Xây dựng quy trình chuyển gen gus vào giống đậu tương ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quy trình tái sinh cây

thu được cây chuyển gen nhờ Agrobacterium. Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking chọn lọc cho tính mẫm cảm với Agrobacterium. Các mẫu lá mầm được xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kanamycin và có hoạt tính gusA, hoặc kháng Ka và chống chịu glyphosate. Có thể biến nạp gen hiệu quả vào protoplast đậu tương bằng các phương thức thông dụng nhưng rất khó tái sinh được cây. Để biến nạp gen vào các giống đậu tương khác nhau người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản- phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng của cụm chồi từ vùng chung quanh mô phân sinh của trụ phôi) với sự tăng gia tốc của vi đạn có phóng điện để phân phối ADN ngoại lai. Hàng trăm cây đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả biến nạp đã cho nhiều genotype khác nhau. Nói chung các dòng đậu tương chuyển gen có nhiều bản sao của gen biến nạp (số bản sao khoảng từ 1-50, nhưng thường thay đổi từ 2-10). Phân tích Southern blot ở thế hệ sau của các bản sao gen thực vật cho thấy tất cả các bản sao cùng tách rời, như thể mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện diện một kết quả biến nạp độc lập và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên. - Thế giới: Lần đầu tiên diện tích trồng đậu tương biến đổi gen chiếm tới trên 75% trong tổng diện tích 90 triệu ha trồng đậu tương trên toàn thế giới [13]. Tính trạng kháng thuốc diệt cỏ cũng là tính trạng phổ biến nhất ở đậu tương, chiếm tới 62%. Cây biến đổi gen đa tính trạng cũng ngày càng được áp dụng rộng rãi, chiếm 21% tổng diện tích trồng cây biển đổi gen toàn thế giới, được trồng ở 11 nước, trong đó có 8 nước đang phát triển [20]. - Việt Nam: Cho tới nay, đã có một số các thử nghiệm để tối ưu hóa quá trình chuyển gen cũng như tái sinh sau chuyển gen của đậu tương như: nghiên cứu của Tran Thi Cuc Hoa et al. sử dụng giống đậu PC 19 là giống được trồng phổ biến ở Việt Nam làm đích chuyển gen. Việc biến nạp vào nốt lá mầm thông qua vi khuẩn A.tumefaciens mang vector nhị hợp pZY 102/pTF 102 mang gen bar, gen gusA và gen kháng glufosinat, thu được tần số chuyển gen ở thế hệ T0 là 1-3% [35]. Một nghiên chuyển gen vào đậy tương khác của Trần Thị Cúc Hòa với đích chuyển gen là nốt là mầm các giống đậu tương MTĐ 176, KL 202, Maverick, Williams 82 thông qua A.tumefaciens thu được hiệu suất chuyển gen là 1-5% [6], trong đó MTĐ 176 và KL202 là 2 giống đậu tương Việt Nam. Hy vọng rằng, trong tương lai nước ta có thể nâng cao diện tích trồng cây đậu tương biến đổi gen giúp tăng năng suất, tiết kiệm nước, đất, thuốc trừ sâu,…và có khả năng chống chịu điều kiện bất lợi Chương II - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Các thiết bị thí nghiệm Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm này là : Tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ lạnh, tủ ổn nhiệt, cân điện tử, máy khử trùng, bộ pipette, bình nuôi cấy, đĩa Petri, que cấy khuẩn hoặc que chang, dao và panh, đèn cồn. 2.1.2. Hóa chất và môi trường Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm này là: Ethanol, NaClO, Ka, Hygromycin, AS, 2,4-D, BAP, IAA, Agar. Các môi trường được sử dụng trong thí nghiệm là: LB, MS, C1, C2, C3, C4, C5, C6 (xem thành phần các loại môi trường ở phần phụ lục). 2.1.3. Vi khuẩn Chủng vi khuẩn được sử dụng là: A.tumefaciens AGL1 và GV3101. Cả hai chủng đều mang vector pCAMBIA 1301 có gen gus làm chỉ thi sàng lọc, gen kháng kanamycin làm chỉ thị chọn lọc vi khuẩn, gen kháng hygromycin làm chỉ thị chọn lọc thực vật. Hai chủng có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật, viện Di truyền nông nghiệp. 2.1.4. Đối tượng nghiên cứu Thí nghiệm sử dụng dòng đậu tương ĐT26 có nguồn gốc từ Viện Di truyền Nông nghiệp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng ♦♦ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu. - Nguyên tắc: Sử dụng các dung dịch khử trùng có khả năng xâm nhập và len lỏi vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt hạt đậu để có thể khử sạch hạt khỏi nấm và vi khuẩn (bởi vì hạt đậu tương được thu hoạch từ đồng ruộng nên chứa nhiều các loại vi khuẩn và nấm). - Chỉ tiêu đánh giá: mẫu có tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, sinh trưởng và phát triển bình thường. - Hóa chất: Ethanol, NaClO, nước cất vô trùng. - Tiến hành: khử trùng hạt được tiến hành trong tủ cấy vô trùng và theo quy trình khử trùng hạt được cải tiến từ quy trình của Xue R.G. et al. (2006)[31]. * Ngâm hạt với nước cất vô trùng trong 30 phút (hạt được bỏ trong bình tam giác 250ml với số lượng 20-25 hạt). * Lắc hạt với ethanol 70% trong 3 phút. * Rửa hạt bằng nước cất vô trùng 1 lần. * Lắc hạt với NaClO với các nồng độ 10%; 12,5%; 15%; 20% trong thời gian 5; 10; 13,5 phút. * Rửa hạt bằng nước cất vô trùng 5-6 lần (rửa đến khi hết bọt). * Dùng dao và panh tách bỏ lớp vỏ ngoài của hạt. * Cấy hạt vào môi trường nảy mầm MS, cho hạt nảy mầm trong 2-3 ngày. - Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26. 2.2.2. Chuyển gen gus vào đậu tương Trong các thử nghiệm chuyển gus vào đậu tương ở khóa luận này, chúng tôi chọn vị trí làm đích chuyển gen trên hạt đậu tương là nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt dựa vào nghiên cứu của Xue R.G. et al.[31], Tran Thi Cuc Hoa et al. [35]. X-gluc được sử dụng để nhuộm gus, được chuẩn bị theo quy trình của Olhoft et al. [30]. ♦♦ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26 - Nguyên tắc: vi khuẩn A.tumefaciens có khả năng tiếp cận với genome thực vật và có thể chuyển đoạn ADN ngoại lai vào trong genome thực vật. Tuy nhiên, mỗi chủng có cách tiếp cận bằng các cách khác nhau và vào các vị trí khác nhau trên cơ thể thực vật. - Chỉ tiêu đánh giá: Xác định chủng vi khuẩn mang gen gus mà có thể chuyển gen gus sang hạt đậu đang nảy mầm thành công với tỷ lệ sống của hạt cao - Vật liệu: Hạt đậu tương 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1, GV3101 chứa vector pCAMBIA1301, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C1 và C2, X-gluc. - Tiến hành: * Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen Chủng A.tumefaciens AGL1 và GV3101được cấy trên đĩa thạch LB có chứa Ka, nuôi trong tủ 280C qua đêm. Sau đó đem bảo quản trong tủ 40C (sử dụng 2-3 tháng kể từ ngày nuôi). Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 và GV3101 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,6-1 thì được sử dụng cho biến nạp. * Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen Hạt đậu 2-3 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1. Tiến hành chuyển gen (được tóm tắt như hình 4): Cho nốt lá mầm cùng với 1 lá mầm của hạt đã cắt ở trên tiếp xúc trực tiếp với dịch khuẩn AGL1 và GV3101 trong 60 phút. Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 và đồng nuôi cấy trên môi trường C2. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 370C trong 48h. Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu. - Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26. Hình 4. Quy trình thí nghiệm xác định chủng khuẩn thích hợp với giống đậu tương ĐT26 ♦♦ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26. - Nguyên tắc: Mật độ vi khuẩn ảnh hưởng đến khả năng xâm nhiễm của A.tumefaciens. Nếu trong dịch khuẩn mà mật độ vi khuẩn quá nhiều sẽ làm cho hiệu quả biến nạp vào mẫu thấp và gây chết mẫu. Còn nếu mật độ vi khuẩn ít thì hiệu quả biến nạp thấp. - Chỉ tiêu đánh giá: Mẫu sống và phát triển bình thường có màu xanh chàm đặc trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường) , hiệu quả biến nạp cao. - Vật liệu: : hạt đậu tương đã nảy mầm 1 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1 chứa vector pCAMBIA1301, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C1 và C2. - Tiến hành: * Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen Nuôi phục hồi A.tumefaciens AA43 từ đĩa thạch rên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD lần lượt là 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 thì được sử dụng cho biến nạp. * Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen Hạt đậu 1 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1. Tiến hành chuyển gen theo quy trình được tóm tắt như hình 5: Ngâm nửa hạt một ngày tuổi có chứa nốt lá mầm vào dịch khuẩn A.tumefaciens có OD lần lượt là 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4. Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 (có bổ sung AS) và cấy mẫu vào môi trường C2 trong 5 ngày. Hình 5. Quy trình thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) lên biểu hiện gus của giống đậu tương ĐT26 Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 370C trong 48h. Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26 ♦♦ Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen gus vào ĐT26. - Nguyên tắc: Sử dụng chủng A.tumefaciens chủng AGL1, là loại vi khuẩn có khả năng xâm nhiễm và chuyển gen cho tế bào vật chủ. Dựa vào các gen chỉ thị để nhận biết sự thành công của việc chuyển gen. - Chỉ tiêu đánh giá: mẫu sống và phát triển bình thường, có màu xanh chàm đặc trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường). - Vật liệu: hạt đậu tương đã nảy mầm 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1 chứa vector có chứa gen gus, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C1 và C2. - Tiến hành: * Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,8 thì được sử dụng cho biến nạp. * Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen Hạt đậu 1 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1 (có bổ xung AS). Tiến hành chuyển gen (được tóm tắt như hình 6): Ngâm lá mầm có chứa nốt lá mầm vào dịch khuẩn AGL1 đã được chuẩn bị ở trên với các khoảng thời gian 30, 45, 60 và 90 phút. Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 (có bổ sung AS) và cấy mẫu vào môi trường C2 trong 5 ngày. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 370C trong 48h. Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu. Hình 6. Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến biểu hiện gus trên giống đậu tương ĐT26 Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26 ♦♦ Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26. - Nguyên tắc: Sử dụng A.tumefaciens AGL1 mang vector pCAMBIA1301 để chuyển gen vào đậu tương, nốt lá mầm của hạt đậu tương bị làm tổn thương bằng kim và vi khuẩn sẽ xâm nhập dễ dàng hơn ở vị trí bị tổn thương do tại đó thực vật tiết ra các chất có bản chất phenolic (AS, Hydroxyl acetosyringon) là hợp chất có tác dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập , lại có vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào genom thực vật. - Chỉ tiêu đánh giá: mẫu sống và phát triển bình thường, có màu xanh chàm đặc trưng ở vị trí trụ dưới lá mầm khi nhuộm X-gluc (có thể nhìn thấy bằng mắt thường). - Vật liệu: hạt đậu tương đã nảy mầm 2-3 ngày tuổi khử trùng đạt tiêu chuẩn ở thí nghiệm 1, vi khuẩn A.tumefaciens chủng AGL1, môi trường LB, AS, Ka, môi trường C1 và C2, kim vô trùng (đường kính 0,11mm, dài 7cm). - Tiến hành: ● Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen Nuôi phục hồi A.tumefaciens AGL1 từ đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên vào dung dịch LB có chứa AS 200mg/l, Ka 200mg/l từ 4-6h trong tủ lắc 280C cho đến khi đạt nồng độ OD = 0,8 thì được sử dụng cho biến nạp. ● Chuẩn bị mẫu thực vật cho chuyển gen Chia đôi số lượng hạt 2-3 ngày tuổi đạt yêu cầu ở thí nghiệm 1. Một nửa, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, phần rễ của hạt, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau khi cắt xong, ngâm vào dung dịch C1(có bổ xung AS). Một nửa, dùng dao cắt bỏ một lá mầm, giữ lại một lá mầm có chứa nốt lá mầm. Sau đó, sử dụng kim đâm vào vị trí nốt lá mầm của hạt (mỗi hạt đâm khoảng 6-10 lần với độ sâu 0,2-0,5mm). Sau khi làm tổn thương nốt lá mầm thì ngâm vào dung dịch C1 (có bổ xung AS). ● Tiến hành chuyển gen (tóm tắt ở hình 7): Hình 7. Quy trình thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến biểu hiện gus. Ngâm lá mầm có chứa nốt lá mầm đã chuẩn bị ở trên (cả nốt lá mầm nguyên và bị tổn thương) vào dịch khuẩn AGL1 đã được chuẩn bị ở trên với thời gian là 60 phút. Sau đó, rửa lại mẫu với dung dịch C1 (có bổ sung AS) và cấy mẫu vào môi trường C2 trong 5 ngày. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, đem mẫu rửa với nước, sau đó bỏ mẫu vào ống falcon 50ml ngâm mẫu trong dung dịch X-gluc ở tủ 370C trong 48h. Sau nhuộm gus 48h, rửa mẫu 4-5 lần với ethanol 96% với mục đích loại bỏ diệp lục của lá, sau đó quan sát và chụp ảnh mẫu. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại mỗi công thức theo dõi 6-10 đĩa, mỗi đĩa 6-7 mẫu của dòng ĐT26 ♦♦ Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen Nguyên tắc: Sau các thí nghiệm từ 1 đến 5, chúng tôi đã thử nghiệm với các yếu tố có ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen cũng như ảnh hưởng đến việc tái sinh cây chuyển gen như xác định thời gian thích hợp khi khử trùng mẫu hạt bằng dung dịch khử trùng, xác định chủng A.tumefaciens thích hợp với giống đậu tương ĐT26, xác định mật độ vi khuẩn thích hợp, xác định thời gian lây nhiễm thích hợp cũng như so sánh hiệu quả biến nạp giữa việc làm tổn thương và không làm tổn thương vị trí nốt lá mầm trên hạt. Từ đó, xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen. Chỉ tiêu đánh giá: Mẫu sau khi chuyển gen có khả năng tái sinh cao tức là tỷ lệ % mẫu sống cao, tỷ lệ % mẫu chết và nhiễm thấp. Vật liệu: bao gồm toàn bộ các vật liệu đã sử dụng ở thí nghiệm từ 1-5. Tiến hành (quy trình được tóm tắt như hình 8): Khử trùng hạt đậu tương ĐT26 theo quy trình như thí nghiệm 1 với Ethanol 75% trong 3 phút và NaClO 15% trong 13,5 phút. Tách vỏ và cho hạt nảy mầm trong MS 2-3 ngày. Sau 2-3 ngày nảy mầm, dùng dao tách bỏ 1 lá mầm của hạt, chỉ giữ lại 1 lá mầm có cùng với nốt lá mầm. Sau đó dùng kim đâm vào vị trí nốt lá mầm của hạt (mỗi hạt đâm khoảng 6-10 lần với độ sâu 0,2-0,5mm), ngâm vào trong dung dịch C1 trong 30 phút. Sau đó, tiến hành lây nhiễm mẫu và vi khuẩn AGL1 bằng cách ngâm mẫu trong dịch khuẩn AGL1 có OD = 0,8 trong 60 phút. Và đồng nuôi cấy trong C2 trong 5 ngày. Sau đồng nuôi cấy, chuyển mẫu sang môi trường C3 có chứa kháng sinh để loại bỏ vi khuẩn cũng như để chọn lọc thực vật trong 8 ngày ở 260C với chu kì 18/6h sáng tối. Sau 8 ngày, sử dụng dao cắt bỏ lá mầm, chỉ giữ lại phần nốt lá mầm và tiếp tục chuyển mẫu sang môi trường C4 trong 21 ngày để nhân chồi. Sau 21 ngày thì chuyển mẫu sang môi trường C5 để kéo dài chồi đến khi chồi dài 3-5cm thì chuyển tiếp sang môi trường C6. Ở C6, đợi khi nào mẫu ra rễ thì chuyển cây ra đất. Hình 8. Quy trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT26 ♦♦ Thí nghiệm 7: Phân tích cây chuyển gen T0 ► Thí nghiệm 7.1: Tách chiết ADN từ lá cây đậu tương chuyển gen T0 * Vật liệu thực vật Lá non của cây đậu tương ĐT26 đã được tái sinh thành công và cây đối chứng được thu bằng giấy bạc và làm lạnh nhanh bằng nito lỏng, và được lưu giữ ở -800C cho đến khi cần phân tích. * Hóa chất Đệm chiết: CTAB (2% w/V), Tris-HCL 100mM (pH=8.0), NaCl (1,4mM), EDTA 20mM, β-mercaptoethanol (1%). Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1), Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), Isopropanol, Ethanol 75% và 100%, TE (10mM Tris-HCl pH 8,0; 1mM EDTA pH 8,0). Đá khô, Nito lỏng, 10mg/ml RNase. * Dụng cụ thiết bị: Chày và cối sứ, máy li tâm, eppendoft, bộ pipiet. * Quy trình tách thực hiện theo quy trình tách ADN cải tiến từ quy trình của Doyle et al. (1987)[16]. - Lấy 1g mẫu lá được nghiền nhỏ bằng cối chày sứ trong nito lỏng, chuyển vào ống Eppendoft 2ml. - Bổ xung 1,5ml dung dịch đêm CTAB , ủ mẫu ở 650C trong 60 phút. - Thu lấy 800µl dịch nổi phía trên cho vào ống eppendoft mới. Thêm 800µl phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) lạnh, lắc đều và ly tâm 12000v/p, 10 phút. - Thu lấy 800 µl dịch nổi chuyển sang ống eppendoft mới và thêm 800µl chloroform:isoamylalcohol (24:1), lắc đều ở nhiệt độ phòng rồi đem ly tâm 12000 v/p, 10 phút. - Thu lấy 800µl dịch nổi chuyển sang ống eppendoft mới và thêm 800µl đệm kết tủa CTAB, trộn đều cho đến khi thấy một màng ADN màu trắng đục nổi lên. Ly tâm 12000 v/p, 10 phút. Loại bỏ phần dịch nổi, thu cặn. - Hòa tan tủa bằng 1ml NaCl 1M, ly tâm 12000v/p, 10 phút. Thu dịch nổi. - Thu lấy 800µl dịch nổi chuyển sang ống eppendoft mới, thêm vào dung dịch 5µl RNase 10mg/ml để phân hủy ARN và thêm vào 800µl isopropanol lạnh, lắc đều để tủa ADN. Ly tâm 12000 v/p, 15 phút và thu cặn. - Rửa tủa bằng ethanol 70% lạnh, ly tâm 12000 v/p, 10 phút. Thu cặn. - Tiếp tục rửa tủa bằng ethanol 100% lạnh (làm tương tự như bước trên). - Làm khô tủa bằng hút chân không. Sau đó, hòa tan tủa trong đêm TE và lưu giữ ở -200C. - Chạy điện di trên 0,8% agarose gel để kiểm tra độ tinh sạch của ADN. ► Thí nghiệm 7.2: Phân tích cây chuyển gen * Lá của cây chuyển gen và lá của cây không chuyển gen (mẫu đối chứng), đem khử trùng bằng ethnol 70% và NaClO 15%, rửa với nước cất khử trùng 4-5 lần. Sau đó, đem cấy mẫu trong MS có bổ sung hygromycin 50mg/l trong 5-7 ngày. Sau đó quan sát và phân biệt mẫu kháng hay không kháng hygromycin theo màu sắc (Wang & Waterhouse, 1997). * PCR mẫu ADN đã tách từ lá của cây chuyển gen ở thí nghiệm 7.1 bằng mồi gus hoặc hgro. 2.3. Các chỉ tiêu đánh giá Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống x 100% Tổng số mẫu ban đầu Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu chết x 100% Tổng số mẫu ban đầu Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm x 100% Tổng số mẫu ban đầu Tần số chuyển gen (%) = Tổng số mẫu có đốm xanh x 100% Tổng số mẫu đã nhuộm Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi đã nhân Tổng số chồi ban đầu Chương