Bài giảng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

và lịch sử phát triển 1.2.1. Tầm quan trọng của CN nuơi cấy mơ tế bào thực vật Định nghĩa: Nuơi cấy mơ tế bào Thực vật hay cịn gọi là nuơi cấy thực vật in vitro là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nguyên liệu thực vật hồn tồn sạch các vi sinh vật, được nuơi trên mơi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vơ trùng. a. Về mặt lý luận sinh học cơ bản + Giúp tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. + Giúp so sánh đặc tính của cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể  qui luật về mối tương quan giữa các bộ phận trong cây. + Giúp phân biệt từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể tạo thuận lợi cho cơng tác nghiên cứu về qui luật sinh trưởng, phát triển, quan hệ giữa chúng với mơi trường… và chủ động điều khiển sự phát triển cây trồng theo ý muốn. + Biết được nguyên nhân gây bệnh và đưa ra biện pháp phịng bệnh cho cây trồng b. Về mặt thực tiễn sản xuất Kỹ thuật nhân giống in vitro cĩ những ưu việt mà các phương pháp khác khơng cĩ được: + sử dụng các mơ nuơi cấy nhỏ; + cĩ thể nhân giống cây trồng ở quy mơ cơng nghiệp; + cĩ hệ số nhân giống rất cao và các cá thể hồn tồn đồng nhất về mặt di truyền. Ứng dụng vào thực tiễn sản xuất Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng vào những mục đích sau: + Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho cơng tác giống. + Nhân nhanh các lồi hoa, cây cảnh khĩ trồng bằng hạt + Duy trì và nhân nhanh các dịng bố mẹ và các dịng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác + Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus + Bảo quản tập đồn gen 1.2.2. Lịch sử phát triển cơng nghệ nuơi cấy mơ và tế bào thực vật Năm 1838, học thuyết tế bào (cell theory) do hai nhà khoa học Schleiden và T. Schwann đã ra đời: “Tất cả các tế bào thực vật và động vật đều được tạo nên từ nhiều nhĩm tế bào và tế bào là đơn vị căn bản của sinh giới”. Giai đoạn 1: Gottlieb Haberlandt (1902), đưa ra giả thuyết về tính tồn năng của tế bào. Giai đọan 2: năm 1934, White nuơi cấy thành cơng cây Cà chua (Lycopersicon esculentum) Giai đoạn 3: Skoog và Miller (1957) thành cơng trong nuơi cấy mơ sẹo cây thuốc lá Giai đoạn hiện nay, ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào sản xuất các hợp chất thứ cấp, nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Ở Việt Nam, nuơi cấy mơ đã và đang trở thành một trong những lãnh vực được quan tâm rất nhiều trong ngành trồng trọt. Chương 2. NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH IN VITRO – KHÁI NIỆM CƠ BẢN VÀ QUY TRÌNH THỰC HIỆN 2.1. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN THƯỜNG DÙNG TRONG NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH IN VITRO 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH IN VITRO 2.3. CÁC GIAI ĐOẠN TRONG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH IN VITRO 2.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH IN VITRO 2.5. CÁC HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG NUƠI CẤY MƠ 2.1. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN THƯỜNG DÙNG TRONG NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH IN VITRO 2.1.1. Các thuật ngữ chuyên ngành. 2.1.2. Phịng thí nghiệm 2.1.3. Mơi trường nuơi cấy 2.1.1. Các thuật ngữ chuyên ngành - Nuơi cấy mơ - Vi nhân giống - Tạo phơi vơ tính - Mẫu cấy (explant) - Mơ sẹo (Callus) - Sinh trưởng bất định (adventitous) - Dịng đơn tính (Clone) - Nuơi cấy (culture) - Vơ trùng (sterile) - Mơi trường (medium, media) 2.1.2. Phịng thí nghiệm a. Cách bố trí PTN nuơi cấy mơ Thực vật b. Các thiết bị chủ yếu của phịng thí nghiệm nuơi cấy mơ thực vật Sơ đồ một phịng thí nghiệm nuơi cấy mơ hồn chỉnh: 1: Phịng rửa và sản xuất nước cất; 2: phịng sấy, hấp, kho thủy tinh sạch; 3: phịng chuẩn bị mơi trường; 4: phịng chuẩn bị mẫu; 5: phịng cấy vơ trùng; 6: phịng ảnh; 7: phịng kính hiển vi; 8,9: phịng sáng; 10: phịng sinh hĩa. b. Các thiết bị chủ yếu của phịng thí nghiệm nuơi cấy mơ thực vật b. Các thiết bị chủ yếu của phịng thí nghiệm nuơi cấy mơ thực vật 2.1.3. Mơi trường nuơi cấy - Các nguyên tố đa lượng - Các nguyên tố vi lượng - Các phụ gia hữu cơ - Các chất kích thích sinh trưởng thực vật (phytohormone): auxin, cytokinin, acid abscisic (ABA), ethylene, gibberellin (GA)… Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao  tạo rễ, Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp  thân, Nếu tỷ lệ này gần một đơn vị  tạo mơ sẹo. - Nguồn carbon: Glucose, sucrose, fructose... - Các tác nhân làm rắn (tạo gel) mơi trường: agar, alginate, phytagel, methacel và gel-rite... 2.2. Các phương pháp nhân giống vơ tính in vitro 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH IN VITRO 2.2.1. Sinh trưởng khơng phân hĩa (undifferentiated growth) a. Nuơi cấy mơ sẹo - callus b. Nuơi cấy dịch huyền phù tế bào c. Nuơi cấy tế bào trần (protoplast) 2.2.2. Sinh trưởng cĩ phân hĩa (differentiated growth) a. Nuơi cấy rễ tơ (hairy root) b. Cơng nghệ nuơi cấy phơi vơ tính 2.2.3. Nuơi cấy mơ phân sinh đỉnh (meristem) – phương pháp tạo cây sạch virus Nuơi cấy mơ sẹo – callus Khi các phần bị cắt hay bị tổn thương của thân, rễ, lá… được đặt vào trong mơi trường thích hợp sau một thời gian tại đĩ sẽ xuất hiện những phần mơ lồi ra, cĩ màu trắng nhạt hoặc vàng nhạt, mơ này gọi là mơ sẹo hay callus Callus (A) và tái sinh chồi từ callus (B) của chi Lilium Quy trình nhân giống cây trồng từ callus Kết luận: Sự tái sinh mơ từ nuơi cấy callus là sự cảm ứng các tế bào phân chia vơ tổ chức bằng các chất điều hịa sinh trưởng thực vật (plant growth regulators) trong mơi trường dinh dưỡng rắn. b. Nuơi cấy mơ dịch huyền phù tế bào Huyền phù tế bào là một mơi trường lỏng được lắc liên tục (đơi khi là dịch thể tĩnh), trong đĩ cĩ sự hiện diện của những tế bào soma cơ lập hoặc những cụm nhỏ tế bào cĩ khả năng phát sinh phơi, tái sinh thành một cây hồn chỉnh. Kết luận: Nuơi cấy dịch huyền phù là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, tới callus và cuối cùng tới dịch huyền phù. Sau vài tháng nuơi cấy (tùy theo nguồn nguyên liệu) trong mơi trường lỏng, người ta sẽ nhận được một huyền phù tế bào ổn định gồm những tế bào cơ lập hay những nhĩm nhỏ tế bào cĩ thể sử dụng cho các thí nghiệm về sự tái sinh thực vật hay các kỹ thuật ở mức tế bào. ? Theo các bạn, chức năng chính của thành tế bào là gì? c. Nuơi cấy tế bào trần (protoplast) Các phương pháp tách thành tế bào: Bằng phương pháp cơ học hoặc enzyme 1. Cơ học: mẫu được nghiền nhỏ rồi đưa vào dung dịch gây co nguyên sinh, làm cho phần nguyên sinh chất co lại. Sự phản co nguyên sinh tiếp theo sẽ làm giãn nở và đẩy phần nguyên sinh chất ra khỏi tế bào qua những khe hở  khá phức tạp, số lượng tế bào trần tồn tại độc lập rất ít 2. Enzyme: vơ trùng bề mặt mẫu lá, ngâm trong dung dịch thẩm thấu thích hợp, loại bỏ biểu bì mặt dưới (hoặc cắt mẫu lá thành lát mỏng), sau đĩ xử lý với hỗn hợp enzyme (cellulase, hemicellulase, pectinase) cĩ tỉ lệ thay đổi tùy theo nguồn mẫu  thu được lượng lớn tế bào trần Cuscuta reflexa protoplast Spinach protoplast Quy trình tạo protoplast Tế bào ban đầu Xử lý trong dung dịch Hình thành protoplast Quy trình nuơi cấy tế bào trần (protoplast) 1. Tách tế bào trần: chú ý chọn nguyên liệu, phương pháp tách, xác định tỉ lệ sống sĩt, loại bỏ xác thành tế bào cịn sĩt lại 2. Nuơi cấy tế bào trần: chú ý mật độ tế bào, mơi trường nuơi cấy, điều kiện nuơi cấy Dung hợp tế bào trần: là sự kết hợp của hai hay nhiều tế bào trần tạo ra một khối tế bào trần, trong đĩ nhân của chúng cĩ thể kết hợp hoặc tồn tại riêng rẽ.  tạo ra các khối callus hoặc phơi soma, ứng dụng trong tạo con lai tế bào soma, cĩ thể xáy ra theo 2 con đường: tự phát hay cảm ứng Tĩm lại: Protoplast là những tế bào bị loại bỏ thành tế bào, cĩ thể được tạo ra bằng phương pháp cơ học hoặc enzyme. Các protoplast được phân lập cĩ thể thường được sử dụng để: biến đổi thơng tin di truyền của tế bào thực vật, tạo ra cây lai vơ tính thơng qua dung hợp protoplast (protoplast fusion), nghiên cứu sự xâm nhiễm của virus ở thực vật… 2.2.2. Sinh trưởng cĩ phân hĩa (differentiated growth) a. Nuơi cấy rễ tơ (hairy root) b. Nuơi cấy phơi (embryogenesis) Nuơi cấy rễ tơ và sự phát triển cây hồn chỉnh từ nuơi cấy rễ tơ a. Nuơi cấy rễ tơ (hairy root) a. Nuơi cấy rễ tơ (hairy root) Kết luận: Nuơi cấy rễ tơ cĩ thể bắt đầu từ việc tách rễ tơ của nhiều lồi thực vật  mơi trường nuơi cấy rễ sinh trưởng nhanh  sản xuất các chất thứ cấp. b. Nuơi cấy phơi (embryogenesis) Khái niệm: Ở thực vật cĩ hoa, phơi là những thực thể cĩ hình thái rõ rệt và đảm nhiệm chức năng như giai đoạn trung gian trong thời kỳ chuyển tiếp giữa pha giao tử thể và bào tử thể, cĩ 2 dạng: phơi hữu tính và phơi vơ tính. ? Theo các bạn, phơi thực vật phát triển trải qua mấy giai đoạn? Các biến đổi hình thái phơi cây hai lá mầm Các giai đoạn hình thành phơi Kết luận Sự hình thành phơi trải qua các giai đọan: 1. Sự biệt hĩa tế bào cĩ khả năng sinh phơi thành tế bào phơi, 2. Sự phát triển của những tế bào phơi mới hình thành thơng qua các giai đoạn sau: phơi hình cầu, phơi hình tim và phơi cá đuối (thủy lơi, gậy) và phơi trưởng thành. Phát sinh phơi vơ tính cĩ thể được khởi đầu theo hai con đường: phát sinh phơi trực tiếp (preembryogenic determined cell) hoặc phát sinh phơi gián tiếp. Sự phát triển phơi Arabidopsis Sự phát triển phơi hoa lyly Nuơi cấy phơi hữu tính Phơi hữu tính: cĩ sự kết hợp giữa các loại giao tử khác nhau - Kỹ thuật tách phơi: vật liệu thực vật  vơ trùng hạt trước khi tách phơi (hạn chế sự tổn thương của dây treo phơi vì đây là thành phần cĩ vai trị rất quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát riển của phơi non). - Thành phần mơi trường nuơi cấy: thay đổi tùy theo lồi và mục đích nuơi cấy. Nuơi cấy phơi vơ tính Phơi vơ tính cĩ thể xuất hiện trong điều kiện in vitro từ 3 nguồn sau (Kohlenbach, 1978): - Các tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành - Các mơ tái sinh khơng phải là hợp tử - Các lá mầm và trụ dưới lá mầm của phơi và cây con, khơng cĩ bất cứ sự phát triển nào của mơ sẹo Quá trình phát triển phơi cần chú ý 2 giai đoạn: - Cảm ứng biệt hĩa tế bào của những tế bào tiền phơi Biểu hiện của các tế bào tiền phơi Các giai đoạn phát triển khác nhau của phơi soma từ nuơi cấy lá hoa lisianthus Nuơi cấy phơi vơ tính hoa African violet Tiềm năng phát sinh phơi sinh dưỡng của mẫu cấy Ứng dụng của nuơi cấy phơi - Thu nhận thể đơn bội: loại bỏ trực tiếp NST sau khi lai xa để thu nhận thể đơn bội - Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt - Nhân giống các cây hiếm - Thụ phấn trong ống nghiệm - Hạt nhân tạo ? Theo các bạn, thế nào là mơ phân sinh đỉnh? ? Vị trí của MPS sinh trên cơ thể thực vật? Mơ phân sinh (meristematic tissue) - Định nghĩa Mơ phân sinh là những tế bào non chưa phân hĩa, cĩ khả năng phân chia rất nhanh và liên tục cho tới cuối đời sống của cây để tạo thành các mơ khác. Cấu trúc mơ phân sinh (meristem) Mơ phân sinh đỉnh Lá Sơ khởi lá Chồi thứ cấp - Đặc điểm chung của MPS Là những tế bào non, chưa phân hĩa Hình dạng khơng giống nhau ở các vị trí khác nhau: ở phần ngọn (thân, rễ) cĩ đường kính gần đồng đều, cịn ở tầng phát sinh thì hẹp, dài, hình thoi. Kích thước tế bào nhỏ bé, chất tế bào đậm đặc, nhân to, các khơng bào nhỏ li ti. Tế bào xếp sít nhau khơng để hở các khoảng gian bào. Vách tế bào mỏng, nước chiếm tới 92,5%, ngồi ra cịn chứa chủ yếu là pectin và hemicellulose, rất ít cellulose. Mầm lá Quá trình sinh trưởng của đỉnh sinh trưởng mơ phân sinh (meristem) ? Theo các bạn, tại sao MPS đỉnh (meristem) là nơi sạch virus và cĩ thể dùng tạo cây sạch bệnh? Meristem khơng cĩ virus cĩ thể do các lý do sau (Mathews, 1970, Wang et Hu, 1980): + Virus vận chuyển trong cây nhờ cĩ hệ thống mơ dẫn, hệ thống này khơng cĩ ở mơ phân sinh đỉnh. + Trong quá trình phân chia, các tế bào mơ phân sinh đỉnh khơng cho phép sao chép các thơng tin di truyền của virus + Hệ thống vơ hiệu hĩa virus ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây + Nồng độ auxin cao ở đỉnh sinh trưởng cĩ thể ngăn cản quá trình sao chép virus. 