Đánh Giá Chất Lượng Thực Phẩm - Trần Xuân Hiển

ụ bình thường khi lượng NH3 < 45mg/100g thịt; tiêu thụ có điều kiện khi lượng NH3 khoảng 45 ÷ 50mg/100g thịt. • Mỡ: đủ tiêu chuẩn theo các chỉ tiêu thông thường của dầu mỡ ăn. • Kim loại nặng (mg/kg): o As = 1,0 o Pb = 2,0 o Cu = 30,0 o Sn = 200,0 2. Kiểm nghiệm quả đóng hộp ♦ Yêu cầu kiểm nghiệm Tương tự như đối với các sản phẩm đồ hộp thịt, cá ♦ Đánh giá kết quả • Qui cách: tỷ lệ phần quả/ nước đường: o Dứa cả khoanh: 57 ÷ 65%. o Dứa miếng: 60 ÷ 65%. • Độ khô nước đường (sau 15 ngày bảo quản) đo bằng khúc xạ kế: 18 ÷ 22%. • Độ chua (% acid citric): 0,2 ÷ 0,4%. 3. Kiểm nghiệm đồ hộp nước quả ♦ Yêu cầu kiểm nghiệm Tương tự như đối với đồ hộp quả nước đường. ♦ Đánh giá kết quả • Độ khô: 12 ÷ 15%. • Độ chua: tùy qui cách. * Nước dứa • Hàm lượng SO2 toàn phần tối đa 50mg/lít. • Không có thuốc sát trùng. * Nước chanh • Tỷ trọng ở 20oC (tối thiểu) 1,030. • Độ chua (% acid citric) 4,9 ÷ 8,2. • Hàm lượng chất không tan: 10 ÷ 15%. • Hàm lượng tinh dầu (tối đa) 5,9ml/lít. • Hàm lượng acid ascorbic (tối thiểu) 450mg/lít. • Hàm lượng SO2 toàn phần (tối đa) 50mg/lít. • Không có thuốc sát trùng. * Nước cam • Tỷ trọng ở 20oC (tối thiểu) 1,038 ÷ 1,054. • Độ chua (% acid citric) 7,0 ÷ 17,5. • Hàm lượng chất không tan (tối đa) 10%. • Hàm lượng tinh dầu (tối đa) 0,5ml/lít. • Hàm lượng acid ascorbic (tối thiểu) 44mg/lít. • Hàm lượng SO2 toàn phần (tối đa) 50mg/lít. • Không có thuốc sát trùng. Kiểm nghiệm nước giải khát 1. Kiểm nghiệm rượu (etylic) ♦Yêu cầu kiểm nghiệm • Độ cồn • Độ acid toàn phần • Hàm lượng ester • Hàm lượng furfurol • Hàm lượng acid cyanhydric • Hàm lượng aldehid • Hàm lượng rượu metylic ♦ Phương pháp xác định 1.1. Xác định độ cồn Độ cồn là số ml rượu etylic nguyên chất có trong 100 ml rượu thử (mẫu) ở nhiệt độ đúng +15oC. Nếu rượu có tạp chất cặn ít hơn 0,5g/l, ta có thể đo thẳng độ cồn bằng cồn kế. Nếu rượu có tạp chất cặn lớn hơn 0,5g/l, ta phải cất lấy dung dịch cồn và đo độ cồn trên dung dịch cất. Độ cồn được qui định đo ở nhiệt độ +15oC, nếu đo ở nhiệt độ khác phải kiểm tra bảng để qui về độ cồn ở +15oC. • Độ rượu = V (ml) /100 ml mẫu (ở 15oC) • Trong đó : V là thể tích mẫu thử 1.2. Xác định độ acid toàn phần Bao gồm các acid dễ bay hơi : acid formic, acid acetic, acid butyric,… Kết quả biểu thị bằng acid acetic (mg) trong 100 ml rượu qui về độ cồn 100o X = 3 x n x (100/A) Trong đó : • 3 : hệ số, là số mg acid acetic tương ứng với 1ml KOH 0.05N • n : là số ml dung dịch KOH 0,05N dùng để định lượng 100ml mẫu. • A : độ cồn của mẫu thử. • 100/A : là hệ số để chuyển rượu có độ cồn A thành rượu có độ cồn 100o. 1.3. Xác định hàm lượng ester (kết quả thường biểu thị bằng ester acertat etyl) Nguyên lý : xà phòng hóa các ester bằng lượng cồn thừa dung dịch NaOH, cho tiếp cùng thể tích acid cùng độ chuẩn vào mẫu thử, chuẩn độ acid thừa bằng dung dịch NaOH. Kết quả : X = 8,8 x n x (100/A) x (V/100) Trong đó : • Hệ số 8,8 : số mg acetat cetyl tương đương 1 ml NaOH 0,1N. • n : số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ acid thừa. • 100/A : hệ số qui đổi từ rượu có độ cồn A về rượu có độ cồn 100o • V/100 : tỷ lệ pha loãng. ♦ Đánh giá kết quả • Cồn tinh chế dùng để pha chế rượu có hàm lượng tạp chất (mg) trong 100 ml rượu qui về rượu 100o Bảng 9.1 : Chỉ tiêu hóa lý của rượu Chỉ tiêu Cồn tinh chế Cồn thường Cồn tinh chế kém Độ cồn Acid (acetic) Aldehid Ester Furfurol Tạp chất Rượu metylic % V 93 ÷ 96 1,0 ÷ 2,5 1,0 ÷ 3,0 4,0 ÷ 6,0 0 9,0 ÷ 21,5 0,06 ÷ 0,2 94 5 11,5 18,6 0 > 45 > 0,2 93 15 20 50 1,2 162 > 1 • Rượu mùi pha chế từ cồn có hàm lượng ester cao hơn, hệ số tạp chất khoảng 10 ÷ 50. • Rượu sản xuất không qua tinh chế như Coniac, Rhum,… hệ số tạp chất 300 ÷ 500. • Rượu địa phương qui ước có hệ số tạp chất 200 ÷ 300, kim loại đồng tối đa 3mg/100ml. 2.Kiểm nghiệm bia ♦ Yêu cầu kiểm nghiệm • Tỉ trọng • Độ khô ban đầu (của dung dịch trước khi lên men) • Độ khô sản phẩm • Độ cồn (độ rượu) • Hàm lượng CO2 • Độ tro • Hàm lượng các loại đường • Độ chua (do lên men xấu, tính theo acid lactic) ♦ Phương pháp xác định 2.1. Xác định độ chua Xác định độ chua trên 10ml bia đã loại CO2 theo phương pháp trung hòa với phenolftalein làm chỉ thị màu. 2.2.Xác định độ khô Xác định độ khô trên 10ml bia đã loại CO2, cô khô ở nồi cách thủy, rồi sấy khô ở nhiệt độ 100 ÷ 105oC cho đến trọng lượng không đổi. 2.3. Xác định hàm lượng tro Xác định hàm lượng tro theo phương pháp nung thành tro trắng và cân 2.4. Xác định tỉ trọng Xác định tỉ trọng bằng tỉ trọng kế thông thường 2.5. Xác định độ cồn (độ rượu) Tiến hành như phương pháp phân tích cồn trong rượu như cần lấy thể tích bia gấp đôi vì bia có độ cồn thấp. 2.6. Xác định hàm lượng CO2 Nguyên lý : Cho CO2 tự do trong nước giải khát kết hợp với natri carbonat theo phản ứng : Na2CO3 + CO2 + H2O ----> 2NaHCO3 Phần natri carbonat thừa sẽ được chuẩn độ bằng dung dịch acid chuẩn với phenolftalein làm chỉ thị màu. Hàm lượng CO2 tự do trong 100ml mẫu : X = 0,0044 x [ 50 - ( N1 + N2 )] x 1000/ 25, g/l Trong đó : • N1 : số ml dung dịch HCl 0,2N dùng để định lượng Na2CO3 thừa trong chuẩn độ mẫu thử • N2 : số ml Na2CO3 0,2N dùng để chuẩn độ các acid tự do trong mẫu trắng, nghĩa là N2 = ( 50 - n). 