III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu Giai đoạn tạo nguồn nguyên liệu vô trùng ban đầu là giai đoạn đưa đối tượng nuôi cấy từ ngoài vào điều kiện nuôi cấy in vitro, vì vậy việc xác định phương thức khử trùng thích hợp có ý nghĩa quyết định đối với thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đạt được các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại, phân hóa và sinh trưởng tốt. Tỷ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng xâm nhâp của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mẫu, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô mẫu. Dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn. Chúng tôi sử dụng nguồn mô ban đầu để tạo nguyên liệu vô trùng trong ống nghiệm là từ các hạt đậu tương giống ĐT26 đã đủ điều kiện làm giống và được thu hoạch từ ngoài đồng ruộng vào nên hạt bị nhiễm nhiều các loại vi khuẩn, nấm từ môi trường đất, từ quá trình thu hoạch,…Trước khi khử trùng mẫu bằng NaClO, chúng tôi rửa mẫu bằng ethanol 70% trong 3 phút để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của NaClO, sau đó mẫu mới được rửa bằng NaClO theo các nồng độ và thời gian như bảng 6. Sau khi lắc bằng ethanol 70% trong 3 phút thì rửa lại mẫu 1 lần với nước cất và tiếp tục lắc mẫu với NaClO, cuối cùng mẫu được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (5-6 lần). Dùng dao và panh tách lớp vỏ của hạt và cấy lên môi trường MS trong 2-3 ngày. Tỷ lệ mẫu sống và sạch khuẩn, nấm trong môi trường MS là các chỉ tiêu đánh giá kết quả khử trùng. Bảng 6. Nồng độ và thời gian khử trùng của Ethanol và NaClO Ethanol Nồng độ (%) 70 Thời gian (phút) 3 NaClO Nồng độ (%) 10 12,5 15 20 Thời gian (phút) 5 10 13,5 5 10 13,5 5 10 13,5 5 10 13,5 Sau hai tuần, kết quả theo dõi được như ở bảng 7 với tổng số mẫu đã làm với từng thí nghiệm về thời gian và nồng độ là 120 mẫu. Bảng 7. Kết quả thí nghiệm thử nồng độ và thời gian khử trùng Hóa chất Nồng độ khử trùng (%) Thời gian (phút) Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ chết (%) Tỷ lệ sống (%) NaClO 10 5 37,2 25,7 37,1 10 19,5 39,7 40,8 13,5 12,4 25,8 61,8 12,5 5 43,2 12,8 44,0 10 24,7 25,3 50,0 13,5 8,4 9,5 82,1 15 5 23,9 24,8 51,3 10 18,4 15,7 65,9 13,5 3,9 8,6 87,5 20 5 4,2 46,5 49,3 10 0,08 83,4 16.52 13,5 0,0 95 5 Kết quả thí nghiệm (bảng 6 và 7) cho thấy: Nồng độ và thời gian khử trùng của NaClO tỷ lệ nghịch với tỷ lệ nhiễm, nhưng tỷ lệ thuận với tỷ lệ chết của mẫu. Nhìn vào bảng 7 thấy rằng: Ở nồng độ 20% với thời gian 10 và 13,5 phút tỷ lệ nhiễm của mẫu là rất ít hoặc tuyệt đối không nhiễm, tuy nhiên tỷ lệ chết của mẫu lại rất cao. Vì vậy, ở nồng độ NaClO 20% gây độc với mẫu. Ở nồng độ 15% và thời gian 13,5 phút tỷ lệ nhiễm của mẫu là thấp nhất, tỷ lệ sống là cao nhất và tỷ lệ chết của mẫu là phù hơp. Ở nồng độ 10% và 12,5% tỷ lệ nhiễm cao dẫn đến tỷ lệ mẫu chết cao do nồng độ này chưa đủ để khử sạch vi khuẩn của hạt. Từ đây rút ra phương thức khử trùng thích hơp nhất của giống đậu tương ĐT26 là : Ethanol 70% trong 3 phút và NaClO 15% trong 13,5 phút. Sau 2 ngày, 87,5% mẫu sống sạch nảy mầm bình thường, khỏe mạnh. 3.2. Chuyển gen gus vào đậu tương Sau khi thu được nguồn vật liệu ban đầu vô trùng chúng tôi bắt đầu thực hiện các thí nghiệm tối ưu để xây dựng quy trình chuyển gen vào đậu tương ĐT26. Chúng tôi sử dụng vector pCAMBIA1301 mang gen gus là gen chỉ thị sàng lọc, gen kháng ka là gen chỉ thị chọn lọc vi khuẩn và gen kháng hygromycin là gen chỉ thị chọn lọc thực vật. Vì vậy, để xây dựng quy trình chuyển gen cần dựa vào tần số chuyển gen chính là số lượng mẫu có biểu hiện gus tạm thời trên tổng số mẫu sử dụng trong thí nghiệm. Gen gus là gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ huyển sang màu xanh chàm đặc trưng. Vị trí được chọn làm đích lây nhiễm là nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt theo nghiên cứu của Xue R.G. et al. [31] và Tran Thi Cuc Hoa et al. [35]. 3.2.1. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26 Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng 2 chủng A.tumefaciens là AGL1 và GV3101 để lây nhiễm với mẫu, với đích lây nhiễm là nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt nảy mầm 2-3 ngày tuổi. Tiến hành lây nhiễm vi khuẩn và mẫu trong 60 phút. Sau đó, đồng nuôi cấy trên môi trường C2 trong 5 ngày, rồi đem nhuộm X-gluc ở 370C trong 48 h. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 8 và hình 9 cho thấy: Biểu hiện của ĐT26 sau khi cho lây nhiễm lần lượt với 2 chủng vi khuẩn A.tumefaciens là AGL1 và GV3103 là khác nhau. Đối với AGL1, hạt phát triển tốt, khỏe mạnh tỷ lệ sống cao. Còn đối với GV3101 thì hạt có tỷ lệ sống thấp. Tần số chuyển gen khi sử dụng AGL1 là 18,67%, cao hơn nhiều so với GV3101 là 2%, thể hiện ở sự biểu hiện gen gus tạm thời bằng cách nhuộm mẫu bằng X-Gluc. Bảng 8. Kết quả biểu hiện của ĐT26 đối với các chủng vi khuẩn A.tumefaciens Chủng vi khuẩn Biểu hiện ở ĐT26 Tổng mẫu dương tính Tổng số mẫu Tần số biến nạp (%) AGL1 +++ 56 200 18,67 GV3101 + 2 200 2 Ghi chú: (+++) biểu hiện tốt: hạt phát triển khỏe mạnh, tỷ lệ sống cao > 70%. (++) biểu hiện bình thường: tỷ lệ sống từ 30-70%. (+) biểu hiện kém: tỷ lệ chết cao, hạt phát triển kém < 30%. Hình 9. Biểu hiện gus ở thí nghiệm xác định chủng vi khuẩn A.tumefaciens Ghi chú: (A)- Chủng AGL1; (B)-Chủng GV3101 - Sau khi nhuộm X-gluc chúng tôi thu được hình ảnh như hình 9 với vị trí biểu hiện gus theo mũi tên, đối với chủng AGL1 sức sống của mẫu sau biến nạp là rất tốt, biểu hiện gus rõ ràng. Còn đối với chủng GV3101 thấy rằng sức sống của mẫu hầu hết là kém, biểu hiện gus không rõ. - Vậy xác định được chủng vi khuẩn thích hợp hơn dùng để biến nạp vào giống đậu tương ĐT26 là AGL1 để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quangdung của dịch khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26. Mật độ vi khuẩn (OD dịch khuẩn) là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến tỷ lệ sống và tần số chuyển gen của mẫu. Nếu như mật độ vi khuẩn quá thấp dẫn đến xác suất xâm nhập vào chuyển gen vào hệ gen thực vật thấp, nếu mật độ vi khuẩn quá cao gây thường sẽ gây chết tế bào thực vật giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển gen bền vững. Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành thử nghiệm với các OD dịch khuẩn khác nhau là 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 của chủng vi khuẩn AGL1. Đồng nuôi cấy mẫu sau lây nhiễm trên môi trường C2 trong 5 ngày. Kết quả thu được như ở bảng 9 và hình 10 với tổng số mẫu ứng với từng thí nghiệm là 120. Bảng 9. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26 OD Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) Tần số chuyển gen (%) 0,0 85,9 14,1 0,0 0,2 83,5 16,5 1,67 0,4 84 16 3,3 0,6 83,2 16,8 10 0,8 84,6 15,4 10,3 1,0 81,6 18,4 9,8 1,2 67,4 22,6 4,5 1,4 62 38 2,1 Hình 10. Ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) đến tần số chuyển gen và tỷ lệ mẫu sống Nhìn vào bảng 9 và hình 10 thấy rằng: mật độ vi khuẩn (OD) ảnh hưởng rõ rệt đến tần số chuyển gen cũng như tỷ lệ sống của mẫu. Khi theo dõi thí nghiệm chúng tôi thấy, OD dịch khuẩn quá thấp dẫn đến tần số biến nạp thấp do lượng khuẩn không đủ, còn nếu OD quá cao sẽ gây chết mẫu mà trong khi tần số biến nạp không cao. Chúng tôi sử dụng OD= 0 làm đối chứng, tần số biến nạp của mẫu là 0%, Ở OD = 0,2 -0,4 tỷ lệ sống của mẫu là rất cao ( >80%), tuy nhiên tần số chuyển gen gus vào mẫu thấp chỉ từ 1,67 – 3,3%. Ở OD= 0,6; 0,8 và 1 chúng tôi thấy rằng: tỷ lệ sống của mẫu cao (> 80%) và có tần số chuyển gen lớn, lần lượt tương ứng là 10%; 10,3% và 9,8%. Tỷ lệ sống và tần số chuyển gen bắt đầu giảm mạnh từ OD = 1,2; 1,4. Với tỷ lệ sống lần lượt là 67,4% và 62% và tần số chuyển gen tương ứng là 4,5% và 2,1%. Như vây, OD dịch khuẩn thích hợp nhất cho quá trình chuyển gen đậu tương giống ĐT26 là dao động trong từ 0,6-1,0. Ở trong khoảng OD này, chúng tôi thu được tỷ lệ sống và tần số chuyển gen của mẫu cao. 3.2.3. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu suất chuyển gen gus vào ĐT26. Trong thí nghiệm này, chúng tôi thử nghiệm thời gian lây nhiễm giữa vi khuẩn và mẫu đến khả năng nhận gen gus của mẫu. Thời gian lây nhiễm cũng là một trong nhân tố có ảnh hưởng lớn đến khả năng xâm nhập và chuyển gen của vi khuẩn. Sử dụng mẫu với 1 lá mầm kèm theo nốt lá mầm làm đích để chuyển gen, mẫu được ngâm với C1 trước khi cho lây nhiễm với vi khuẩn. Sử dụng vi khuẩn AGL1 với OD = 0,8 đã được tối ưu ở các thí nghiệm trên và cho vi khuẩn lây nhiễm bằng cách tiếp xúc trực tiếp là ngâm mẫu trong dung dịch vi khuẩn AGL1 theo các thời gian là 30, 45, 60, và 90 phút. Sau đó đồng nuôi cấy trên môi trường C2 trong 5 ngày rồi nhuộm X-gluc ở 370C trong 48h. Quan sát mẫu đã được xử lý với dung dịch X-gluc, thấy rằng ở phần trụ dưới lá mầm có màu xanh chàm đặc trưng, chứng tỏ có là sự biểu hiện tạm thời của gen gus trong mẫu. Kết quả của thử nghiệm thời gian biến nạp ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen gus: Bảng 10. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp Thời gian biến nạp (phút) Số mẫu chết Số mẫu sống Số mẫu chuyển gen thành công Tổng số mẫu Tần số chuyển gen (%) 30 30 (15%) 170 (85%) 11 200 5,5 45 33 (16,5%) 167 (83,5%) 14 200 7 60 39 (19,5%) 161 (80,5%) 24 200 12 90 65 (32,5%) 135 (67,5%) 17 200 8,5 Hình 11. Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến tỷ lệ mẫu sống và tần số chuyển gen Hình 12. Đậu tương ĐT26 với thời gian biến nạp Ghi chú: (A) – 30 phút; (B) – 45 phút; (C) – 60 phút; (D)- 90 phút Quan sát kết quả (hình 11, 12 và bảng 10), thấy rằng: Với thời gian biến nạp là 30 và 45 phút có tỷ lệ mẫu sống lại cao hơn (85% và 83,5%) nhưng tần số chuyển gen là thấp, chỉ có 5,5% và 7%; còn ở thời gian biến nạp là 60 phút thì mặc dù có tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp là thấp hơn so với thời gian biến nạp là 30 và 45 phút là 80,5% nhưng thấp hơn không đáng kể, quan trọng là với thời gian lây nhiễm giữa vi khuẩn với mẫu là 60 phút thì thu được kết quả là tần số chuyển gen cao nhất là 12%. Với 90 phút, tỷ lệ sống và tần số chuyển gen của mẫu bắt đầu giảm mạnh so với 60 phút là do thời gian lây nhiễm quá dài. Thêm nữa, quan sát mẫu thấy rằng ở thời gian biến nap là 60 phút thì mẫu khỏe, đảm bảo được khả năng sống sót sau chuyển gen và đến bước tiếp theo để tạo cây chuyển gen. Còn ở thời gian biến nạp là 30 và 45 phút thì quan sát thấy mẫu cũng khỏe, nhưng tần số chuyển gen ở 2 thời gian này thấp hơn với thời gian 60 phút nhiều, còn ở 90 phút thì mẫu có sức sống và tần số biến nạp thấp. Vì vậy, thời gian biến nạp thích hợp nhất với chủng AGL1 dòng đậu tương ĐT26 là 60 phút. 3.2.4. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26 Sự tiếp xúc của A.tumefaciens với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã. Trong quá trình nay một chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là AS, chất này được coi là chất dẫn dụ A.tumefaciens nhận biết vị trí bị tổn thương và xâm nhập vào tế bào thực vật ở vị trí đó. Theo nguyên tắc trên, ở thí nghiệm này chúng tôi sử dụng phương pháp làm tổn thương nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt đậu tương bằng kim. Sử dụng mẫu là nửa hạt đậu tương với nốt lá mầm đã nảy mầm 2-3 ngày, chủng vi khuẩn AGL1 có OD =0,8. Trước khi cho lây nhiễm vi khuẩn với mẫu trong 60 phút, mẫu bị làm tổn thương bằng cách dùng kim đâm trực tiếp vào vị trí nốt lá mầm với độ sâu khoảng 0,2 – 0,5mm. Sau lây nhiễm đem đồng nuôi cấy trên môi trường C2 trong 5 ngày rồi nhuộm X-gluc ở 370C trong 48h. Ở thí nghiệm này trước khi nhuộm X-gluc, dùng dao cắt bỏ phần lá mầm, chỉ giữ lại phần nốt lá mầm và 1 ít trụ dưới lá mầm. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy thu được kết quả như ở bảng 11, hình 13 và 14 Bảng 11. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp Phương thức biến nạp Số mẫu chết Số mẫu sống Số mẫu chuyển gen thành công Tổng số mẫu Tần số chuyển gen (%) Sử dụng kim 47 (23,5%) 153 (76,5%) 41 200 20,5 Không sử dụng kim 29 (14,5%) 171 (85,5%) 25 200 12,5 Hình 13. Đậu tương ĐT26 sau thí nghiệm sử dụng kim gây tổn thương nốt lá mầm Ghi chú : (A) – không sử dụng kim; (B) – có sử dụng kim. Hình 14. Ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt đến tỷ lệ sống và tần số chuyển gen Quan sát hình 13, 14 và bảng số liệu 11, chúng tôi thấy rằng: Tần số chuyển gen khi sử dụng kim là rất cao (20,5%) gần gấp đôi với khi không sử dụng kim (12,5%), tuy rằng tỷ lệ sống của mẫu khi sử dụng kim thấp hơn nhưng thấp hơn không đáng kể. Từ đó thấy rằng việc sử dụng kim làm tổn thương nốt lá mầm của hạt trước khi biến nạp mang lại hiệu quả chuyển gen rất cao. Hiện nay với phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm trước khi thực hiện quá trình lây nhiễm đã thu được những kết quả nhất định trong nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương. Paz et al. đã sử dụng phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm và chọn lọc bằng glufosinat với giống Willams 79 và Williams 82 thu được tần số chuyển gen là 2 – 6,3% [26]. Zeng et al. cũng đã xây dựng quy trình chuyển gen thông qua A.tumefaciens vào giống Williams 82 bằng phương pháp nốt lá mầm cho tần số chuyển gen là 0,1-5,9% [38]. Xue R.G. et al. sử dụng hệ thống kim gây tổn thương nốt lá mầm của nửa hạt, sau đó cho lây nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens chủng LBA4404 mang vector pGB chứa gen bar (gen kháng phosphinothricin) và gen sgfp ( protein huỳnh quang xanh) đã thu được hiệu quả chuyển gen là 8,9-15,1% [31]. Liu et al. sử dụng A.tumefaciens làm trung gian và sử dụng phương pháp nốt lá mầm, chọn lọc bằng hygromycin với 5 giống đậu tương Trung Quốc thu được hiệu quả biến nạp là 3,8-11,7%[25]. Ở Việt Nam, đã có nghiên cứu của Trần Thị Cúc Hòa với các giống Williams, Maverick, MTĐ 176, Kl202 cũng sử dụng phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm của nửa hạt và chọn lọc bằng glufosinat thu được tần số chuyển gen là 1-5% [7]. Như vậy, tần số chuyển gen vào đậu tương thông qua A.tumefaciens và sử dụng phương pháp nốt lá mầm đem lại hiệu quả cao, ngày càng có những cải tiến để hiệu quả chuyển gen cao hơn. 3.2.5. Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen Từ các thí nghiệm từ 1-5, chúng tôi đã xây dựng được thành công quy trình tái sinh sau chuyển gen của giống đậu tương ĐT26. Khử trùng hạt với ethanol 70% trong 3 phút và NaClO 15% trong 13,5 phút (hình 15a), sau đó dùng dao tách bỏ lớp vỏ hạt và cấy trên môi trường MS trong 2-3 ngày (như ở hình 15b). Sau 2-3 ngày nảy mầm, dùng dao cắt bỏ 1 lá mầm của hạt chỉ giữ lại 1 lá mầm kèm theo nốt lá mầm. Dùng kim đâm vào vị trí nốt lá mầm của hạt với độ sâu 0,2-0,5mm, tiếp tục bỏ vào dung dịch C1 trong 30 phút, rùi chuyển sang dịch khuẩn AGL1 có OD = 0,8 với thời gian 60 phút. Tiếp tục cấy vào môi trường C2, để đồng nuôi cấy trong 5 ngày (hình 15c). Sau đồng nuôi cấy chuyển lên môi trường tái sinh và chọn lọc C3 trong 8 ngày (hình 15d). Tiếp tục chuyển sang môi trường nhân chồi C4 trong 21 ngày (hình 15e), rồi chuyển sang môi trường nhân chồi C5 cho đến khi chồi dài 3-5cm (hình 15f). Tiếp đó là môi trường ra rễ C5 cho đến khi mẫu ra rễ đủ khả năng sống ngoài đất (hình 15g). Cuối là chuyển cây ra môi trường đất (hình 15h). (a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình 15. Các bước xây dựng quy trình tái sinh đậu tương sau chuyển gen Ghi chú: (a) – khử trùng hạt; (b)- hạt nảy mầm trong MS; (c)- đồng nuôi cẫy trong C2; (d)- chọn lọc trong C3; (e)- nhân chồi; (f)- kéo dài chồi; (g)-mẫu trong môi trường ra rễ; (h)- chuyển cây ra đất Với tổng số mẫu ban đầu sử dụng là 300 mẫu, sau quy trình tái sinh kéo dài trong 3 tháng kết quả chúng tôi thu lại được số cây sau khi kết thúc từng giai đoạn là: nảy mầm 255 cây; đồng nuôi cấy 252 cây; tái sinh và chọn lọc 204 cây; nhân chồi 143 cây; kéo dài chồi 109 cây; ra rễ 83 cây; ra cây 56 cây; chuyển thành công ra đất 21 cây; số cây sống sót còn lại sau 1 thời gian chuyển ra đất là 2 cây. Và thu được số chồi nhân lên từ từng chồi là 2-4 chồi. Như vậy, sau khi tiến hành quy trình chuyển gen chúng tôi thu được: - Hệ số nhân chồi 366/143 = 2,56 lần. - Tỷ lệ cây chuyển ra đất thành công là 2/300 = 6,7x10-3 hay 0,67% Với hệ số nhân chồi 0,33 lần, tỷ lệ chồi ra rễ là 27,7%, tỷ lệ chuyển cây ra đất thành công là 0,67%, chứng tỏ rằng chúng tôi đã tái sinh thành công đậu tương ĐT26 sau khi thực hiện quy trình chuyển gen. So sánh với các thử nghiệm đã thành công khác như Olhoft P. M. et al. đã tiến hành tiến hành thí nghiệm với giống đậu tương Bert sử dụng phương pháp nốt lá mầm và chọn lọc bằng hygromycin thu được hệ số nhân chồi là 187/82 = 2,28 lần [30]. Tran Thi Cuc Hoa et al. với giống đậu tương PC18 sử dụng phương pháp nốt lá mầm thu được kết quả là từ 1 chồi tạo được trung bình 3 chồi, tức là hệ số nhân chồi trung bình là 3 lần [35]. Với 2 cây chuyển ra đất thành công chuẩn bị để làm các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.6. Thí nghiệm 7: Tách ADN và phân tích cây chuyển gen ♦ Thí nghiệm 7.1: Tách ADN từ lá cây đậu tương chuyển gen T0 Sử dụng ADN đã được tách chiết từ lá, đem điện di trên gel agarose 0,8% thu được băng điện di như hình 16. Hình 16. Điện di ADN tổng số tách từ lá cây thí nghiệm Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm tách có độ tinh sạch khá cao, không bị đứt gãy nhiều, đủ tin cậy để thực hiện các thí nghiệm về sau. ♦ Thí nghiệm 7.2: Thử hygromycin với mẫu lá cây chuyển gen T0 và PCR mẫu ADN đã tách từ thí nghiệm 7.1 Hình 17. Ảnh hưởng của hygromycin khi thử nghiệmvới mẫu lá cây thí nghiệm và cây đối chứng Ghi chú: 1; 2; 3- Mẫu cây đối chứng 4-9 : mẫu cây chuyển gen T0 Tiến hành thí nghiệm thử hygromycin với mẫu lá cây đậu tương đã qua quy trình chuyển gen và chuyển ra đất thành công, đem khử trùng bằng ethnol 70% và NaClO 15%, rửa với nước cất khử trùng 4-5 lần. Sau đó, đem cấy mẫu trong MS có bổ sung hygromycin 50mg/l trong 7 ngày. Sau 7 ngày, chúng tôi đã quan sát thấy sự biểu hiện của mẫu cây thí nghiệm và cây đối chứng ở hình 17. Quan sát hình 17 thấy rằng: Ở mẫu lá cây thí nghiệm sau 7 ngày cấy trên môi trường MS có hygromycin 50 mg/l, chúng tôi quan sát thấy mẫu vẫn có màu xanh, còn mẫu đối chứng có hiện tượng chuyển sang màu vàng. Điều này chứng tỏ rằng trong mẫu lá cây thí nghiệm có thể đã có chứa gen kháng hygromycin. 