2.2.3. Nuơi cấy mơ phân sinh đỉnh (meristem) – phương pháp tạo cây sạch virus a. Cơ sở khoa học Virus cĩ thể lây truyền qua các thế hệ, nhân bản nhanh và cĩ thể dẫn đến sự giảm năng suất, phẩm chất cây trồng  vật liệu khởi đầu sạch virus Cĩ hai phương pháp chính để tạo cây sạch virus: 1. Dùng phương pháp chẩn đốn bệnh virus để thanh lọc các mẫu nhiệm bệnh trước khi đưa vào nuơi cấy, sử dụng phương pháp nhân nhanh in vitro để nhân nhanh mẫu sạch 2. Làm sạch virus ở mẫu đã nhiễm bệnh, tạo mẫu sạch và tiếp tục nhân nhanh in vitro để nhân nhanh mẫu sạch b. Kỹ thuật làm sạch virus qua nuơi cấy meristem Nguyên lý của phương pháp Virus tồn tại ở mọi tế bào sống. Tuy nhiên, mơ phân sinh là những tế bào gần như khơng cĩ. Sự loại virus khỏi mẫu phụ thuộc rất nhiều vào sự cĩ mặt của một hay nhiều loại virus xâm nhiễm. Mức độ thành cơng phụ thuộc vào loại virus cần loại bỏ và các đặc tính của cây mẫu. Nuơi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) Mơ phân sinh đỉnh được nuơi cấy trên mơi trường dinh dưỡng và phát triển thành cây con in vitro Các kỹ thuật làm sạch virus in vitro 1. Nuơi cấy meristem: tách meristem  cây nguyên vẹn  kiểm tra độ sạch virus ở cây tái sinh  thu nhận được cây sạch bệnh 2. Nuơi cấy meristem kết hợp xử lí nhiệt độ cao: xử lí nhiệt từ 36 - 37 0C trước hoặc sau khi tách meristem (vì ở nhiệt độ này, thường các ARN thơng tin của virus sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ cĩ độ sạch virus cao). 3. Nuơi cấy meristem kết hợp với xử lí hĩa chất: tách meristem nuơi trong mơi trường cĩ bổ sung vào mơi trường nuơi cấy các chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh như 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng khả năng kháng của tế bào, mơ thực vật và ức chết sự nhân bản của virus. 4. Vi ghép: là kỹ thuật ghép các mơ phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng bệnh trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch virus. Tạo cây sạch bệnh thơng qua nuơi cấy meristem c. Nhân nhanh và duy trì cây sạch bệnh 1. Chẩn đốn bằng mắt (bằng triệu chứng bệnh) 2. Chẩn đốn bằng cây chỉ thị 3. Phương pháp huyết thanh 4. Chẩn đốn bằng kính hiển vi điện tử 5. Chẩn đốn bằng test ELISA (Enzyme Linked Immune Sorbent Assay) 6. Chẩn đốn bằng kỹ thuật phân tích ADN (PCR) 5. Chẩn đốn bằng test ELISA (Enzyme Linked Immune Sorbent Assay) Nguyên lý: xảy ra phản ứng enzyme – kháng nguyên – kháng thể (enzyme xúc tác- enzyme linked). Ví dụ: phản ứng phân giải 4nitrophenolphosphate bởi photphataza. Khi tách photphat, -nitrophenol sẽ cĩ màu vàng. Phản ứng test được tiến hành khi gắn trên các mặt bản thử plastid, nên cĩ tên goi là immunosorbent  trên bản thử lỗ nào cĩ màu vàng, nơi ấy cĩ mặt phức kháng nguyên – kháng thể - enzyme, tức cĩ virus.  cĩ thể chẩn đốn rất chính xác cả về mặt định tính lẫn định lượng. Trực tiếp Sandwich Gián tiếp Ag: kháng nguyên-antigen. Primary antibody: kháng thể sơ cấp. Secondary antibody: kháng thể thứ cấp. E: enzyme Substrate: cơ chất 6. Chẩn đốn bằng kỹ thuật phân tích ADN (PCR) Nguyên lý: xác định trực tiếp sự cĩ mặt của phần lõi acid nucleic của virus thơng qua phản ứng PCR: cặp mồi (primer) là các đoạn nucleotide cĩ trình bổ sung với 2 đầu (phía 3’) của 2 sợi ADN của virus trên máy PCR khoảng 3 giờ cĩ thể lấy mẫu và đánh giá kết quả  quá trình nhân ADN khơng xảy ra, mẫu khơng nhiễm virus và ngược lại.  cực nhạy và chính xác để chẩn đốn bệnh virus. Mơ phân sinh đỉnh được nuơi cấy trên mơi trường dinh dưỡng và phát triển thành cây con in vitro ? Khi sử dụng MPS thì nguy cơ nhiễm cĩ xảy ra hay khơng? Nếu cĩ thì làm thế nào để hạn chế điều đĩ? Các biện pháp phịng ngừa: Cây nên đựơc trồng trong nhà kính hay ở những nơi khơng cĩ những sinh vật trung gian truyền bệnh virus, Liên tục xử lí các sinh vật truyền bệnh trung gian, Phải tuyệt đối giữ vệ sinh trong quá trình chăm sĩc cây. Tiến hành chọn lọc liên tục bằng cách quan sát bên ngồi… 2.3. CÁC GIAI ĐOẠN TRONG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH IN VITRO Quá trình nhân giống vơ tính in vitro thường được chia thành các giai đoạn sau: 1. Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ, 2. Khử trùng mẫu cấy - tạo thể nhân giống in vitro, 3. Nhân nhanh in vitro, 4. Tạo cây hồn chỉnh in vitro, 5. Thích ứng cây in vitro ngồi điều kiện tự nhiên (ex vitro) Hoa trà Hoa hồng Địa lan Hoa lyly Măng cụt Lan hồ điệp 2.3.1. Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ - Đúng cây cần nhân giống. - Sạch bệnh - Thu thập mẫu tốt nhất vào thời điểm tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ. Các giai đoạn trong nuơi cấy mơ chuối in vitro Quy trình nhân giống cây Salvia miltiorrhiza Quy trình nhân giống hoa Đuơi chồn đỏ 2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống vơ tính in vitro 2.4.1. Sự lựa chọn mẫu cấy 2.4.2. Mơi trường nuơi cấy 2.4.3. Điều kiện nuơi cấy Các nguyên tố đa lượng Các nguyên tố vi lượng Các phụ gia hữu cơ Các chất kích thích hay ức chế sinh trưởng thực vật (phytohormone); Nguồn carbon Các tác nhân làm rắn (tạo gel) mơi trường ? Theo các bạn thế nào là phytohormone và cĩ mấy loại, tác dụng chủ yếu của chúng là gì? Hormone thực vật (phytohormone): ĐN: là chất hữu cơ cĩ mặt trong cây với hàm lượng rất nhỏ, được vận chuyển đến các bộ phận của cây để điều tiết và đảm bảo sự hài hồ các hoạt động sinh trưởng. Phân loại: Gồm 2 nhĩm: Nhĩm chất kích thích sinh trưởng: Auxin, gibberellin Cytokinin Nhĩm các chất ức chế sinh trưởng: Axit abscisic Ethylene Các chất kích thích sinh trưởng thực vật (phytohormone) Nhĩm auxin (IAA, 2,4-D, NAA, IBA,…), Nhĩm cytokinin (zeatin, 2i-P, BA, kinetin, TDZ…) NAA IAA IBA Nhĩm auxin Vai trị của nhĩm auxin: Thúc đẩy sự tăng trưởng và giãn nở của tế bào, Tăng cường quá trình sinh tổng hợp và trao đổi các chất. Kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phơi vơ tính… Cơ chế hoạt động của auxin trong cây trồng Hướng vận chuyển của auxin Ngọn Gốc Sự phân bố và cơ chế vận chuyển auxin trong cây (www.nsf.gov) Kết luận Auxin là nhĩm chất điều hồ sinh trưởng của thực vật thường gặp trong thiên nhiên, cĩ ở mơ phân sinh chồi, lá mầm và rễ. Auxin vận chuyển hướng cực: từ đỉnh chồi ngọn tới cơ quan khác. Tác dụng chủ yếu là kích thích sự hình thành rễ, sinh trưởng giãn của tế bào, gây ra tính hướng động, ưu thế ngọn, sinh trưởng quả và tạo quả khơng hạt… Kinetin TDZ BA Nhĩm cytokinin Vai trị của nhĩm cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng chồi in vitro, Ức chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mơ sẹo(Auxin kích thích tạo rễ) Tăng sự phát sinh phơi vơ tính Cơ chế hoạt động của cytokinin trong cây trồng Sơ đồ phức hệ nhận tín hiệu cytokinin trong cây trồng Biệt hĩa hình thành chồi, ngăn cản sự già hĩa tế bào Ảnh hưởng của cytokinin lên sự phát triển của cây Thuốc lá (Nicoticum sp.) Kết luận Cytokinin cĩ mặt ở tất cả các lồi cây trồng, hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ Cytokinin vận chuyển khơng hướng cực, cĩ thể hướng ngọn hoặc hướng gốc Tác dụng chủ yếu là kích thích sự phân chia tế bào, sự phân hĩa các cơ quan (nhất là sự phân hĩa chồi), sự nảy mầm, quá trình trao đổi chất, ngăn chặn sự hĩa già… Ảnh hưởng của IAA (Aux) và kinetin lên sự phát sinh của mẫu cấy Kinetin (mg/l) IAA (mg/l) Gibberellin (GA): Ảnh hưởng của GA lên sự phát triển của cây Arabidopsis Cĩ GA Khơng GA GA gây ra sự tăng dài nhanh chĩng của thân bằng cách kích thích sự phân cắt tế bào và sự tăng dài của tế bào; kích thích hay ức chế sự ra hoa, kết trái của một số lồi Cơ chế tác động của GA lên sự nảy mầm của hạt bắp Bao lá mầm Tán lá đầu tiên ? Theo các bạn, auxin và GA cùng cĩ tác dụng kích thích tăng trưởng và kéo dài tế bào, vậy vị trí, cơ chế tác động của chúng cĩ giống nhau khơng? Kết luận Gibberellin được vận chuyển qua mơ gỗ và mơ libe, trong khi auxin được di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác một chiều.  