2.7. Xác định độ khô ban đầu (extrait primitif) Độ khô đầu tiên là độ khô của bia trước khi lên men. Độ khô này được tính toán như sau : Ep = E + 2A Trong đó : • E : độ khô của bia • A : lượng rượu etylic (g/l) ( hay A = độ cồn x 0,7943) ♦ Đánh giá kết quả • Tỉ trọng : 1,005 ÷ 1,020. • Độ cồn : 2 ÷ 3o, có khi đến 12o (bia đen). • Độ khô : 20 ÷ 80 g/l, trung bình khoảng 40 g/l. • Độ tro : 0,8 ÷ 6,0 g/l. • Độ chua : 3 ÷ 4. • Độ khô đầu tiên : 6 ÷ 18 g/100g • Hàm lượng CO2 khoảng 3 g/l • Không có phẩm màu nhân tạo. 3. Kiểm nghiệm nước giải khát nhân tạo ♦ Yêu cầu kiểm nghiệm và phương pháp kiểm nghiệm giống như kiểm nghiệm bia ♦ Đánh giá kết quả • Độ chua (biểu thị bằng acid citric) : 1g/lít. • Đường toàn phần (biểu thị bằng đường hoàn nguyên) : 80 ÷ 100g/lít. • Hàm lượng CO2 : 2g/lít. • Saccarin : không được có. • Acid vô cơ : không được có. • Kim loại nặng : không được có. • Phẩm màu, tinh dầu, chất bảo quản (qui định cho từng loại sản phẩm). Phần III: Đánh Gía Chất Lượng Thực Phẩm Bằng Phương Pháp Vi Sinh Vật Chương 10: Đặc Điểm Vi Sinh Vật Trong Thực Phẩm Khái quát Lương thực thực phẩm trong điều kiện nhiêt độ và độ ẩm thích hợp sẽ là môi trường rất tốt cho vi sinh vật hoạt động. Bản thân lương thực và thực phẩm đã là một loại môi trường hết sức lý tưởng cho vi sinh vật sinh sản và phát triển. Sự hư hỏng của thực phẩm do 2 nguyên nhân chủ yếu là hóa học và sinh học.Trong đó sự hư hỏng thực phẩm do nguyên nhân hóa học thường do enzym vốn có hiện diện tự nhiên trong thực phẩm, dưới dạng những điều kiện tất yếu làm thay đổi thực phẩm gây ảnh hưởng đến cấu trúc, màu sắc, mùi vị sản phẩm. Sự hư hỏng do yếu tố sinh học quan trọng thường là do vi sinh vật gây ra. Thông thường có một số vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm thô trước khi chúng được đem đi tồn trữ, chế biến và dưới những điều kiện tất yếu của phương pháp tồn trữ và chế biến thực phẩm sẽ tạo môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của chúng. * Một số tác hại do vi sinh vật gây ra: • Ngộ độc thực phẩm : là khi ăn những hóa chất độc đã có sẵn trong thức ăn và sau đó bị bệnh. • Nhiễm độc do thực phẩm: là khi ăn phải một lượng lớn vi sinh vật còn sống và sau đó bị bệnh * Ngộ độc thực phẩm có 2 lý do chính là do hoá chất và do vi sinh vật. • Ngộ độc hóa chất thường là tai nạn rủi ro khi vô tình ăn phải hoá chất như thủy ngân, chì, cyanide,… • Ngộ độc vi sinh vật xảy ra khi ăn phải các vi sinh vật có khả năng sinh ra độc tố. Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra đồng thời ở nhiều người, tạo ra những triệu chứng chung sau khi tiêu thụ sản phẩm. Tuy nhiên mức độ tác động sẽ khác nhau phụ thuộc khả năng đáp ứng với độc tố và thể trạng khác nhau của nhiều người. Các triệu chứng thường gặp của ngộ độc thực phẩm là tiêu chảy, chóng mặt, nôn mửa, đau nhức người, sốt và đau đầu. Triệu chứng này thay đổi ở các vụ ngộ độc khác nhau tùy thuộc vào tác nhân vi sinh vật và được gây ra bởi độc tố do vi sinh vật tạo ra và tiết vào thực phẩm (trường hợp này gọi là ngoại độc tố) hay bởi độc tố nằm trong tế bào vi sinh vật (nội độc tố). Đối với nước và thực phẩm, các vi sinh vật được cần quan tâm cần kiểm soát là các vi sinh vật gây ngộ độc và gây bệnh. Các vi sinh vật gây ngộ độc hay gây bệnh ở người khi bị đào thải ra khỏi cơ thể bằng đường phân sẽ làm ô nhiễm nguồn nước bị nhiễm phân này. Nước trở thành môi trường lan truyền mầm bệnh cho người khi nước được sử dụng mà không được tinh sạch đúng quy cách. Mặt khác trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm, vi sinh vật gây bệnh cũng có thể nhiễm vào thực phẩm thông qua tiếp xúc với bề mặt thiết bị, công nhân. Mặc dù để có thể gây ngộ độc, số lượng tế bào vi sinh hiện diện hoặc độc tố của chúng tiết ra trong thực phẩm khi được sử dụng phải đủ lớn. Tuy mật độ vi sinh vật ban đầu trong nước, trong nguyên liệu hoặc trong thực phẩm có thể rất thấp nhưng ở những điều kiện nhất định thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật trong quá trình chế biến hoặc bảo quản thực phẩm, mật độ vi sinh vật được nhân lên nhanh đến mức đủ để gây bệnh hay sản xuất đủ lượng độc tố gây hại. do vậy, mật độ cho phép của vi sinh vật gây bệnh trong nước, thực phẩm là rất thấp, trong đa số các trường hợp là bằng không. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật 1. Các yếu tố vật lý * Nước và độ hoạt động của nước (water activity – aw ) Độ hoạt động của nước là tỉ số giữa áp suất hơi nước trên bề mặt một chất hoặc một dung dịch so với áp suất hơi nước trên bề mặt nước sạch ở cùng nhiệt độ đó. aw = P / P0 Trong đó : • P : áp suất hơi nước của dịch (chất) • P0 : áp suất hơi nước tinh khiết Vi sinh vật có thể phát triển trong điều kiện nước có hoạt độ từ 0,63 ÷ 0,99. * Nhiệt độ Vi sinh vật có khả năng phát triển ở khoảng nhiệt độ rất rộng. Tuy nhiên trong bảo quản thực phẩm phải xác định được khoảng nhiệt độ giới hạn, ở đó vi sinh vật bị ức chế hoặc bị tiêu diệt . Dựa vào khả năng phát triển của vi sinh vật ở những khỏang nhiệt độ khác nhau,người ta phân loại ra làm ba nhóm : • Vi sinh vật ưa lạnh (Psychrophiles) • Vi sinh vật ưa ấm (Mesophiles) • Vi sinh vật ưa nóng (Thermophiles) * Áp suất Áp suất thẩm thấu trong môi trường ưu trương làm cho tế bào vi sinh vật mất khả năng hút nước và các chất dinh dưỡng hòa tan bao quanh, bị co nguyên sinh và có thể chết nếu hiện tượng kéo dài. * Các tia bức xạ Tia bức xạ gây nên những biến đổi hóa học và tổn thương sinh học nếu được tế bào hấp thụ. Bao gồm tia tử ngoại (UV), tia X, tia γ Tia tử ngoại có tính sát khuẩn mạnh nhất ở bước sóng 250 ÷ 280nm 2. Các yếu tố hóa học * pH Mỗi một loài vi sinh vật có một khoảng pH nhất định để phát triển và sinh sản. Ở khoảng pH này, các loài vi sinh vật có giới hạn pH phát triển cao và pH phát triển thấp. Ngoài ra còn có giá trị pH tối ưu. Các vi sinh vật thực phẩm có giá trị pH tối ưu rất khác nhau. Chính vì thế ở bất kỳ giá trị pH nào, trong thực phẩm cũng tồn tại vi sinh vật hoặc là loài này, hoặc là loài khác. * Các chất diệt khuẩn Có một số thực phẩm có tính bền vững trong một thời gian nhất định là do chúng có chứa một số chất có khả năng kháng khuẩn. Trong đó các chất gia vị chứa nhiều chất có khả năng kháng khuẩn. * Phenol,alcohol Tác dụng lên vi sinh vật bằng cách gây đông tụ protein và khử nước mạnh do rút nước khỏi tế bào. * Halogen Có tính sát khuẩn mạnh do tác động oxy hóa, tác động lên protein của vi sinh vật, phá hủy các thành phần tế bào. Chương 11: Các Yếu Tố Cơ Bản Trong Kiểm Nghiệm Vi Sinh Vật Yêu cầu trong kiểm nghịêm vi sinh vật 1. Yêu cầu về phòng kiểm nghiệm Thông thường phòng kiểm nghiệm cần được phân thành các khu vực