Chương II. Ứng dụng vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm

II. Ứng dụng vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm Các khái niệm Kiểm soát sinh học (biocontrol) Vi sinh vật đối kháng (antagonistic microorganism) Bảo quản bằng phương pháp sinh học (bio-preservation) Vi sinh vật bảo vệ (protective culture) II.1. Kiểm soát sinh học (biocontrol) Biocontrol- Biological Control Google 2.390.000 kết quả; tiếng Việt: 8.910 kết quả PubMed: 7988 bài báo Kiểm soát sinh học gắn liền với phát triển nông nghiệp bền vững Định nghĩa kiểm soát sinh học: “Dùng một loài sinh vật hoặc sản phẩm của sinh vật sống để hạn chế, tiêu diệt sinh vật khác” Kiểm soát sinh học đối với sản phẩm sau thu hoạch Có từ lâu đời Thế kỷ 19: Có một số công bố của các nhà khoa học Khoảng những năm 60: Dịch bệnh trên cây  Phát triển các sản phẩm trừ sâu sinh học Những năm 80: Phát triển ứng dụng vi sinh vật đối kháng đối với sản phẩm sau thu hoạch II.2. Tác nhân kiểm soát sinh họcVi sinh vật đối kháng Vi sinh vật có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật có hại (antagonistic microorganism) Trichoderma kháng mốc thối xám (Botrytis) ở dâu tây Pseudomonas syringae Van Hall có khả năng kháng Botrytis, Penicillium, Mucor và Geotricum Candida oleophila Montrocher kháng Botrytis, Penecillium spp. Yêu cầu của vsv đối kháng Bền về di truyền Hoạt động có hiệu quả ở nồng độ thấp Có khả năng kháng nhiều loại vsv gây hỏng, gây bệnh Nhu cầu dinh dưỡng đơn giản Có khả năng sống trong môi trường không thuận lợi Yêu cầu của vsv đối kháng Có thể sinh trưởng trên cơ chất đơn giản trong thiết bị phản ứng Không gây độc hại đối với vật chủ, không sinh độc tố gây hại cho người Bền dưới tác dụng của các chất bảo quản khác, chịu được các công đoạn xử lý hóa học và vật lý II.3. Cơ chế hoạt động của các tác nhân kiểm soát sinh học Vật chủ (thực phẩm) VSV gây hại, gây bệnh VSV đối kháng VSV khác Cơ chế hoạt động Khả năng sinh kháng sinh Cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian Khả năng bám lên VSV có hại hoặc tác dụng trực tiếp lên chúng (ký sinh) Kích thích khả năng chống chịu VSV gây bệnh của vật chủ 1. Khả năng sinh kháng sinh Đây là cơ chế hiệu quả nhất Bacillus subtilis sinh Iturin: một peptide có tính kháng nấm Gramicidin S Cơ chế này thường phối hợp một số cơ chế khác theo “công nghệ rào cản” (hurdle technology) Kiểm soát sinh học bằng Pseudomonas cepacia P.d: Penecillium digtatum gây mốc xanh lam P.i: Penecillium italicum gây mốc xanh lục Theo nghiên cứu của Dr. Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV (www.ars.usda.com) Kiểm soát sinh học bằng Pseudomonas cepacia Xử lý bằng pyrrolnitrin sinh tổng hợp từ P. cepacia với nồng độ khác nhau VSV gây bệnh Penecillium digitatum Theo nghiên cứu của Dr. Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV (www.ars.usda.com) Kiểm soát sinh học bằng Pseudomonas cepacia Kiểm soát mốc xanh lục gây ra do Penecillium expansum bằng pyrrolnitrin sinh tổng hợp từ P. cepacia Theo nghiên cứu của Dr. Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV (www.ars.usda.com) 2. Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian Cơ chế này thường gặp ở nấm men Nấm men thường cạnh tranh với VSV gây hại, ức chế sinh trưởng, nhưng không tiêu diệt chúng Khả năng ức chế hiệu quả hơn nếu nguồn dinh dưỡng khan hiếm Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian Nấm men có khả năng tổng hợp màng polysaccharide  tăng khả năng bám dính lên bề mặt của rau quả VSV đối kháng sinh trưởng rất nhanh và xâm chiếm vị trí vết dập ở rau quả Sự sinh trưởng và nhu cầu dinh dưỡng của vsv đối kháng làm cho một số nấm mốc không có đủ dinh dưỡng để phát triển Sự tạo thành Biofilm bởi Candida oleophila Wisniewski et al. (2007). Post harvest biocontrol: New concepts and applications 3. Sự ký sinh Pichia guilliermondii có khả năng bám dính trên sợi nấm Botrytis cinerea, tiêu diệt nấm bằng một số enzym phân hủy màng tế bào Aspergilus pullulans ở vết dập của táo có khả năng sinh tổng hợp enzym exochitinase và β-1,3-glucanase Một số nấm men khác có khả năng giảm sự bám dính của bào tử và ngăn cản bào tử nảy mầm Sự bám dính của Pichia guillemondii lên sợi nấm Botrytis cinerea Wisniewski et al. (2007). Post harvest biocontrol: New concepts and applications 4. Kích thích khả năng chống chịu Một số vsv có khả năng tương tác với vật chủ, thúc đẩy quá trình lành sẹo Một số nấm men biểu hiện tính đối kháng khi được đưa vào trước khi cấy vsv gây hại II.4. Các bước phát triển một sản phẩm kiểm soát sinh học Xác định sự nhiễm tạp Thu thập các tác nhân KSSH Xác định đặc tính và phân loại Đánh giá trong PTN Đánh giá áp dụng thử nghiệm Khả năng tương thích Nhân giống hàng loạt Phối trộn định dạng sản phẩm Lưu kho và phân phối Áp dụng trên diện rộng Đánh giá sự chấp nhận sản phẩm Sản phẩm cuối cùng Cải thiện chủng Tương tác với vùng rễ Nghiên cứu Phát triển Mở rộng Một số chế phẩm kiểm soát sinh học đã thương mại hóa Một số bước tiếp cận nhằm ứng dụng sản phẩm KSSH trong bảo quản rau quả Áp dụng sau thu hoạch Thông thường VSV đối kháng được phân lập ngay từ bề mặt rau quả Số lượng tự nhiên của VSV đối kháng thường không đủ để biểu hiện hoạt tính mạnh Đưa vào một lượng lớn VSV đối kháng đối với sản phẩm sau khi thu hoạch Tăng sinh đối với VSV đối kháng đã có sẵn trên sản phẩm Áp dụng sau thu hoạch Ưu điểm Đơn giản, dễ thực hiện ngay sau thu hoạch bằng cách phun, ngâm, tưới Nếu đúng cách, đúng thời điểm (trước khi VSV gây bệnh xâm nhập) sẽ có hiệu quả cao Ít tốn kém hơn việc phun thuốc cả diện tích lớn, có thể dùng VSV nồng độ cao Candida oleophila, Cryptococcus albidus, Pichia membranefaciens Áp dụng sau thu hoạch Giới hạn Cần đưa vào ngay lập tức sau thu hoạch trước khi VSV gây hại xâm nhập Một số vết thương ở vỏ quả họ cam chanh có chứa tinh dầu, khó khăn hơn cho VSV đối kháng bám vào Áp dụng sau thu hoạch Giới hạn Hiệu quả của VSV đối kháng tương đối hẹp Phụ thuộc loại rau quả Phụ thuộc vào hoạt tính đặc hiệu đối với VSV gây bệnh Khả năng bám dính của VSV đối kháng lên bề mặt là khác nhau đối với những sản phẩm sau thu hoạch khác nhau Áp dụng trước khi thu hoạch Phun định kỳ vào cây trước khi thu hoạch Giới hạn Có thể ảnh hưởng môi trường VSV đối kháng bị tiếp xúc và biểu hiện hoạt tính trong điều kiện khắc nghiệt (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, VSV khác, các thuốc diệt sâu bọ,…) Biện pháp: Lựa chọn VSV có khả năng thích nghi tốt Cho VSV làm quen, thích nghi với một số stress trước khi ứng dụng Dùng những chủng biến đổi Các loại hạt lạc, đậu đỗ: Ứng dụng nấm mốc Aspergillus flavus không sinh độc tố aphlatoxin để cạnh tranh với những chủng hoang dã sinh độc tố Thường ít ứng dụng đối với rau quả tươi II. Ứng dụng vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm II.1. Kiểm soát sinh học (biocontrol) II.2. Tác nhân kiểm soát sinh họcVi sinh vật đối kháng II.3. Cơ chế hoạt động của các tác nhân kiểm soát sinh học II.4. Các bước phát triển một sản phẩm kiểm soát sinh học II.5. Vi khuẩn Lactic trong bảo quản thực phẩm II.5. Vi khuẩn Lactic trong bảo quản thực phẩm Vi khuẩn lactic làm hư hỏng thực phẩm hay bảo quản thực phẩm? Giới thiệu chung Vi khuẩn lactic: lactic acid bacteria, vi khuẩn làm chua sữa 1873: J. Lister