Gibberellin cĩ ảnh hưởng trên tồn bộ của cây chứ khơng phải trên từng vùng như ở auxin. Gibberellin được tạo ra trong những mơ cịn non của thân và trong hạt đang phát triển cịn auxin ở các mơ phân sinh chồi, lá mầm và rễ. Các chất ức chế sinh trưởng thực vật (phytohormone) Acid adscisic (ABA) Ethylene Kết luận Acid abscisic: ức chế tăng trưởng, kiểm sốt sự rụng lá, cảm ứng trạng thái ngủ của chồi và hạt vào mùa thu để đợi đến mùa xuân; giúp đĩng các khí khẩu khi cây chịu khơ hạn. Acid abscisic được tạo ra từ lá trưởng thành và được vận chuyển qua mơ libe.  Cĩ ABA Khơng cĩ ABA Ảnh hưởng của ABA lên sinh trưởng cây Arabidopsis Kết luận Ethylene: gia tăng sự rụng lá và trái, sự lão hĩa; phá vỡ sự ngủ của chồi và hạt của một số lồi; kích thích trổ hoa ở một số lồi thực vật khác như Khĩm.   Ethylene được tổng hợp trong các mơ đang xảy ra sự lão hĩa hay sắp chín như ở trái. Ảnh hưởng của ethylene lên sinh trưởng cây Euphorbia pulcherrima KẾT LUẬN Sự phát sinh của mẫu cấy in vitro phụ thuộc vào tỷ lệ auxin/cytokinin: - Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao  rễ, - Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp  thân, - Nếu tỷ lệ này gần một đơn vị  mơ sẹo. Ngồi hai chất căn bản trên cịn cĩ các phytohormone như: acid abscisic (ABA), ethylene, gibberellin (GA),… 2.5. CÁC HẠN CHẾ CỦA NHÂN GiỐNG CÂY TRỒNG BẰNG NUƠI CẤY MƠ 2.5.1. Tính bất định về mặt di truyền (genetic instability) 2.5.2. Sự nhiễm mẫu 2.5.3. Việc sản sinh các chất độc từ mơ nuơi cây (toxic compounds phenol) 2.5.3. Sự hĩa thủy tinh thể (vitrification) ? So sánh tần số biến dị sinh ra trong các phương pháp nhân giống vơ tính in vitro ? 2.5.1. Tính bất định về mặt di truyền (genetic instability) Tần số xuất hiện biến dị phụ thuộc vào các yếu tố: Kiểu di truyền (Genotype) Số lần cấy chuyền (Subculture) Loại mơ (Tissue) 2.5.2. Sự nhiễm mẫu Nhiễm mẫu từ mơi trường (explant contamination), từ mẫu cấy 2.5.2. Sản sinh các chất độc từ mẫu cấy Do mẫu chứa nhiều chất tanin hay hydroxyphenol… (toxic compounds phenol). Ví dụ: nuơi cấy Lan thường xảy ra hiện tượng phenol hĩa do các mẫu cấy tiết ra các chất phenol eucomic acid Hiện tượng phenol hĩa (toxic compounds phenol) 2.5.3. Sự hĩa thủy tinh thể (vitrification) Hiện tượng thủy tinh thể (vitrification, hyperhydration): là hiện tượng thân lá cây mọng nước, trong suốt, cây rất khĩ sống khi ra ngồi mơi trường do mất nước rất mạnh Hiện tượng thủy tinh thể (vitrification) ? Theo các bạn, làm cách nào để hạn chế các vấn đề trên? Biện pháp khắc phục Tính bất định về mặt di truyền (genetic instability) - Hạn chế số lần cấy chuyền - Thay nguồn mẫu mới Ví dụ: khi nhân giống dứa in vitro, nếu cấy chuyển trên 5 lần sẽ xuất hiện nhiều biến dị. Tỉ lệ cây biến dị tăng tỉ lệ thuận với thời gian cấy chuyền tiếp sau đĩ và cĩ thể đạt tới 5%. Dạng biến dị phổ biến là bạch tạng, sọc lá, sinh trưởng của cây bất thường, cĩ số lá trên 100 lá vẫn chưa ra hoa kết quả trong khi bình thường cĩ thể xử lý ra hoa khi cây cĩ 40 lá. Nhiễm mẫu và sản sinh chất độc từ mẫu + Sử dụng dung dịch khử trùng (HgCl2, Natrihypochlorua…) + bổ sung than hoạt tính vào mơi trường nuơi cấy (0.1 – 0.3%). + bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) + sử dụng mơ non, gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng + ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xitric vài giờ trước khi cấy + nuơi cấy mẫu trong mơi trường lỏng, O2 thấp, khơng cĩ ánh sáng(1-2 tuần) + cấy chuyền mẫu liên tục sang mơi trường tươi trong 1-2 tuần Quá trình hĩa thủy tinh thể + giảm sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ đường trong mơi trừơng cấy hoặc dùng các chất cĩ áp suất thẩm thấu cao. + tránh gây thương tổn trên mẫu cấy khi khử trùng và tiếp xúc với mơi trường cấy ít nhất; + sử dụng ABA hoặc một số chất kích thích sinh trưởng + giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong mơi trường cấy + giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuơi cấy 3.1. Cơng nghệ nuơi cấy dịch huyền phù 3.2. Sản xuất các hợp chất thứ cấp 3.3. Ứng dụng bioreactor trong sản xuất hợp chất thừ cấp Nuơi cấy mơ dịch huyền phù tế bào 3.1.1. Đặc điểm của nuơi cấy huyền phù tế bào Sự phát triển của tế bào trải qua các giai đoạn sau: Bắt đầu từ pha lag (đưa mơ sẹo vào mơi trường)  pha hàm số mũ (số lượng phân bào tăng dần)  pha tuyến tính (tăng mạnh quần thể tế bào)  pha ổn định (sự phân bào giảm dần, chúng khơng phân chia, số lượng tế bào ở mức bão hịa)  pha suy vong (tế bào giảm và chết dần).  hình thành dịng tế bào Sự phát triển của các dịng tế bào trong nuơi cấy dịch huyền phù sau 30 ngày Dịng tế bào cĩ đặc điểm: (1) khả năng tách tế bào cao; (2) phát sinh hình thái đồng nhất; (3) nhân rõ ràng và tế bào chất đậm đặc; (4) nhiều hạt tinh bột; (5) tương đối ít các yếu tố mạch; (6) cĩ khả năng nhân đơi trong 24-72 giờ; (7) mất tính tồn năng; (8) quen với chất sinh trưởng; (9) tăng mức đa bội thể. 3.1.2. Các phương pháp nuơi cấy dịch huyền phù a. Nuơi cấy dịch thể tĩnh Gấp 1 cầu giấy lọc lại nhiều lần  1 đầu vào mơi trường dinh dưỡng khống theo phương thẳng đứng, đầu kia uốn cong 1 gĩc 900 tạo thành nơi chứa mẫu nuơi cấy. Phần dưới của cầu giấy lọc hoạt động như một cái “bấc đèn” vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng từ mơi trường nuơi cấy cung cấp cho các tế bào sinh trưởng và phát triển. Nuơi cấy dịch thể tĩnh in vitro (mẫu cấy chìm hồn tồn trong dung dịch) b. Nuơi cấy dịch thể động Nuơi cấy chìm liên tục: các tế bào luơn được tiếp xúc với mơi trường dinh dưỡng. Quá trình thơng khí được thực hiện nhờ một máy lắc chạy ở tốc độ 100-150 vịng/phút, hoặc cĩ thể dùng các phương pháp và thiết bị thơng khí khác. Nuơi cấy chìm hồn tồn mẫu cấy