riêng biệt như sau : • Thu mẫu và lưu mẫu. • Rữa dụng cụ thuỷ tinh, khử trùng dụng cụ, tủ ấm ủ mẫu. • Bảo quản hoá chất • Chuẩu bị môi trường. • Khu vực thao tác nuôi cấy mẫu • Khu vực thao tác các vi sinh vật gây bệnh Ngoài ra phòng phải được chiếu sáng đầy đủ, cần có hệ thống thông khí đảm bảo ngăn sự đóng bụi và không cho lan truyền các bào tử nấm cũng như các vi sinh vật khác. Khu vực thao tác nuôi cấy nên được lắp đặt đèn tử ngoại để đảm bảo tiệt trùng không khí và không gian thao tác. Khu vực này được trang bị máy điều hoà không khí. Mặt khác cần lưu ý nên hạn chế hoặc không dùng quạt trong phòng kiểm nghiệm vi sinh và tránh làm đổ môi trường, hóa chất trực tiếp dưới ánh nắng mặt trời. 2. Các quy tắc an toàn trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng trong kiểm nghiệm vi sinh vật. Khi làm việc với vi sinh vật chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109tế bào/ml). Do vậy cần tuân thủ một số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho bản thân và cho những người khác trong phòng thí nghiệm như sau: • Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật . • Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm, mang khẩu trang khi thao tác với vi sinh vật . • Mặc áo blouse trong thời gian làm việc. • Trước khi bắt đầu làm việc cần sát trùng mặt bàn bằng giấy lau tẩm cồn 700 hoặc dung dịch chất diệt khuẩn khác, để khô. Thực hiện tương tự cho hai tay. Chú ý chưa đốt đèn cồn hoặc đèn Busen khi tay chưa khô cồn. Lặp lại việc sát trùng này khi hoàn thành công việc. • Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất cả các hợp petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy. • Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau đó thực hiện khử trùng lại bàn làm việc. • Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen. Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác. Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua ngọn lửa. Cần có cách bảo vệ tóc thích hợp trường hợp có tóc dài. • Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipet) không hút bằng miệng. • Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất cả mảnh vỡ vào một túi rác riêng. • Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng • Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được hấp khử trùng trước khi thải bỏ vào các bãi rác. Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng. • Cần gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các hộp petri lên nhau. • Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hô hấp. • Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng hoặc đầu que cấy vào chân ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm vi sinh vật vào không khí. • Sát trùng và rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm. Dụng cụ và thiết bị • Dụng cụ thủy tinh : ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, cốc thủy tinh, ống hút, bình tam giác, ống đong,… • Các loại que cấy :que cấy thẳng, que cấy vòng, que cấy móc. • Nhiệt kế • pH kế • Cân • Tủ sấy • Máy cất nước • Tủ ấm • Máy lắc • Tủ lạnh • Đèn tử ngoại • Nồi hấp • Tủ cấy vô trùng • Kính hiển vi,…. Các thành phần chủ yếu trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật 1. Nước Nước là thành phần không thể thiếu được trong môi trường nuôi cấy, là yếu tố quan trọng nhất quyết định sự phát triển của mọi vi sinh vật. Sự trao đổi chất, quá trình sinh tổng hợp cấu trúc tế bào, trong môi trường không có nước mọi hoạt động dinh dưỡng đều bị dừng lại, bởi ở trạng thái khô mọi dinh dưỡng đều không thể thâm nhập vào tế bào. 2. Thạch (agar) Thạch là một loại polygalactoside thu được từ một số loài tảo đỏ thuộc lớp Rhodophyceae (ví dụ như rong câu, rất phổ biến ở một số vùng ven biển Việt Nam), rất nhiều loài vi sinh vật không dùng nó làm cơ chất dinh dưỡng. Nồng độ thích hợp để làm môi trường rắn thường dùng là 1÷ 2%. Nếu môi trường có giá trị pH thấp hơn 5,0 nồng độ thạch cần tăng lên 2 ÷ 2,2% hoặc tốt nhất là chỉnh pH sau khi đã khử trùng môi trường. 3. Pepton Pepton (sản phẩm phân giải protein) được dùng trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật dị dưỡng. Tùy theo nguồn protein (như casein, gelatin, thịt, bột đậu nành,…) và loài tác nhân phân giải chúng, người ta sản xuất nhiều loại pepton dùng cho các mục đích nuôi cấy khác nhau. • Pepton tryticase (pepton từ casein dạng pancreatic) • Pepton phytone (hay pepton papainic từ bột đậu nành) • Pepton thịt - sản phẩm phân giải thịt bằng pepsin • Pepton polypeptone (hay universal peptone) là hỗn hợp nhiều loại pepton (từ casein, thịt, đậu nành) 4. Meat extract Cao thịt được chế biến từ thịt và xử lý sơ bộ bằng men phân giải protein trước khi trích ly và cô đặc. Đây là một thành phần dinh dưỡng cực tốt. 5. Yeast extract Được chế biến bằng cách đông khô nấm men đã qua quá trình tự phân giải. Yeast extract thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 3g/l 6.Bột gan Được chế biến bằng cách làm khô và nghiền nhỏ gan bò tươi, dung dịch dinh dưỡng từ bột gan rất thích hợp cho việc nuôi dưỡng các vi sinh vật kỵ khí. 7. Các chế phẩm từ mật bò Thường được dùng trong các môi trường chọn lọc hoặc phân lập do có khả năng kích thích sự phát triển của hệ vi sinh vật đường ruột và ức chế các vi khuẩn gram dương. 8. Các cơ chế để thử phản ứng sinh hóa Các tính chất sinh hóa là những chỉ tiêu chuẩn quan trọng nhất để định danh và phân loại vi sinh vật. Các tính chất này được xác định bởi khả năng của vi sinh vật sản sinh ra những loại men nhất định có tác dụng phân giải hoặc làm biến đổi những cơ chất tương ứng. Bản chất của các test sinh hóa là dùng những cơ chất nhất định để thử khả năng phân giải hoặc biến đổi chúng của các dòng vi sinh vật được cấy vào trong môi trường. Các vi sinh vật có khả năng tạo ra những men tác dụng lên các cơ chất tương ứng sẽ tạo nên những chất mới trong môi trường. Sự xuất hiện các chất mới này có thể nhận biết được bằng thuốc thử hoặc những chất chỉ thị màu phù hợp cho thấy sự thay đổi pH trong môi trường. Xử lý môi trường trong kiểm nghiệm 1. Bảo quản Các môi trường đông khô cần được bảo quản ở nơi khô, tốt với nhiệt độ trung bình khoảng 15 ÷ 20oC, luôn đậy nắp kín để tránh hơi nước xâm nhập. 2. Pha chế Để pha chế môi trường đông khô phải luôn dùng nước sạch, nước cất hoặc nước khoáng có pH trung tính. Không nên pha quá 1 ÷ 2 lít trong một bình. 3. Khử trùng Môi trường tùy theo loại thường được khử trùng bằng nồi thanh trùng autoclave ở 121oC trong 15 phút (không kể thời gian nâng nhiệt). 