1768 bp Hình 18. Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen gus Ghi chú: M: marker 1: mẫu đối chứng (+) 2-3: mẫu ADN từ lá 2 cây T0 Kết quả phân tích với cặp mồi gus cho thấy, mẫu ADN tổng số từ lá 2 cây chuyển gen T0 không biểu hiện dương tính với cặp mồi đặc hiệu cho gen gus. Điều này có thể do điều kiện thực hiện thí nghiệm hoặc số lượng mẫu chưa đủ lớn, nhưng vì điều kiện thời gian không cho phép, chúng tôi dừng lại ở kết quả này. Như vậy, trong khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng gen gus làm chỉ thị sàng lọc và để thống kê số mẫu có biểu hiện dương tính với gus, từ đó tính được tần số chuyển gen vào giống ĐT26. Chúng tôi đã thực hiện 4 thí nghiệm có liên quan đến việc thử nghiệm gus, và đã thu được tần số chuyển gen dao động từ 12-20,5%, tuy rằng khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của gen gus [1]. Nhưng kết quả này đã tạo ra được thành công nhất định trong quá trình thử nghiệm chuyển gen vào đậu tương nói chung và các giống đậu tương Việt Nam nói riêng. Từ kết quả này, có thể ứng dụng xây dựng vector mang gen đích và chuyển vào đậu tương thông qua A.tumefaciens sử dụng phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm của hạt, hứa hẹn những thành tựu mới trong tương lai. Chương IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Dựa trên kết quả thu được từ thí nghiệm, chúng tôi rút ra những kết luận sau: Sử dụng NaClO 15% với thời gian 13,5 phút để khử trùng mẫu, tạo vật liệu khởi đầu cho quá trình chuyển gen vào đậu tương. Trước khi khử trùng bằng NaClO rửa mẫu với ethanol 70% trong 3 phút để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập cho NaClO. Phương pháp này cho hiệu quả khử trùng cao, không độc cho mẫu với tỷ lệ mẫu sống là 87,5%. Đã xây dựng được quy trình chuyển gen vào đậu tương giống ĐT26 sau chuyển gen gus có sử dụng phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt với chủng khuẩn sử dụng là AGL1 có OD=0,6-1,0. Thời gian lây nhiễm là 60 phút. Đã thu được tần số biểu hiện gen gus tạm thời khá cao từ 12-20,3%. Thí nghiệm phân tích cây chuyển gen cho thấy sự có mặt của gen hpt II trong lá của cây chuyển gen T0 qua kết quả thử hygromycin với lá cây chuyển gen T0. Thí nghiệm PCR ADN tổng số từ lá với mồi gus có biểu hiện âm tính, điều này ngược lại với khẳng định trên. Đề nghị Tiếp tục cải thiện biểu hiện gus trong dòng đậu tương ĐT26 bằng cách bổ sung các chất làm tăng hiệu quả chuyển gen như L-cystein, DTT, Natri thiosunfat. Làm lại thí nghiệm PCR với ADN tổng số từ lá cây chuyển gen T0, để khẳng định lại sự có mặt có gen gus. Hoàn thiện quy trình chuyển gen đích vào dòng ĐT26 như gen kháng hạn, kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ,… Thử nghiệm quy trình này với các giống đậu tương Việt Nam và các giống nước ngoài khác. Nghiên cứu tạo ra cây đậu tương chuyển gen và sử dụng làm giống trồng trên diện tích rộng. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen (động vật, thực vật), NXB ĐH Huế, Huế. 2. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây Đậu tương, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 3. Nguyễn Thúy Điệp, Kiều Thị Dung, Đặng Minh Trang, Lê Việt Chung, Đặng Trọng Lương, Trương Thị Thanh Mai (2005), “Kết quả nghiên cứu ban đầu về khả năng tái sinh của một số giống đậu tương phục vụ kỹ thuật chuyển gen”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 20, tr. 35-38. 4. Nguyễn Thị Hiền và Vũ Thy Thư (2004), Hóa Sinh học, NXB Đại học Sư phạm, Hà Nội. 5. Trần Thị Cúc Hòa (2007), “Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển gen của các giống đậu tương trồng ở Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 18, tr. 9-14. 6. Trần Thị Cúc Hòa (2008), “Hiệu quả tạo dòng đậu tương biến đổi gen từ giống MTĐ 176, KL202, Maverick và William 82 bằng phương pháp nốt lá mầm qua trung gian Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 1, tr. 14-19. 7. Trần Thị Cúc Hòa (2008), “Tối ưu hóa quá trình chuyển gen đậu tương bằng cải tiến phương pháp lây nhiễm với Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 9, tr. 8-11. 8. Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Xuân Tài, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà (2005), “Chuyển gen gus vào cây bông thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Hội Nghị Khoa học Toàn Quốc 2005 Công nghệ Sinh học trong nghiên cứu cơ bản, Hà Nội 12/2005, tr. 293-296. 9. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Thu (2007), “Chuyển gen gus vào đỉnh phôi hạt chín giống đậu tương ĐT12 thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 4, tr. 471-478. 10. Phạm Gia Thiều (2006), Kỹ thuật trồng và chế biến sản phẩm cây đậu tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 11. Tổng cục thống kê (2010), Niên giám thống kê 2009, NXB Thống kê, Hà Nội. 12. Trung tâm thông tin PTNNNT-Viện chính sách và chiến lược PTNNNT-Bộ Nông nghiệp & PTNT (2010), Bản tin tháng 3/2010 ngành hàng lương thực, Bộ NN&PPNT, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh 13. Bayer CropScience (2009), “Bayer CropScience expands Global R&D activities in seeds and traits by setting up new research focus area in cereals”, Bayer Crop Science July 21, 2009. 14. Carlson R. (2009), “The Market Value of GM Products”, Nature Biotechnology, 27, p. 984. 15. Cheng M., Lowe B.A., Spencer T.M., Ye X.D. and Armstrong C.L., (2004), "Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species", In Vitro Cellular and Developmental. Biology-Plant, 40(1), pp. 31-45. 