Aldrovanda trong điều kiện in vitro b. Nuơi cấy dịch thể động Nuơi cấy chìm tuần hồn: các tế bào được nhúng vào mơi trường dịch thể xen kẽ với khoảng thời gian được đưa ra khỏi mơi trường. Quá trình này được thực hiện nhờ sự chuyển động “bập bênh” của các bình nuơi cấy với sự trợ giúp của các thiết bị khác. Khi chuyển động, khối tế bào ở đầu này của bình được đưa vào mơi trường cịn ở đầu kia lại được tiếp xúc với khơng khí. Trong nuơi cấy dịch huyền phù, sự sinh trưởng của các tế bào được đánh giá bằng số lượng, thể tích, khối lượng khơ và khối lượng tươi của tế bào. Nuơi cấy dịch huyền phù phơi chuối ? Theo các bạn, trong các phương pháp trên phương pháp nào sản xuất được nhiều tế bào nhất? ? Phương pháp nào mẫu vật dễ bị các vi sinh vật xâm nhiễm nhất? 3.2. SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP 3.2.1. Khái niệm chung 3.2.2. Các chất thứ cấp dùng trong thực phẩm 3.2.3. Các chất thứ cấp dùng trong dược phẩm 3.2.4. Một số chất khác Định nghĩa Ngồi các chất carbohydrate, lipid, protein, nucleic acid… trong thực vật cịn tồn tại những hợp chất khác nhau do quá trình trao đổi các chất nĩi trên tạo thành. Các hợp chất này được gọi là các chất cĩ nguồn gốc thứ cấp. Các chất trao đổi thứ cấp hay cịn gọi là các chất thứ cấp cĩ thể xếp trong ba nhĩm chính: alkaloid, tinh dầu và glycoside. Glycoside: Là những dẫn xuất của carbohydrate (thường là dẫn xuất của monose) với các hợp chất cĩ bản chất hĩa học rất khác nhau khơng phải là carbohydrate. Akaloide: Là những chất dị vịng chứa nitơ, cĩ đặc tính kiềm và cĩ tác dụng sinh lý mạnh; nhiều alkaloid là những chất độc. Ví dụ: Cocaine là chất giảm đau tại chỗ, tác động đến những đầu cảm giác của hệ thần kinh ngoại biên. Trong quả cà độc dược chứa atropine là chất tác động mạnh đến các dây thần kinh vận động của mắt, làm cho đồng tử dãn ra. Tinh dầu: Chủ yếu là thành phần terpen trong cấu trúc, sự cĩ mặt của terpen quy định mùi vị của nhiều thực vật (hoa hồng, hoa nhài, lá chanh, lá sả…) Ví dụ: - Limonen: cĩ trong tinh dầu thơng, tinh dầu họ chanh. - Cimol cĩ trong dầu khuynh diệp, bạch đàn. - Terpinene, xivestren cĩ trong dầu thơng. Tinh dầu Glycoside Akaloide ? Theo các bạn, vai trị, ý nghĩa của các hợp chất thứ cấp là gì? Vai trị của các hợp chất thứ cấp Glycoside: bao gồm các phenolic, tanin, flavonoid, saponin và các cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm chất nhuộm, các chất mùi thực phẩm và dược phẩm. Alkaloid: bao gồm các hợp chất như: codein, nicotine, caffeine và morphine, tác động đến hoạt tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong cơng nghiệp dược. Tinh dầu: làm chất mùi, chất thơm và dung mơi. 1. Theo các bạn, người ta cĩ thể sản xuất các hợp chất thứ cấp này bằng cách nào? 2. Ưu điểm và khuyết điểm của mỗi phương pháp là gì? Phương pháp sản xuất chất thứ cấp Phương pháp hóa lý: chưng cất và trích ly (trích ly có thể dùng dung mơi bay hơi hoặc dung mơi khơng bay hơi) Phương pháp cơ học: dùng các quá trình cơ học như ép, bào, nạo. Phương pháp kết hợp: kết hợp giữa quá trình hóa lý và quá trình cơ học, hoặc sinh hóa (lên men) và cơ học, hoặc sinh hóa và hóa lý. Ví dụ, trong quả vani, tinh dầu ở dạng liên kết glucozit nên dùng enzyme để thủy phân, phá hủy liên kết này rời sau đó dùng phương pháp chưng cất (hóa lý) để lấy tinh dầu. Thu nhận hợp chất thứ cấp thơng qua nuơi cấy mơ in vitro 1: Thiết bị trích ly; 2: Thiết bị làm bay hơi dung mơi; 3: Thiết bị ngưng tụ; 4: Thùng chứa Trích ly 1: Quạt gió; 2: TB lọc khơng khí; 3: Đờng hờ lưu lượng; 4: Tháp làm ẩm khơng khí; 5: TB chứa nguyên liệu; 6: TB hấp phụ Hấp phụ Quy trình sản xuất ginsengoside từ cây Nhân sâm (Panax ginseng) thơng qua nuơi cấy mơ: Nhân giống in vitro cây bắt ruồi (Drosera brumanni Vahl) để thu nhận một hợp chất quinone Ưu điểm của sản xuất hợp chất thứ cấp thơng qua nuơi cấy in vitro: - Các tế bào thực vật cĩ thể nuơi trong điều kiện nhân tạo mà khơng phụ thuộc vào địa lý, thời tiết. - Khơng cần thiết phải vận chuyển và bào quản với số lượng lớn các nguyên liệu thơ. - Cĩ thể kiểm sốt chất lượng và hiệu suất của sản phẩm - Một số sản phẩm từ nuơi cấy dịch huyền phù cĩ chất lượng cao hơn trong cây hồn chỉnh. Khuyết điểm: - Chỉ cĩ thể sản xuất một lượng vừa phải các chất thứ cấp. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuơi cấy in vitro tạo sản phẩm thứ cấp: Trạng thái tế bào: sự phân hĩa các tế bào khơng phân hĩa trong nuơi cấy dịch huyền phù sẽ tạo thành các chất thứ cấp. Điều kiện mơi trường: Các chất dinh dưỡng Chất điều hịa sinh trưởng Thực vật pH, nhiệt độ, ánh sáng Mật độ nuơi cấy, quá trình thu nhận sản phẩm 3.2.2. Các chất thứ cấp dùng trong thực phẩm a. Các chất màu Anthocyanin Betalain Crocin và crocetin Capsaicin và các capsaicinoide b. Các chất mùi Vanilla Garlic và onion c. Các chất ngọt Stevioside Anthocyanin Fabaceae Rosaceae Vitaceae Solanaceae ? Con đường hình thành hợp chất anthocyanin như thế nào? Vai trị và quy trình sản xuất anthocyanin Các anthocyanin là các sắc tố tiêu biểu cĩ trong các lồi thực vật hạt kín (angiosperms) và các lồi thực vật cĩ hoa (flowering plants); tập trung ở các bộ phận khác nhau như: rễ, lá, hoa và quả. Sự hình thành sắc tố anthocyanin trên cây Lúa mì (Triticum aestivum L. cv. Chris): a. Sự biểu hiện tạm thời của anthocyanin trên tế bào nhỏ của phơi lúa mì trưởng thành sau chuyển gen 48 giờ; b-d: sau 9 tuần nuơi cấy trong tối; e: 6 tuần tối + 4 ngày sáng; f: 6 tuần tối + 9 ngày sáng 3.1.2. Các chất mùi Vanilla Đây là hĩa chất mùi phổ biến và được sử dụng rộng rãi cho nhiều loại thực phẩm. Sản xuất các hợp chất mùi vanilla bằng phương pháp nuơi cấy tế bào: nuơi cấy các cơ quan khác nhau của cây V. planifolia như lá hoặc đoạn thân  vanilla khoảng 2,2%; nếu cải tiến điều kiện nuơi cấy (bổ sung than hoạt tính)  làm tăng sản lượng từ 100 mg/l lên hơn 1.000 mg/l, tương đương 8% hàm lượng vanilla trên trọng lượng khơ. Quy trình nuơi cấy cây Vanilla planifolia in vitro Vai trị và quy trình sản xuất garlic Vai trị Tỏi (garlic, Allium sativum) là gia vị được dùng rất rộng rãi trong ẩm thực: pha nước mắm, ướp thịt, ướp cá, chiên, xào Làm dược liệu: giảm thiểu tiến trình xơ cứng động mạch; cholesterol và triglyceride; tăng cường sức miễn dịch lên , ngừa cảm cúm. Quy trình nuơi cấy Allium sativum in vitro Chất ngọt - Stevioside Stevioside tự nhiên ngọt hơn sucrose khoảng 300 lần; cĩ thể ức chế thực sự sinh trưởng của các vi sinh vật vùng miệng