4. Đổ đĩa Môi trường thường được đổ ra đĩa ở nhiệt độ 45 ÷ 55oC nhằm tránh sự ngưng kết hơi nước trên bề mặt dĩa petri. 5. Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng Các ống nghiệm chứa môi trường thạch đã khử trùng vẫn còn lỏng được đặt sao cho phần mặt nghiêng và phần đáy đều dài khoảng 3cm và được để đông lại trong trạng thái ấy. 6. Bảo quản môi trường đã pha chế Môi trường đã pha cần được giữ trong điều kiện lạnh và tối từ 1 ÷ 6oC hoặc có thể bảo quản ở nhiệt độ cao hơn khoảng 10 ÷ 15oC. Môi trường thạch không được giữ dưới 0oC bởi nhiệt độ này sẽ phá vỡ cấu trúc gel của môi trường. 7. Khử trùng vật liệu nuôi cấy sau khi sử dụng Môi trường nuôi cấy vi sinh vật và các vật liệu bị nhiễm cần được khử trùng, hủy bỏ hoặc làm sạch một cách phù hợp. Việc khử trùng bằng xử lý nhiệt đóng vai trò đặc biệt quan trọng trước khi làm sạch hoặc loại bỏ các vật liệu sau khi nuôi cấy. Đối với dụng cụ thủy tinh dùng nhiều lần (bình tam giác hoặc ống nghiệm) có thể khử trùng bằng autoclave ở 121oC trong khoảng 30 phút. Chương 12: Phương Pháp Thu, Bảo Quản Và Chuẩn Bị Mẫu Phương pháp thu và bảo quản mẫu 1.Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu nước Về nguyên tắc cần thu mẫu sao cho có tính đại diện cho khối nước cần kiểm nghiệm. Khi thu mẫu nước cần chú ý : • Sử dụng bình thu mẫu loại dùng một lần hoặc có thể dùng nhiều lần. Trường hợp dùng bình chứa nhiều lần, chất liệu của bình phải cho phép khử trùng lập lại nhiều lần mà không tạo ra các tạp chất ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi sinh vật. • Khi cần thiết phải bổ sung tác chất vô trùng để trung hoà các dư lượng chất diệt khuẩn hiện diện trong nước. Tác chất trung hoà này phải không ảnh hưởng đến sức sống hoặc sự tăng trưởng của vi sinh vật . • Lưu ý tránh gây tạp nhiễm mẫu trong lúc thu mẫu bảo quản và vận chuyển mẫu. Trên mỗi bình chứa cần ghi chú rõ ràng, đầy đủ các thông tin cần thiết liên quan đến mẫu (địa điểm, thời gian, mục đích, người thu…) • Mẫu nên được phân tích trong vòng 6 giờ sau khi thu mẫu. Do việc phân tích thường được tiến hành ở phòng thí nghiệm nên cần vận chuyển mẫu từ nơi thu mẫu đến phòng thí nghiệm 2.Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu thực phẩm Tiêu chuẩn quy định về mật độ cho phép của các vi sinh vật trong thực phẩm thay đổi tùy theo nhóm vi sinh vật cần phân tích, đối tượng thực phẩm, tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm của từng nước. Đối với vi sinh vật gây bệnh, mức độ nguy hiểm cao, tiêu chuẩn thường được quy định không cho phép có sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong một đơn vị khối lượng thực phẩm nhất định. Tuy nhiên, kết quả phân tích, định lượng vi sinh vật trong từng mẫu thực phẩm thường không phản ánh chính xác mật độ vi sinh vật thực tế hiện diện trong mẫu. Do vậy, thông thường cần thực hiện việc định lượng trên một số mẫu xác định và sử dụng những khoảng giới hạn quy ước để nhận định kết quả Trong các nhà máy sản xuất chế biến thực phẩm về nguyên tắc mẫu cần được thu tại nhiều thời điểm và công đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất, tránh việc thu chỉ tại một thời điểm một vị trí hay công đoạn. Dụng cụ chứa mẫu, vận chuyển và bảo quản mẫu 1.Dụng cụ thu chứa mẫu Dụng cụ thu mẫu thay đổi tuỳ theo loại thực phẩm. Trường hợp thực phẩm đông lạnh, có thể sử dụng các ống khoan tay vô trùng, các dao đã được sát trùng để tách hàm lượng mẫu cần thiết sau đó dùng thìa, kéo để cho mẫu vào dụng cụ chứa. Đối với các loại mẫu như thịt hay cá, nơi nhiễm vi sinh vật chủ yếu là bề mặt. Do vậy có thể sử dụng que bông vô trùng quét một diện tích bề mặt nhất định hay cắt lát với bề dày từ 2 ÷ 3mm để thu mẫu. Dụng cụ chứa mẫu thường là các bình nhựa có nắp bằng nhôm hay bằng chất dẻo, bao nylon chứa mẫu. Tránh sử dụng các bình bằng thủy tinh để chứa mẫu vì dễ vỡ. 2. Vận chuyển và bảo quản mẫu Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau trong các thùng bảo quản mẫu được làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải không được tan chảy trong suốt quá trình vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm mẫu được chuyển vào trong tủ đông và được phân tích ngay khi có thể. Nếu không phân tích ngay mẫu phải được bảo quản ở -200C cho đến khi phân tích. Trường hợp mẫu không thể bảo quản đông thì có thể được bảo quản trong tủ lạnh ở 0 ÷ 40C nhưng không được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hư hỏng có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích. Chuẩn bị mẫu 1. Những điều cần thiết để định số mẫu kiểm nghiệm vi sinh vật Bản chất của thức ăn và cách thức dùng thức ăn đó (ăn sống, chế biến, ăn ngay sau khi nấu, nướng hay để tủ lạnh, thức ăn có nấu lại trước ăn hoặc không…), người ăn (người khỏe mạnh, trẻ em, người lớn tuổi, người ốm,…). Nhìn chung số mẫu được tăng dần lên khi vi sinh vật chỉ điểm báo hiệu vi sinh vật gây bệnh ở mức trung bình tới mức nghiêm trọng và phải tính đến khả năng của phòng thí nghiệm và chi phí cho việc phân tích cũng như phải tính đến khả năng của công nghiệp đối với tiêu chuẩn mong muốn. Ủy ban Quốc tế về kỹ thuật vi sinh thực phẩm (The International Commission of Microbiological Specification for Foods - ICMSF) đã đưa ra kế hoạch chọn mẫu trên cơ sở thống kê cho các nước trên thế giới, theo bảng kế hoạch hướng dẫn đó thì m