thu nhận Bacterium lactis (nay có thể là Lactococcus lactis) 1919: Orla-Jensen phân loại vi khuẩn lactic dựa theo đặc điểm Hình thái (cầu, que, …) Kiểu lên men glucoza: đồng hình, dị hình Nhiệt độ sinh trưởng Khả năng sử dụng các loại đường II.5.1. Đặc điểm chung của VK lactic Vi khuẩn G+ Không sinh bào tử (còn tranh cãi, Sporolactobacillus) Catalase – Yếm khí tùy tiện Chịu được axit Lên men đường tạo thành chủ yếu là axit lactic Vi khuẩn lactic thường sống ở nơi có môi trường dinh dưỡng dồi dào (thực phẩm), có một số sống trong cơ thể động vật Các đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic II.5.2. Cơ chế tác dụng của vi khuẩn lactic trong bảo quản thực phẩm Cạnh tranh không gian Cạnh tranh dinh dưỡng Sinh ra một số chất kháng vi sinh vật Cạnh tranh không gian Nhiều loài thuộc giống Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự bám dính của vi sinh vật gây bệnh trên bề mặt Bản chất chất này chưa được nghiên cứu nhiều Chất hoạt động bề mặt (surlactin), glycoprotein, glycolipid Các chất kháng VSV từ vi khuẩn lactic Axit hữu cơ H2O2 CO2 Diacetyl Các chất phân tử lượng thấp Bacteriocin Yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng của axit hữu cơ Trong thực tế thường ứng dụng trong thực phẩm_ hệ phức tạp các chất hữu cơ Các chất trong thực phẩm ảnh hưởng đến khả năng kháng VSV của vi khuẩn lactic Cao nấm men làm giảm khả năng kháng khuẩn của vk lactic và axetic Sữa và máu tăng cường khả năng kháng khuẩn của axit axetic H2O2 Vi khuẩn lactic khi có O2 chuyển thành H2O2 dưới tác dụng của oxidases, NADH oxidases có chứa flavoprotein và superoxide dismutase Một lý do nào đó lactic không sinh catalase để phân hủy H2O2 hoặc hệ phân hủy yếu hơn hệ sinh ra Thực tế theo một số nhà nghiên cứu H2O2 không tích tụ lại nhiều in vivo, thường bị phân hủy nhanh chóng Cơ chế tác dụng của H2O2 Tính kháng khuẩn dựa vào khả năng oxy hóa các đại phân tử của H2O2 khi bị phân hủy Protein hoặc lipid ở phía vỏ tế bào bị ôxy hóa Một số phản ứng xảy ra đối với vi khuẩn lactic để tạo H2O2 lấy hết oxy, tạo môi trường yếm khí, không có lợi cho một số vsv Vi khuẩn lactic sinh H2O2 có mặt ở đường tiết niệu, đóng vai trò quan trọng trong việc tránh viêm nhiễm Trong tự nhiên, tác dụng kháng khuẩn của H2O2 được tăng lên do lactoperoxidase và thiocyanate (SCN-). SCN- + H2O2 OSCN- + H2O lactoperoxidase Cấu trúc màng tế bào vsv bị thay đổi khi tiếp xúc với OSCN- Hiệu quả chủ yếu do chu trình glycolysis bị chặn do các enzym bị ảnh hưởng Tác dụng nhanh đối với VK G-, lâu hơn đối với G+ H2O2 CO2 Tạo môi trường yếm khí, ức chế một số vi khuẩn Quá trình decarboxyl hóa bị ức chế Tích tụ CO2 ở màng lipid của tế bào làm vô hoạt sự thẩm thấu của các chât qua thành tế bào Vi khuẩn G- nhạy cảm hơn vi khuẩn G+ Tác dụng của Diacetyl Diacetyl kháng vi sinh vật tốt hơn khi pH 100 mg/l 2-Pyrrolidone-5-carboxylic Acid Tìm thấy ở Lactobacillus casei ssp. casei, Lb. casei ssp.pseudoplantarum và Streptococcus bovis Bền nhiệt (121oC, 20 phút), giảm hoạt tính khi pH tăng trên 2,5 Bacteriocin Hợp chất sinh tổng hợp tại ribosome Bản chất Protein Ức chế các vi khuẩn khác Có mặt ở hầu hết các vi khuẩn Phổ ức chế tương đối hẹp: Nhược điểm Ưu điểm: Tiêu diệt có chọn lọc vi sinh vật đặc hiệu mà không ảnh hưởng đến hệ sinh vật có ích Bacteriocin và kháng sinh Tác dụng của Pediocin AcH lên Listeria monocytogenes Ennahar et al. (1996). Production of pediocin AcH by Lactobacillus plantarum WHE 92 isolated from cheese. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12) 4381-4387 Sau 30 phút xử lý với Pediocin Sau 5 giờ xử lý với Pediocin L. monocytogenes chưa xử lý