 2 1 8 5 0 0 25 1 2 2 10 5 0 1 30 1 3 0 8 5 0 2 45 1 3 1 10 5 0 3 60 1 4 0 11 5 0 4 75 2 0 0 5 5 1 0 35 2 0 1 7 5 1 1 45 2 0 2 9 5 1 2 65 2 0 3 12 5 1 3 85 2 1 0 7 5 1 4 115 2 1 1 9 5 2 0 50 2 1 2 12 5 2 1 70 2 2 0 9 5 2 2 95 2 2 1 12 3 2 3 120 2 2 2 14 5 2 4 150 2 3 0 12 5 2 5 175 2 3 1 14 5 3 0 80 2 4 0 15 5 3 1 110 3 0 0 8 5 3 2 140 3 0 1 11 5 3 3 175 3 0 2 13 5 3 4 200 3 1 0 11 5 3 5 250 3 1 1 14 5 4 0 130 3 1 2 17 5 4 1 170 3 1 3 20 5 4 2 225 3 2 0 14 5 4 3 275 3 2 1 17 5 4 4 350 3 2 2 20 5 4 5 425 3 3 0 17 5 5 0 250 3 3 1 20 5 5 1 350 3 4 0 20 5 5 2 550 3 4 1 25 5 5 3 900 3 5 0 25 5 5 4 1600 4 0 0 13 5 5 5 1800 4 0 1 17 - - - - HƯỚNG DẪN BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÁCH LẤY MẪU CÁC CHỈ TIÊU PHÂN TÍCH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KẾT QUẢ NHẬT KÝ LÀM VIỆC NGÀY MÔI TRƯỜNG SỐ LƯỢNG KẾT QUẢ GHI CHÚ GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN VƯU NGỌC DUNG