và M là số lượng vi sinh có mặt trong một ml hoặc 1g thức ăn. • Khoảng chấp nhận (m): khi mật độ vi sinh vật nằm dưới một trị số là m. • Khoảng không chấp nhận (M): khi mật độ vi sinh vật cao hơn một trị số giới hạn là M. Thông thường trị số giới hạn M lớn hơn ít nhất 10 lần trị số m. • Khoảng lân cận giới hạn (C): khi mật độ vi sinh vật lớn hơn m nhưng nhỏ hơn M. 2. Kế hoạch mẫu • Kế hoạch hai lớp thuộc tính Kế hoạch này dựa trên kết luận dùng hoặc hủy bỏ và được biểu thị: - n = 10, c = 0 : nghĩa là 10 đơn vị mẫu đã được kiểm nghiệm, không được có một đơn vị nào dương tính (có vi sinh vật). Nếu có là toàn lô mẫu phải loại bỏ. - n = 10, c =2 : nghĩa là trong 10 đơn vị mẫu kiểm nghiệm có một hoặc hai đơn vị mẫu có vi sinh vật thì lô đó được chấp nhận, còn trên hai mẫu thì phải bỏ cả lô. • Kế hoạch ba lớp thuộc tính Kế hoạch này được biểu thị : n, c, m, M. Một đơn vị mẫu nào đấy có thể được chấp nhận hoàn toàn một phần hoặc bị loại bỏ. Ở đây kết quả của đơn vị mẫu trên giá trị m được chấp nhận khi đơn vị đó không nhiều hơn c mà không kể đến kết quả m là bao nhiêu cũng như vượt quá M. So với kế hoạch hai lớp kể trên thì kế hoạch này có sự phân biệt giữa m và M khi giá trị vi sinh vật trên M. 3.Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu: trong đa số các trường hợp, mẫu nước và thực phẩm không cần xử lý gì đặc biệt trước khi phân tích vi sinh vật. Khi cần thiết mẫu cần được pha loãng thập phân để được các độ pha loãng cần thiềt bằng nước cất, nước muối hay môi trường lỏng vô trùng. * Giải đông mẫu trước khi phân tích. Mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước khi được phân tích. Trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được giải đông bên trong các dụng cụ chứa đã được sử dụng để thu mẫu và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm, không chuyển mẫu sang dụng cụ chứa khác. Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ 2 ÷ 5 0C trong khoảng 18 giờ. Khi cần thiết, có thể giải đông nhanh ở 450C trong 15 phút. Trường hợp này, cần liên tục lắc bình chứa mẫu để làm tăng tốc độ giải đông và làm đồng nhất nhiệt độ bên trong mẫu. * Đồng nhất mẫu Do sự phân bố không đồng đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên mẫu cần được làm đồng nhất trước khi phân tích. Việc đồng nhất các mẫu lỏng được thực hiện bằng cách lắc kỹ trước khi phân tích. Các mẫu rắn được lắc hay đảo trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng ví dụ như thiết bị dập mẫu trong điều kiện vô trùng sau khi mẫu được đồng nhất, tùy yêu cầu của chỉ tiêu phân tích, thực hiện thu một lượng xác định của mẫu để tiến hành phân tích. * Cân mẫu Cân chính xác một lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầu của chỉ tiêu phân tích với sai số cho phép là ± 0,1gam. Lượng mẫu này được cho vào trong các bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vô trùng. Chương 13: Phương Pháp Định Lượng Vi Sinh Vật Phương pháp đếm trực tiếp Mật độ vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm men, tảo …có thể được xác định bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm trên kính hiển vi. Quy trình đếm trực tiếp cho phép xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật trong mẫu nhưng phương pháp này có một số nhược điểm là không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bào chết, dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các hạt vật thể khác trong mẫu, khó đạt được độ chính xác cao, không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp. Phương pháp đếm khuẩn lạc Khác với phương pháp đếm trực tiếp, phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Do vậy phương pháp này có tên gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc (colony count) hay đếm đĩa (plate count). Phương pháp này có đặc điểm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy. Mặc dù vẫn còn một số nhược điểm nhưng phương pháp đếm khuẩn lạc vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào sống. Ngoài ra phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu. Phương pháp này được sử dụng rộng rải trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm. Phương pháp màn lọc Phương pháp này thường được dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trong mẫu nước khi tiến hành các thử nghiệm môi trường nơi có mật độ vi sinh vật tương đối thấp. Phương pháp này gồm bước lọc để tập trung vi sinh vật trong mẫu nước trên màng lọc và xác định số tế bào vi sinh vật dựa vào số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm. Dựa trên khối lượng mẫu nước ban đầu và quy ước là mỗi khuẩn lạc được hình thành từ 1 tế bào vi sinh vật, người ta quy ước ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích nước. Như vậy, phương pháp này là sự kết hợp của phương pháp lọc vô trùng và phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa petri. Phương pháp MPN Là phương pháp số có xác suất cao nhất, số tối khả hay là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng : số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị số MPN càng lớn. Phương pháp MPN có thể dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể được nuôi cấy trong môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả biểu kiến thích hợp. Phương pháp đo độ đục Ngoài các phương pháp nêu trên, mật độ vi sinh vật có thể được xác định một cách gián tiếp thông qua độ đục. Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục. Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp nối tiếp thông qua độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 ÷ 610nm. Trong trường hợp này,trước tiên cần phải thiết lập được quan hệ tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng cách sử dụng một số huyền phù tế bào có độ đục xác định và mật độ tế bào của mỗi huyền phù được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp khác, ví dụ như phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp đếm trực tiếp... Chương 14: Kiểm Tra Vi Sinh Vật Trong Thực Phẩm Đặc tính của một số vi sinh vật tiêu biểu 1. Vi sinh vật hiếu khí Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu. Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm 2. Coliforms và Escherichia coli (E.coli) * Coliforms Coliforms là những trực khuẩn hình gậy, gram âm (-), không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý. Chúng có khả năng phát triển ở nhiệt độ rất rộng từ -2oC đến 50oC, pH trong khoảng 4,4 ÷ 9,0. Coliforms có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 ÷ 48giờ. Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên trong ruột người, động vật. Khi số Coliforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao …. Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 440C tromg môi trường canh EC. Coliforms phân là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24 giờ ở 45,50C trong canh Trypton. Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống. Colifocmơ bao gồm những chủng như Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Kiobsielia và Serratia. * E.coli Từ năm 1700 người ta đã phát hiện E.coli là một loài vi sinh vật gây bệnh (Niel M.A. Tarr P.I,1994). Năm 1885 nhà khoa học người Đức là Theodor Escherich đã tách được loài vi sinh vật này từ phân trẻ em bị bệnh. Sau này vi khuẩn này được mang tên ông. Năm 1971 người ta xếp chúng vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và là một vi sinh vật chỉ thị nhiểm trùng thực phẩm. E.coli thuộc họ Enterbacteriaceae, catalose (+), oxidase (-), gram (-), trực khuẩn ngắn, không tạo bào tử, chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2 giờ. E.coli có thể kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%, bị hủy bởi focmol 5%, có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 30 ÷ 50oC, nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng là 37oC, phát triển ở pH tối ưu là 4,4 và aw tối ưu là 0,95. E.coli sống ở ruột già của người và của động vật, có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi, có khả năng khử nitrat thành nitrit. Khả năng gây bệnh rất đa dạng và nguy hiểm. 3. Staphylococcus Năm 1894 J.Denys là người đầu tiên nghiên cứu về Staphylococcus và các độc tố của chúng trong thực phẩm. Năm 1914 Barber và sau đó 1930 GM.Dack tìm thấy Staphylococcus trong sữa. Hiện nay, người ta đã tìm thấy tất cả 31 loài Staphylococcus. Staphylococcus là loại cầu khuẩn gram (+), các tế bào của chúng liên kết thành hình chùm nho. Khi phát triển trong môi trường, Staphylococcus có khả năng tạo ra sắc tố từ màu trắng đến vàng sậm, nhiệt độ 20 ÷ 25oC thích hợp nhất cho chúng tạo màu. Staphylococcus không di động, không tạo bào tử, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 37oC, chịu được sự khô hạn, hơi nóng (ở nhiệt độ 50oC chúng vận sống trong 30 phút), có khả năng sống ở nồng độ muối 9 ÷ 10%. Staphylococcus phát triển ở pH rất rộng (pH = 4,0 ÷ 9,8). Khoảng pH tối ưu của chúng là 6 ÷ 7 và aw tối ưu khoảng 0,83 ÷ 0,86. Staphylococcus có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose. Staphylococcus được phân bố khắp nơi nhưng chủ yếu được phân lập từ da và màng nhầy của người và động vật máu nóng. Staphylococcus có thể nhiễm vào trong thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của Staphylococcus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến . 4. Faecal streptococcus (Streptococcus phân) Streptococcus phân là các liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân, có hình cầu hay hình ovan kéo dài, garm (+), thường tụ tập thành từng đôi hay từng chuỗi, không di động, không sinh bào tử. Các loại này sống hiếu khí tùy ý nhưng phát triển tốt trong điều kiện kị khí. Streptococcus được sử dụng như là chỉ thị chất lượng vệ sinh thực phẩm Cầu khuẩn đường ruột trong thực phẩm là Streptococcus faecalis và S. faecium . Cả hai loạI này cư trú tự nhiên trong đường ruột của người và động vật, là chỉ điểm vệ sinh vì vi khuẩn có sức đề kháng tương đối cao với thời tiết , nhiệt độ cao, và chất tẩy. 5. Salmonella Trước năm 1983 các nhà khoa học chia Salmonella ra làm 3 loài dựa theo phản ứng sinh hóa mà chúng tham gia : S.typhi, S.choleraesuis,S. enteridis Salmonella là trực khuẩn garm (-), hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và manitol sinh acid nhưng không lên men sacarose và lactose, không sinh indole, không phân giải urê không có khả năng tách nhóm amin từ tryptophane,hầu hết các chủng đều sinh H2S . pH tối ưu cho chúng phát triển nằm trong vùng trung tính, tuy nhiên đôi khi phát triển trong vùng pH từ 4 ÷ 9, không có khả năng phát triển ở nồng độ muối cao. Vi khuẩn Salmonella tồn tại trong cơ thể nhiều loài động vật và có thể gây bệnh cho ngườI. Vi khuẩn Salmonella có thể gây bệnh truyền nhiễm cho động vật như phó thương hàn bò, phó thương hàn lợn, bệnh sẩy thai cừu và ngựa, bệnh bạch lỵ gà, bệnh viêm ruột bò,… Những bệnh kể trên do Salmonella gây ra người ta gọi là bệnh truyền nhiễm nguyên phát, ngoài ra có thể phá hiện được Salmonella trong chất bài tiết của động vật. 6. Bacillus cereus Bacillus cereus là những trực khuẩn garm (+), hiếu khí và kị khí tùy ý, di động tạo họ nội bào tử lên men glucose sinh hơi, có khả năng sử dụng nitrat. Vi khuẩn này hiện diện trong đất bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô…) 7. Clostridium Clostridium là các vi khuẩn garm (+), hình que, kị khí sinh bào tử , không di động, có thể thủy giải saccaride và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng tạo ra các sản phẩm như acid acetic, butiric, rượu, tạo ra các mùi khó chịu trong sản phẩm. Clostridium phát triển mạnh ở nhiệt độ 55oC, nhiệt độ tối ưu là 43 ÷ 47oC. Nhiệt độ 15 ÷ 20oC làm chậm hoặc làm ngưng sự phát triển của vi khuẩn này. Không phát triển ở pH hơn 5,0 hoặc trên 9,0, bị ức chế bởi 5% NaCl . Clostridium hiện diện trong đất, một số loài trong nhóm này gây bệnh cho người và động vật, một số loài khác gây hư hỏng thực phẩm, khử sunphit thành sunphur tạo ra màu đem và gây mùi khó chịu . 