Stevioside cĩ thể được sản xuất khi nuơi cấy callus của Stevia rebaudiana in vitro 3.2.3. Các chất thứ cấp dùng trong dược phẩm a. Các alkaloide Caffein; Nicotin Betalain; Berberin Reserpine; Hyoscyamine b. Các steroide Diosgenin, Digitoxin; Glycoside tim (cardiac) 3.2.4. Một số chất khác Shikonin; Saponin Glycyrrhizin; Anthraquinone Ginsengoside; Taxol Caffein Coffea arabica Nicotin Nicotinana tabacum Ảnh hưởng của TDZ lên sự phát sinh mơ sẹo từ lá cây cà phê (Coffea arabica) (Parvatam Giridhar và cộng sự) Quy trình tách chiết caffein Bình cĩ áp suất cao Hạt lọc hết chất caffein Loại bỏ caffein bằng cách sử dụng CO2 siêu tới hạn Hệ thống lọc caffein Quá trình hình thành chất lỏng siêu tới hạn CO2 siêu tới hạn: Là chất khí được nén cho đến khi cĩ mật độ phân tử cao gần bằng mật độ các phân tử của chất lỏng. Ví dụ: sử dụng phương pháp CO2 lỏng siêu tới hạn để chiết xuất tinh dầu từ nguyên liệu trầm đạt hiệu quả cao hơn so với phương pháp lơi cuốn hơi nước truyền thống (1,5% so với 1%) và tiết kiệm thời gian (chỉ mất 2 giờ so với 4 giờ như trước đây). Động học của sự sinh trưởng và sự hình thành diosgenin trong nuơi cấy dịch huyền phù tế bào Dioscorea deltoidea (Benjamin TAL và cộng sự) Diosgenin 3.2.4.Một số chất khác Shikonin; Saponin Glycyrrhizin; Anthraquinone Ginsengoside; Taxol Thu taxol từ nuơi cấy in vitro rễ tơ cây thủy tùng (Taxus brerifolia) Thay đổi nồng độ CKTSTTTV Thu nhận sản phẩm thứ cấp trong cơng nghệ nuơi cấy tế bào in vitro Hầu hết các sản phẩm thứ cấp đều tích tụ trong tế bào nuơi cấy, cũng cĩ một số ở hợp chất được tiết ra ngồi mơi trường. Huyền phù tế bào (chứa sản phẩm thứ cấp) sau khi kết thúc quá trình nuơi cấy được mang đi ly tâm Áp dụng các phương pháp hĩa, lý tương ứng để tách các sản phẩm này ra khỏi dung dịch và mang tinh chế sẻ thu được sản phẩm thứ cấp. Kết luận Trong cơ thể thực vật chứa các hợp chất cĩ giá trị như: dược liệu, các chất tạo mùi, các chất dùng làm gia vị, các sắc tố và các hĩa chất dùng trong nơng nghiệp được biết như là các chất trao đổi thứ cấp (secondary metabolites), thường được sản xuất với một lượng rất nhỏ (dạng vết) . Dựa trên cơ sở tính tồn thể (totipotency) của tế bào thực vật, người ta cĩ thể sản xuất các chất thứ cấp thơng qua CN nuơi cấy mơ thực vật. Quy trình sản xuất các chất thứ cấp thơng qua nuơi cấy mơ tế bào Thực vật Xử lý mẫu vật Mẫu Thực vật (Nuơi cấy tạo thành mơ sẹo) Nuơi cấy lỏng lắc Dịch lọc để xử lý thu sản phẩm thứ cấp Bã Dùng cho chăn nuơi hoặc phân bĩn Tái sử dụng để sản xuất cây con ? Theo các bạn để sản xuất hợp chất thứ cấp thơng qua nuơi cấy mơ thành cơng cần cĩ những yêu cầu gì? Hiệu suất tạo sản phẩm thứ cấp thơng qua nuơi cấy in vitro phụ thuộc vào (Mulbagal and Tsay 2004): (1) thành phần mơi trường và điều kiện nuơi cấy như: pH, nhiệt độ, phytohormone, sự thơng khí… (2) việc lựa chọn các dịng tế bào năng suất cao, (3) các tiền chất bổ sung nuơi cấy, (4) các chất kích kháng bảo vệ thực vật: kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp, giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao 3.3. ỨNG DỤNG BIOREACTOR TRONG SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP Bioreactor là gì? Cĩ thể phân thành bao nhiêu loại? Phân loại: Bioreactor cĩ ba loại chính sau: - Loại dùng để sản xuất sinh khối (sản phẩm là khối tế bào, các đơn vị phát sinh phơi, phát sinh cơ quan, chồi, rễ) - Loại dùng để sản xuất các chất chuyển hĩa thứ cấp, enzyme - Loại dùng cho việc chuyển hố sinh học các chất chuyển hĩa ngoại sinh (là các chất tiền thân trong quá trình trao đổi chất) Triển vọng của bioreactor: Phương pháp đầy hứa hẹn cho nhân giống với số lượng lớn tế bào, phơi soma hay các đơn vị phát sinh cơ quan (như củ, hành, đốt, củ bi hay cụm chồi), Dây chuyền sản xuất sinh khối sâm Ngọc linh trong 20 ngày Sản xuất các hoạt chất trao đổi thứ cấp Năm 1959, báo cáo đầu tiên về nuơi cấy tế bào thực vật trên quy mơ lớn đã được cơng bố (Tulecke và Nickell, 1959). Ngày nay, việc nuơi cấy tế bào thực vật cĩ thể thực hiện trong bình cĩ thể tích lên tới 75.000 lít (Rittershaus et al., 1989) để sản xuất các chất như: shikonin, ginsenoside và berberine. Ưu điểm của nuơi cấy bioreactor: Khi nuơi cấy rễ cĩ thể khơng cần sử dụng nguồn mẫu cấy rễ ban đầu nhiều vì chúng cĩ tốc độ tăng trưởng rất cao. Thu được nhiều hợp chất trong thời gian ngắn. Nhược điểm của nuơi cấy bioreactor: Sự phát sinh hình thái phức tạp và khả năng bị biến dạng của rễ Nguồn cung cấp oxy cũng như dinh dưỡng thường khơng đến được đồng đều với tất cả sinh khối bioreactor dẫn đến hậu quả là nhiều khối mơ lão hĩa. Yêu cầu khi ứng dụng bioreactor trong sản xuất hợp chất thứ cấp: - cần thiết kế các hệ thống bioreactor thích hợp đáp ứng được yêu cầu về nuơi cấy, - theo dõi những chỉ số vật lý và hĩa học diễn ra trong bireactor. - chú ý sự khác nhau về lồi - nên bắt đầu với hệ thống bioreactor nhỏ để tối ưu hĩa các điều kiện nuơi cấy, sau đĩ việc nuơi cấy trong các bioreactor (500 – 1000 lít) quy mơ lớn. 4.1. KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CÂY ĐƠN BỘI 4.2. KỸ THUẬT TẠO CÂY ĐƠN BỘI IN VITRO 4.3. ỨNG DỤNG CỦA ĐƠN BỘI ? Theo di truyền học, kiểu hình của thế hệ sau do những yếu tố nào quy định chủ yếu? Nhụy hoa Nhị hoa Đặc điểm của hạt phấn: - Là những tế bào đơn bội (giao tử đực) và cĩ kiểu sinh trưởng xác định. - Ở thực vật hạt kín, hạt phấn là những cấu trúc chuyên hĩa cao, bao gồm tế bào sinh dưỡng (vegatative cell) và tế bào sinh sản (generative cell). - Cĩ khả năng phân chia để hình thành các tế bào mới hoặc các mơ khi được sinh trưởng trong những điều kiện thích hợp. Sự phát triển của hạt phấn Giá trị của thể đơn bội (Haploids) trong nhân giống: - Chỉ mang một allen của gen, vì vậy cĩ thể biểu hiện các đặc điểm mang tính đột biến và tính lặn dễ dàng. - Cĩ thể loại bỏ các gen gây chết ra khỏi cây trồng - Cĩ thể sản xuất các cây đồng hợp tử nhị bội hay đa bội cĩ giá trị cao trong tạo giống - Cĩ thể sản xuất các kiểu gen lai cĩ giá trị cao nhanh Tiềm năng của thể đơn bội: Là những vật liệu di truyền quý giá cho cơng tác chọn giống cây trồng vì tồn bộ các gen đều ở tình trạng đồng hợp tử nên kể cả đặc tính lặn cũng được thể hiện. Hiện nay hơn 170 loại cây đã cĩ thể tạo được từ con đường đơn bội như lúa, ngơ, lúa mạch, thuốc lá… 4.1. KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CÂY ĐƠN BỘI Cây đơn bội cĩ thể sử dụng vào các mục đích sau: + Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen + Tạo đột biến ở mức đơn bội + Tạo dịng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ cơng tác giống cây trồng Sự hình thành cây đơn bội (Haploid Plant Formation) In vivo: Xảy ra tự nhiên Cĩ thể cảm ứng bằng các nhân tố vật lý hay hĩa học Loại bỏ nhiễm sắc thể sau quá trình lai giữa các lồi. H. vulgare (n=7) H. vulgare H. bulbosum (n=7) H. bulbosum X Chromosome Elimination Hybrid Zygote (Hordeum vulgare, 2n = 2x = 14, VV, female) x H. bulbosum (2n = 2x = 14, BB, male), Barley Monoploid Production Sự hình thành Lúa mì đơn bội bằng cách loại bỏ NST Sự hình thành cây đơn bội (Haploid Plant Formation) In vitro: Nuơi cấy bao phấn (Anther culture (androgenesis)) Sản xuất các cây đơn bội từ các tiểu bào tử Nuơi cấy nỗn (sự trinh sinh cái - Ovule culture (gynogenesis) Sản xuất các cây đơn bội từ tế bào trứng khơng thụ tinh 4.2. KỸ THUẬT TẠO CÂY ĐƠN BỘI IN VITRO 4.2.1. Kỹ thuật nuơi cấy bao phấn, hạt phấn 4.2.2. Kỹ thuật nuơi cấy nỗn chưa thụ tinh Nguyên lý nuơi cấy hạt phấn: Sự phát sinh cây đơn bội từ hạt phấn gọi là sự sinh sản đơn tính đực (androgensist) theo 3 phương thức sau: - Sinh sản đơn tính trực tiếp: ví dụ như ở thuốc lá, cà độc dược Hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử)  phơi 1n  cây 1n - Sinh sản đơn tính đực gián tiếp: như ở lúa, ngơ… Hạt phấn đơn nhân (tiểu bào từ)  mơ sẹo 1n  chồi 1n  cây 1n - Sinh sản đơn tính hỗn hợp: quá trình này diễn ra tương tự như sinh sản đơn tính đực gián tiếp, nhưng sự hình thành mơ sẹo ngắn, khĩ nhận biết như cây cà chua… Con đường hình thành thể đơn tính đực - Pathways to Androgenesis Tự nhiên Nuơi cấy in vitro Sự phát triển của hạt phấn Nuơi cấy bao phấn tạo thể đơn bội Khoai tây Kỹ thuật nuơi cấy bao phấn và hạt phấn: 1. Các bao phấn được nuơi cấy trên mơi trường cĩ agar hoặc mơi trường lỏng và sự phát sinh phơi xảy ra trong bao phấn. 2. Hạt phấn được tách ra khỏi bao phấn trên bằng phương pháp cơ học hoặc do sự nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuơi cấy trên mơi trường lỏng. Sơ đồ tạo cây đơn bội từ nuơi cấy bao phấn KHỬ TRÙNG BỀ MẶT Tách các bao phấn Loại bỏ chỉ nhị Nhuộm các acetocarmine để xác định giai đọan phát triển của hạt phấn CÂY ĐƠN BỘI Phát triển phơi Nuơi cấy trên mơi trường đặc Nuơi cấy trên mơi trường lỏng HOA HẠT PHẤN HẠT PHẤN MANG CHỈ NHỊ Nuơi cấy bao phấn giống Lolium x Festuca Quy trình nuơi cấy bao phấn cây ớt ngọt (Capsicum annuum L.) (Ivett Bárány và cộng sự) 4.2.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuơi cấy bao phấn và hạt phấn Tuổi hạt phấn Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn và hạt phấn Tiền xử lý bao phấn và hạt phấn Kiểu gen Mật độ bao phấn/ hạt phấn Dinh dưỡng, hormone và các nhân tố khác Tuổi hạt phấn: giai đoạn phát triển thích hợp là bắt đầu từ tế bào cĩ 4 nhân cho đến sau nguyên phân đầu tiên. Ví dụ: Ảnh hưởng của tuổi hạt phấn lên sự hình thành phơi cây Thuốc lá Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn và hạt phấn: quang chu kỳ, cường độ ánh sáng, nhiệt độ, ánh sáng, ngày thu mẫu… Ví dụ: Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu đến tỉ lệ hình thành mơ phơi Thuốc lá Quá trình xử lý bao phấn và hạt phấn: bằng nhiệt độ nĩng, lạnh hay kết hợp xử lý lạnh với gây sốc nhiệt đều cĩ thể làm tăng hiệu quả tạo cây đơn bội. Tiền xử lý lạnh Gây sốc nhiệt Nuơi cấy hạt phấn phấn giống Clemenules Sự phát sinh thể đơn tính đực trên cây thuốc lá 4.2.2. Tạo cây đơn bội bằng nuơi cấy nỗn chưa thụ tinh Ở những lồi cây như hành, củ cải đường, hoa hướng dương… việc tạo cây đơn bội bằng con đường sinh sản đơn tính đực khơng đạt kết quả. Nuơi cấy bao phấn, hạt phấn tỉ lệ cây bạch tạng cao do sự mất cân bằng giữa di truyền nhân và di truyền bào chất.  tạo cây đơn bội bằng nuơi cấy nỗn chưa thụ tinh, gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ sinh (gynogensis). Nuơi cấy nỗn lồi Fagopyrum Các nhân tố ảnh hưởng: Tỉ lệ tạo cây đơn bội bằng con đường trinh nữ sinh biến động ở các lồi cây khác nhau. Kiểu gen cây mẹ, Giai đoạn phát triển của túi phơi, Chế độ xử lí nhiệt độ, mơi trường nuơi cấy… Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy đến sự hình tái sinh cây trong nuơi cấy nỗn chưa thụ tinh Tái sinh cây gián tiếp trong nuơi cấy nỗn lồi Fagopyrum ? Theo các bạn, nhược điểm của thể đơn bội là gì? Nhược điểm của thể đơn bội: Cây đơn bội thường cĩ kích thước nhỏ hơn, bất thụ do chúng chỉ chứa 1 nhiễm sắc thể của cặp lưỡng bội làm cho giảm phân bị rối loạn, tạo ra những giao tử khơng cĩ sức sống, cây chỉ tồn hạt lép. Nhị bội hĩa cây đơn bội: Nhị bội hĩa số lượng nhiễm sắc thể của cây đơn bội bằng các cách sau: 1. Tái sinh qua phương pháp nuơi cấy mơ 2. Cảm ứng nhị bội hĩa bằng colchicine Sự tạo thành cây đồng hợp tử thơng qua nuơi cấy bào phấn và hạt phấn và xử lý colchicine (Bajaj và cộng sự, 1983). Quy trình nhị bội hĩa thể đơn bội Cây, bao phấn in vitro (Dung dịch colchicine) Mẫu sau xử lý Mơi trường in vitro Bao phấn Rửa nhiều lần qua nước cất vơ trùng Tạo cây in vitro Cây ex vitro Kiểm tra mức đa bội (Xử lý colchicine) Sự khác nhau về hình thái hoa và lá giữa các cây S. montevidiensis tứ bội và nhị bội. Tứ bội (tetraploid) Nhị bội (diploid) Tứ bội (tetraploid) Nhị bội (diploid) Nhị bội (diploid) Tứ bội (tetraploid) ? Như vậy ứng dụng của thể đơn bội là gì? Ý nghĩa và ứng dụng của thể đơn bội: Cĩ thể tái sinh cây trực tiếp hoặc gián tiếp qua sự phân chia và biệt hĩa tế bào Các cây tái sinh cĩ số lượng NST bằng với bố mẹ.  