8.Nấm men, nấm mốc Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, đây là nhóm vi sinh vật nhân thật có vách tế bào và lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài nấm men và nấm móc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng. Chúng chỉ có khả năng nhận các chất dinh dưỡng ở dạng hòa tan. Trong quá trình trao đổi chất xảy ra ở tế bào chúng lại có khả năng chuyển hóa các chất hòa tan thành các chất không hòa tan như lignocellulose,…. Ngoài ra, chúng còn có thể tạo ra các chất độc, các chất độc của chúng được gọi chung là độc tố vi nấm (mycotoxins). Tiêu biểu có Aspegillus flavus, Aspegillus parasiticus, Aspegiluus moninus, Penicillium italicum, Penicillium digitatum, Penicillium roquefortii, Penicillium cammenbertii. Trong thực phẩm nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh muồi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Kiểm tra vi sinh vật trong nguyên liệu thực phẩm và thực phẩm 1. Kiểm tra vi sinh vật nước Nước được coi như một dạng nguyên liệu rất đặc biệt trong chế biến một số loại thực phẩm. Mặt khác nước cũng được coi như nguồn lây nhiễm vi sinh vật trong chế biến thực phẩm. Người ta chia nước ra làm 3 loại dựa trên sự liên quan đến vi sinh vật. • Nước đã sát khuẩn (nước máy, nước cất ...) • Nước chưa sát khuẩn (nước ao, hồ, sông ....) • Nước thải * Yêu cầu kiểm tra vi sinh vật nước bao gồm : 1.1. Kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí Tùy mức độ nhiễm bẩn của nước mà ta pha loãng với các mức độ khác nhau. Phương pháp kiểm tra được thực hiện theo phương pháp pha loãng ở những mức độ khác nhau, tiến hành cấy trên môi trường thạch thường, nuôi ở 370C trong 48 giờ. Sau đó tiến hành đọc kết quả. 1.2. Tìm chỉ số E.coli (coli index) Chỉ số E.coli đóng vai trò quyết định giá trị của nước về mặt vi sinh vật. Sự có mặt của E.coli trong nước chứng tỏ nước bị nhiễm phân. Số lượng E.coli /1 lít nước được quy định ở nhiều nước rất khác nhau. Ở nước ta là 20 E.coli / 1 lít nước. Ở các nước khác từ 3 ÷ 8 E.coli /1 lít nước. 1.3. Kiểm tra vi khuẩn gây bệnh : Trong trường hợp nước chứa các vi khuẩn bây bệnh như E.coli, Proteus ... Ngoài ra trong nước có rất nhiều tạp khuẩn như Pseudomonas, Serrtia ... . Ở nước sạch việc kiểm tra vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhiều khó khăn vì khó tìm ra. Do đó lượng nước cần lấy mẫu rất lớn (khoảng 10 lít). Mặt khác, môi trường được sử dụng là những môi trường tăng sinh. Hiện nay có hai phương pháp được áp dụng rộng rãi là : • Phương pháp dùng màng lọc máy hút chân không. Ta tiến hành hút lượng nước khá lớn cho qua màng lọc và sau đó lại cấy chúng trên những môi trường đặc hiệu và phân lập các vi khuẩn gây bệnh như lỵ, thương hàn, thổ tả theo các phương pháp thông thường. • Phương pháp dùng sulfat nhôm để lắng cạn xuống. Tách nước trong bằng máy hút chân không. Thu lấy cặn và cấ qua các loại môi trường đặc hiệu đồng thời tiến hành phân lập từng loạI vi khuẩn gây bệnh như lỵ, thương hàn, thổ tả theo các phương pháp thông thường. 2. Kiểm tra vi sinh vật nước giải khát Kiểm tra vi sinh vật trong nước giảI khát bao gồm : 2.1. Kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí • Pha loãng nước giải khát đóng chai 1/10, 1/100, 1/1000 • Pha loãng nước giải khát không đóng chai (để hở ) phải pha loãng nhiều hơn 1/100, 1/1000 và 1/10000 2.2. Kiểm tra E.coli Tiêu chuẩn nước giải khát đóng chai là không được chứa E.coli nên trong quá trình kiểm tra chỉ cần sử dụng phương pháp định tính. Nếu thấy có E.coli thì nước giải khát đó không đạt yêu cầu. 2.3. Kiểm tra nấm mốc Môi trường dùng để kiểm tra là Saburo, thạch glucose 1% hay môi trường Zapek. Điều chỉnh pH 4,5 ÷ 5,5. 2.4. Kiểm tra vi khuẩn gây đục Các loài vi khuẩn gây đục nước giải khát thường là : • Bacillus subtilis • Bacillus mensentericus • Leuconnostoc mensenteroides 2.5. Kiểm tra vi khuẩn gây bệnh Trong nước giải khát người ta kiểm tra vi khuẩn gây bệnh chỉ khi thật cần thiết. Mặt khác không nhất thiết phải kiểm tra tất cả các loài vi sinh vật gây bệnh mà chỉ kiểm tra tụ cầu vàng gây bệnh. 3. Kiểm tra vi sinh vật trong bia Yêu cầu kiểm tra vi sinh vật trong bia bao gồm : 3.1. Kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí Môi trường dùng để kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí là môi trường glucose 1%. Tốt nhất là môi trường mantose 1%. 3.2. Kiểm tra E.coli (kiểm tra định tính) Người ta thường phải tiến hành kiểm tr E.coli vì E.coli được xem như một vi sinh vật chỉ thị bắt buộc về chất lượng vệ sinh của bia. 3.3. Kiểm tra nấm men bia Lượng nấm men còn sót lại sau khi lọc bia sẽ làm giảm chất lượng bia trong quá trình bảo quản. Vì thế phải tiến hành kiểm tra lượng nấm men còn sót lại. 3.4. Kiểm tra các vi khuẩn làm đục bia Nếu thấy bia đục phải kiểm tra các loài vi sinh vật sau : • Bacillus subtilis • Leueonostoc mesenteroides Việc kiểm tra này chỉ mang mục đích là tìm nguyên nhân gây đục bia chứ không phải là mục đích tái sử dụng sau khi loại hiện tượng đục bia. Khi bia đã bị đục có nghĩa là bia đã không đảm bảo chất lượng. 