ứng dụng trong nghiên cứu tế bào và phơi, di truyền, đột biến. Cây đơn bội với các đặc điểm mong muốn  ứng dụng nhiều trong cơng tác tạo giống, tạo dịng thuần Sự phát sinh phơi từ nuơi cấy bao phấn cây Hevea brasiliensis Sơ đồ các hướng ứng dụng của thể đơn bội 5.1. Giới thiệu chung 5.2. Cơng nghệ hạt nhân tạo 5.3. Ra hoa in vitro ? Điểm khác biệt giữa hạt nhân tạo và hạt tự nhiên Hạt tự nhiên Hạt nhân tạo ? Thế nào là hạt nhân tạo Định nghĩa hạt nhân tạo: Hạt nhân tạo (artificial seed hoặc synthetic seed) là phơi vơ tính bọc trong một lớp vỏ polymer như agar, agarose, alginate… Trong cấu trúc lưới của các lớp vỏ đĩ, nước, chất dinh dưỡng và hormone sinh trưởng được cung cấp thay cho nội nhũ, giúp cho phơi vơ tính cĩ thể nảy mầm trở thành cây hồn chỉnh. Cấu tạo hạt nhân tạo Hạt nhân tạo và sự hình thành cây Dâu tằm và Chuối (V. A. Bapat) ? Theo các bạn ý nghĩa của hạt nhân tạo là gì? Ý nghĩa: Nhân được số lượng lớn cây giống cĩ giá thành thấp Duy trì đặc tính giống nhau về mặt di truyền (do khơng cĩ sự phân ly tính trạng hoặc tái tổ hợp như phơi hữu tính) Tốc độ nhân giống nhanh, Cung cấp nguồn giống cho những dịng thực vật mới: cây chuyển gen, cây khơng hạt, cây đa bội... Các nhân tố cần thiết và nguyên tắc tổng hợp hạt nhân tạo Để tạo hạt nhân tạo cần cĩ ba yếu tố: Phơi vơ tính Vỏ bọc polymer (alginate, agar, CMC,…) Màng ngồi (calcium alginate) Quy trình sản xuất hạt nhân tạo in vitro Các bước cơ bản để tạo ra hạt nhân tạo từ phơi vơ tính cĩ thể bao gồm những quá trình: +Tạo mơ sẹo phơi hĩa. +Nuơi và nhân tế bào trong dịch lỏng. +Lọc lấy các cụm tế bào phơi hóa nhỏ (tế bào phơi) đồng nhất; +Đưa tế bào tiền phơi vào mơi trường phát triển+Bọc bằng màng nhân tạo và sau cùng là đưa vào bảo quản... Những hạt nhân tạo từ phơi vơ tính cĩ thể nảy mầm và tạo ra cây con cả trong mơi trường trong và ngồi ống nghiệm. Bọc màng nhân tạo Quy trình sản xuất hạt nhân tạo lồi Geodorum densiflorum Các nhân tố cần thiết và nguyên tắc tổng hợp hạt nhân tạo Để tạo hạt nhân tạo cần cĩ ba yếu tố: Phơi vơ tính Vỏ bọc polymer (alginate, agar, CMC,…) Màng ngồi (calcium alginate) Vỏ bọc polyme Alginate Xanthangum Carbomethylcellulose (CMC) Agar Đặc tính thuận lợi của alginate: Tính dính vừa phải Khơng gây độc cho phơi vơ tính Cĩ đặc tính tương hợp sinh học Cĩ khả năng tạo gel nhanh, để lâu được, độ cứng gel vừa phải vừa thuận lợi cho sự hơ hấp của phơi, vừa bảo vệ phơi khỏi những tổn thương bên ngồi Rẻ tiền Màng ngồi (calcium alginate): CaCl2.2H2O Quy trình sản xuất hạt nhân tạo in vitro ? Theo các bạn, các điểm cần lưu ý khi tạo hạt nhân tạo là gì? Một số điểm cần lưu ý khi sản xuất hạt nhân tạo thơng qua nuơi cấy in vitro: Lớp vỏ bọc cứng nhiều hay ít phụ thuộc vào số lượng ion trao đổi giửa Ca2+ và Na+. Do phơi vơ tính khơng cĩ nội nhủ nên vỏ bọc hạt nhân tạo thường được bổ sung các chất dinh dưỡng và chất điều hịa sinh trưởng để nuơi phơi. Ngồi ra, để giữ nước và tránh tổn thương cho phơi, người ta cĩ thể bổ sung vào chất nền các chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, sâu, vi sinh vật,... Bảo quản hạt nhân tạo: Hạt nhân tạo sau khi được tổng hợp cĩ thể được bảo quản rồi tái sinh theo nhiều phương pháp: Tách nước vỏ bao hạt (encapsulation dehydration): ngâm hạt trong dung dịch saccarose 1 M. Sau đĩ làm khơ hạt bằng khơng khí khơ hay sử dụng dịng khí thổi qua hạt, bảo quản và tái sinh khi cần thiết. Ứng dụng của hạt nhân tạo: Thủy tinh hĩa vỏ bao (encapsulation vitrification): ngâm hạt trong nitrogen lỏng (- 1960C) và bảo quản. Khi sử dụng, hạt được làm ấm bằng phương pháp giải đơng. Phương pháp kết hợp: tiền xử lý bằng phương pháp làm lạnh chậm ở - 400C). Sau đĩ, hạt được ngâm trong nitrogen lỏng, bảo quản và tái sinh khi cần thiết. Hạt nhân tạo Lan và sự tái sinh hoa Lan từ hạt nhân tạo (GP Saiprasad) Tái sinh hạt nhân tạo Quá trình sinh trưởng của hạt nhân tạo Lê trên các mơi trường MS cĩ bổ sung đường ở các nồng độ khác nhau (Ahmed A. Nower và cs.) Theo các bạn, các lồi hoa cĩ ý nghĩa gì trong đời sống? Một số lồi hoa Các nhân tố ảnh hưởng đến sự ra hĩa ở thực vật ex vitro Quang kỳ. Lồi cây Các chất dinh dưỡng Mơi trường tự nhiên, thời tiết… Plumbago indica Spathoglottis plicata Portulaca grandiflara L. Capsicum annum L. Sự cảm ứng ra hoa cây Long đởm (Gentiana sp.) in vitro thơng qua nuơi cấy chồi. A: hoa in vitro; B: hoa ex vitro; WT: cây đối chứng; #10 và # 12: cây chuyển gen; (Masahiro Nishihara và cs.) Sự hình thành hoa Ceropegia bulbosa in vitro từ nuơi cấy chồi (S. John Britto và cs.) Các yếu tố tác động lên sự ra hoa in vitro ở thực vật Độ tuổi Mơi trường Sự ra hoa in vitro trong quá trình nuơi cấy phơi Kinnow mandarin nuơi cấy trên mơi trường MS bổ sung 2 mg/l kinetin, 40 g/l sucrose, chiếu sáng 12 giờ sau 4 tuần nuơi cấy (B. Singh và cs.) Độ tuổi Sự tái sinh và ra hoa in vitro cây Cichorium sp. thơng qua nuơi cấy lá non (S. Nandgopal và cs). Ảnh hưởng của GA và IAA đến sự kéo dài thân và ra hoa của cây tulip (Tulipga garneriana) (Eurtan Sait Kurtar và cs.) Phytohormone Dendrobium Chao Praya Smile Dendrobium Madane Thong-In Một số hình ảnh sản xuất hoa Torenia fournieri in vitro 6.1. Thủy canh (Hydroponic) 6.2. Khí canh (Aeroponic) Khái niệm chung Thủy canh (Hydroponics) là một kỹ thuật nuơi trồng thực vật trong dung dịch dinh dưỡng, thường được định nghĩa như là “trồng cây trong nước”. Các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng tối ưu của thực vật cĩ thể được cung cấp trực tiếp qua tiếp xúc giữa rễ và dung dịch hoặc cĩ thể gián tiếp qua các giá thể trơ như: mạt cưa, cát, trấu, vỏ xơ dừa, than bùn… Do đĩ, người ta cịn gọi thủy canh là “trồng cây khơng sử dụng đất”. ? Theo các bạn, phương pháp canh tác thủy canh cĩ những mặt tích cực và hạn chế nào? Ưu điểm Giải quyết được phần nào các yếu tố ảnh hưởng đến canh tác nơng nghiệp như: sức ép của dân số, sự thay đổi khí hậu, sự xĩi mịn đất… Cho năng suất và phẩm chất cây trồng cao, Sản phẩm của hydroponics hồn tồn sạch, đồng nhất, giàu chất dinh dưỡng và tươi ngon, khơng tích lũy chất độc.  Thủy canh là một phương pháp thay thế cho các biện pháp làm sạch và cải tạo đất, tạo mơi trường làm việc sạch sẽ và việc thuê nhân cơng cũng trở nên dễ dàng hơn. Khuyết điểm Chỉ trồng các loại rau quả, hoa ngắn ngày Chưa được phổ biến nhiều do kỹ thuật cịn phức tạp Các hệ thống hydroponic Hệ thống thủy canh (Water Culture) Hệ thống dạng bấc (Wick system)  Hệ thống ngập & rút định kỳ (Ebb và flow system) Hệ thống nhỏ giọt (Drip systems – recovery / non-recovery) Kỹ thuật “màng dinh dưỡng” N.F.T (Nutrient Film Technique) Khí canh (Aeroponic) Hệ thống thủy canh (Water Culture) Hệ thống dạng bấc (Wick system)  Hệ thống ngập & rút định kỳ (Ebb và flow system) Hệ thống nhỏ giọt (Drip systems – recovery / non-recovery) Kỹ thuật “màng dinh dưỡng” N.F.T (Nutrient Film Technique) Khí canh (Aeroponic) Các yêu cầu cơ bản của hệ thống thủy canh Hệ đệm (là khả năng tự điều chỉnh cho phù hợp với sự tăng trưởng của cây) của nước hay giá thể trơ sử dụng phải thích hợp (pH = 5,8 – 6,5 và độ dẫn điện Ec trong khoảng 1,5 – 2,5dS/m). Dịch dinh dưỡng hay hỗn hợp phân bĩn phải chứa tất cả các thành phần vi lượng và đa lượng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây. Nhiệt độ và độ thống khí của giá thể trơ hoặc dung dịch dinh dưỡng phải phù hợp với hệ thống rễ. Các bạn cĩ nhận xét gì về triển vọng của hệ thống canh tác thủy canh.