4. Kiểm tra vi sinh vật trong sữa * Yêu cầu kiểm tra vi sinh vật trong sữa bao gồm : 4.1. Kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí • Đối với mẫu sữa tươi hoặc các sản phẩm từ sữa dạng lỏng phải pha loãng 1/10, 1/100, 1/1000. • Đối với sữa bột hoặc các sản phẩm sữa ở dạng khô hoặc dạng đặc lấy 5 gram mẫu pha loãng vào 45ml nước máy vô trùng. Sau đó tiền hành pha loãng với những tỷ lệ khác nhau. 4.2. Kiểm tra E.coli (phương pháp Kessl Swenarlon) Tiến hành chuẩn bị 9 ống môi trường Kessle. Cấy vi sinh vật ở ba độ pha loãng khác nhau, mỗi độ pha loãng ba ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 1ml sữa. 4.3. Kiểm tra vi khuẩn gây bệnh Kiểm tra các loại vi khuẩn sau : • Vi khuẩn lao • Liên cầu tan máu • Tụ cầu gây bệnh Ngoài ra người ta còn kiểm tra vi khuẩn Brucella, thương hàn, bại liệt, vi rút. 4.4. Kiểm tra khử xanh metylen Phương pháp này tìm ra do Pasteur, Orla và Jensen. Sự biến màu xanh metylen trong sữa phụ thuộc vào số lượng nhiều hay ít của vi sinh vật có trong sữa. Nguyên nhân là khi vi sinh vật phát triển trong sữa sẽ nhận hết oxy có trong sữa và do đó làm xanh metylen mất màu. Phương pháp này vừa nhanh, kết quả tương đối chính xác và chỉ cần ít dụng cụ, tiết kiệm được môi trường nuôi cấy. 5. Kiểm tra vi sinh vật đồ hộp động vật * Yêu cầu kiểm tra vi sinh vật sau : • Kiểm tra vi sinh vật hiếu khí • Kiểm tra vi sinh vật kỵ khí • Kiểm tra Clostridium và độc tố • Kiểm tra vi sinh vật chịu nhiệt 6. Kiểm tra vi sinh vật đồ hộp thực vật * Yêu cầu kiểm tra vi sinh vật sau : • Tìm tổng số vi sinh vật hiếu khí • Kiểm tra tổng số bào tử của vi sinh vật hiếu khí • Kiểm tra vi khuẩn E.coli • Kiểm tra vi sinh vật sinh H2S • Kiểm tra vi khuẩn chịu nhiệt 7. Kiểm tra vi sinh vật nước mắm, nước chấm * Yêu cầu kiểm tra vi sinh vật sau : • Kiểm tra vi sinh vật hiếu khí • Kiểm tra E.coli • Kiểm tra trực khuẩn kỵ khí sinh H2S. • Kiểm tra trực khuẩn hiếu khí sinh H2S Tiêu chuẩn vi sinh vật với sản phẩm thực phẩm 1. Tôm, mực đông lạnh Bảng 14.1: Yêu cầu vi sinh đối với tôm, mực đông lạnh Tên chỉ tiêu Mức 1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm ≥ 106 2. Coliforms, số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm 3. Staphylococcus aureus, số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm 4. E. coli, trong 1g sản phẩm 5. Salmonella, trong 25g sản phẩm 6. Shigella, trong 1g sản phẩm ≥ 2 x 102 ≥ 102 không có không có không có 2. Thủy sản khô xuất khẩu Bảng 14.2: Yêu cầu vi sinh đối với thủy sản khô xuất khẩu Tên chỉ tiêu Yêu cầu số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm 1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí 2. Clostridium perfringens 3. Staphylococcus aureus 4. E. coli 5. Salmonella (25g sản phẩm) 6. Shigella (25g sản phẩm) 7. Tổng số nấm mốc ≥ 106 ≥ 20 ≥ 102 không cho phép không cho phép không cho phép ≥ 103 3. Mực, cá khô tẩm gia vị ăn liền Bảng 14.3: Yêu cầu vi sinh đối với mực, cá khô tẩm gia vị ăn liền Tên chỉ tiêu Yêu cầu số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm 1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí 2. Tổng số Coliforms 3. Staphylococcus aureus 4. E. coli 5. Salmonella 6. Shigella 7. Tổng số nấm mốc, nấm men 50.000 ≥ 10 không cho phép không cho phép không cho phép không cho phép không cho phép 4. Nước mắm Bảng 14.4: Yêu cầu vi sinh đối với nước mắm Tên chỉ tiêu Mức 1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1ml 2. Coliforms, số khuẩn lạc trong 1ml 3. Clostridium perfringens, số khuẩn lạc trong 1ml 4. Staphylococcus aureus, số khuẩn lạc trong 1ml 5. E. coli, số khuẩn lạc trong 1ml 6. Salmonella, số khuẩn lạc trong 25ml 7. Shigella, số khuẩn lạc trong 25ml ≥ 2 x 104 ≥ 10 ≥ 2 không được có không được có không được có không được có 5. Sản phẩm chế biến từ thịt: thịt hun khói, patê,… Bảng 14.5: Yêu cầu vi sinh đối với thịt hun khói, patê Tên chỉ tiêu Yêu cầu số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm 1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí 2. Coliforms 3. Staphylococcus aureus 4. E. coli 5. Salmonella (25g) 6. Clostridium perfringens 7. Bacillus aureus 3 x 105 50 10 3 không cho phép 10 10 6. Sữa tươi tiệt trùng Bảng 14.6: Yêu cầu vi sinh đối với sữa tươi tiệt trùng Tên chỉ tiêu Yêu cầu số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm 1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí 5 x 104 2. Coliforms 3. E. coli 4. Salmonella (25ml) 10 3 không cho phép 7.Rau quả muối, rau quả khô Bảng 14.7: Yêu cầu vi sinh đối với rau quả muối, rau quả khô Tên chỉ tiêu Yêu cầu số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm 1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí 2. Coliforms 3. E. coli 4. Clostridium perfringens 5. Bacillus aureus 6. Tổng số nấm mốc, nấm men 104 10 không cho phép 10 102 102 8. Nước giải khát có cồn Bảng 14.8: Yêu cầu vi sinh đối với nước giải khát có cồn Tên chỉ tiêu Yêu cầu số khuẩn lạc trong 1ml sản phẩm 1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí 2. E. coli 3. Staphylococcus aureus 4. Clostridium perfringens 10 không cho phép không cho phép không cho phép 9. Đồ hộp thịt cá, rau quả Bảng 14.9: Yêu cầu vi sinh đối với đồ hộp thịt, cá, rau quả Tên chỉ tiêu Yêu cầu số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm 1. E. coli 2. Staphylococcus aureus 3. Clostridium perfringens 4. Clostridium botulium 5. Tổng số nấm mốc, nấm men không cho phép không cho phép không cho phép không cho phép không cho phép 10. Dầu mỡ Bảng 14.10: Yêu cầu vi sinh đối với dầu mỡ Tên chỉ tiêu Yêu cầu số khuẩn lạc trong 1ml sản phẩm 1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí 2. Coliforms 3. E. coli 4. Staphylococcus aureus 5. Salmonella 103 10 3 không cho phép không cho phép Tài liệu tham khảo 1. Dương Thị Phượng Liên - 2001 - Bài giảng Kiểm tra chất lượng thực phẩm bằng phương pháp cảm quan - Đại học Cần Thơ. 2. Ngô Thị Hồng Thư - 1989 - Kiểm nghiệm thực phẩm bằng phương pháp cảm quan - NXB Khoa học kỹ thuật 3. Hà Duyên Tư -1991 - Kỹ thuật phân tích cảm quan - Hà Nội 4. Phạm văn Sổ, Bùi Thị Nhu Thuận - 1991 - Kiểm nghiệm lương thực và thực phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội. 5. Nguyễn Đức Lượng - 2000 - Công nghệ vi sinh vật - tập 1,2 - Đại học Bách Khoa TP.HCM. 6. Trần Linh Phước - 2002 - Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm - NXB Giáo dục 7. Vũ Ngọc Trung, Lê Thế Ngọc - 1998 - Sổ tay kỹ thuật bảo quản lương thực - NXB Khoa học kỹ thuật 8. Methods of Enzymatic Food Analysis - 1980 - Canada Deparment of Agriculture 9. Stone H. and Side J. L. -1993 - Sensory Evaluation Practices - Academic Press, INC 10. 10. William Horwitz, Editor - 2000 - Official Methods of Analysis of AOAC International