16. Doyle J.J. and Doyle J.L. (1987), “A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissues”, Phytochemical Bulletin,19, pp. 11-15. 17. FAOSTAT (2009), Agricultural data, available from: 18. Frame B.R., McMurray J.M., Fonger T.M., Main M.L., Taylor K.W., Torney F.J., Paz M.M., Wang K. (2006), “Improved Agrobacterium mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system”, Plant Cell Rep, 129, pp. 13-22. 19. Hymowitz T. and Newell C.A. (1981), “Taxonomy of the genus Glycine domestication and uses of soybeans”, Economic Botany, 35, pp.272-288. 20. ISAAA (2009) ISAAA Celebrates the Life of its Founding Patron, Nobel Peace Laureate Dr. Norman E. Borlaug (1914-2009), ISAAA Brochure available at: 21. Karami O. (2008), “Factors affecting Agrobacterium mediated transformation of plants”, Transgenic Plant Journal, 2, pp. 127-137. 22. Karami O., Ashari E.M., Karami K.G. and Aghavaisi B. (2009), “Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: the role of host”, Biologia Plantarum, 53(2), pp. 201-212. 23. Li D., Chen P., Alloatti J., Shi A. and Chen Y. F. (2010), “Identification of New Alleles for Resistance to Soybean Mosaic Virus in Soybean”, Published in Crop Science, 50, pp. 649-655. 24. Liu J.Y., Cheng Y.Q. and Li J.A. (2009), “Optimization of soybean (Glycine max (L.) Merrill) in planta ovary transformation using a linear minimal gus gene cassette”, Plant Cell, 10(12), pp. 870-876. 25. Liu S.J., Wei Z.M., Huang J.Q. (2008), “The effect of co-cultivation and selection parameters on Agrobacterium-mediated transformation of Chinese soybean varieties”, Plant Cell Rep, 28, pp. 489-498. 26. Paz M.M., Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K. B. & Wang K. (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica, 136, pp. 167-169. 27. Paz M.M., Martinez J.C., Andrea B.K., Fonger T.M, Wang K. (2006), “ Improved colyledonary node method using an alterative explant derived from mature seed for effcient Agrobacterium-mediated soybean transformation ”, Plant Cell Rep, 25, pp. 206-213. 28. Alimohammadi M. and Bagherieh M.B. (2009), “Agrobactrium-mediated transformation of plants: Basic principles and influencing factors”, African Journal of Biotechnology Vol. 8 (20), pp. 5142-5148. 29. Olhoft P.M & Somers D.A. (2001), "L-Cysteine increases Agrobacterium-mediated T-DNA delivery into soybean cotylendonary-node cells”, Plant Cell Rep, 20, pp.706-711. 30. Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A, (2003), "Efficient soybean transformation using hygromycine B selection in the cotylendonary-node method", Planta, 216, pp. 723-735. 31. Xue R. G., Xie H.F., Zhang B. (2006), “A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells”, Biotechnol Lett, 28, pp. 1551-1557. 32. Stachel S.E., Nester E.W., and Zambryski P. (1986), “A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression”, Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 83, pp: 379 – 383. 33. Sunikumar G., Rathore K.S., (2001), “Transgenic cotton: factors influencing Agrobacterium-mediated transformation and regeneration", Molecular Breed, 8, pp. 37-52. 34. Suryadevara S.R., Lewamy M., Matt M., Raghuveer P., Prachuab K. and David H. (2009), “Non-antibiotic selection systems for soybean somatic embryos: the lysine analog aminoethyl-cystein as a selection agent”, BMC Biotechnology, 94, pp.1472-1489. 35. Tran Thi Cuc Hoa, Tran Vu Hai and La Cao Thang (2008), “Transformation efficiencies of the Soybean Variety PC 19 [Glycine max (L.) Merrill] using Agrobacterium tumefaciens and the cotyledonary node method”, Omorice, 16, pp. 1-8. 36. USDA National Agriculture Statistics Service (NASS) 2009a. Adoption of Genetically Engineered Crops in the. 2009. National Agriculture Statistics. 37. Wang M.B., Waterhouse P. M. (1997), “A rapid and simple method of assaying plants transformation with Hygromycin or PPT resistance”, Plant Molecular Biology Reporter, 15, pp. 209-215. 38. Wei D. and Zhi-ming W. (2007), “An optimized Agrobacterium-mediated transformation for soybean for expression of binary insect resistance genes”, Plant Science, 173(4), pp. 381-389. 39. Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C. (2004), “Refined glufosinate selection in Agrobacterim-mediated transformation of soybean (Glycine max (L.) Merrill)”, Plant Cell Rep, 22, pp. 478-482. 40. Zhang W., Subbarao S., Addae P., Shen A., Armstrong C.L., Peschke V., Gilbertson L., (2003), "Cre/lox mediated marker gene excision in transgenic maize (Zea mays L.) plants", TAG Theoretical and Applied Genetics, 107, pp. 1157-1168. 41. PHỤ LỤC 1. Môi trường MS (PH=5,6-5,8) Bảng 12. môi trường MS (PH=5,6-5,8) STT Thành phần (g/l) Lượng lấy (ml) 1 KNO3 1900 20 2 NH4NO3 1650 20 3 KH2PO4 170 10 4 MgSO4.7H2O 370 10 5 CaCl2.2H2O 440 10 6 FeSO4.7H2O Na2EDTA 27,8 37,3 10 7 (B5 Minor) H3BO3 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O KI Na2MoO4.2H2O CuSO4 CoCl2.6H2O 0,3 0,76 0,2 0,075 0,025 0,0025 0,0025 10 8 (B5 Vitamins) Myo-inositol Nicotinic acid Pyridoxin-HCl Thiamin-HCl 10 0,1 0,1 1 20 2. Môi trường LB (PH = 7) Bảng 13. Môi trường LB (PH = 7) Thành phần g/l Pepton (trypton) 10 Yeast extract 5 NaCl 10 3. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu Bảng 14. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu Môi trường Thành phần Tác dụng Ghi chú C1 PH= 5,4-5,6 ½ MS salts; B5 vitamins; BAP 1mg/l; L-cystein 1g/l (*); Sucrose 30g/l ; AS 0,1mM (*) Sử dụng để rửa mẫu trước khi chuyển gen và dùng để nuôi vi khuẩn A.tumefaciens C2 PH= 5,6-5,8 ½ MS salts; B5 vitamins; BAP 1mg/l; L-cystein 1g/l (*); Sucrose 30g/l ; AS 0,1mM (*); Agar 13g/l Dùng để đồng nuôi cấy mẫu chuyển gen với vi khuẩn A.tumefaciens Nuôi 5 ngày trong tối à chuyển sang C3 C3 PH= 5,6-5,8 ½ MS salts; B5 vitamins; BAP 1mg/l; Sucrose 30g/l; Kanamycin 200mg/l (*); Agar 13g/l. Dùng để tái sinh mẫu chuyển gen sau khi đồng nuôi cấy Nảy mầm 8 ngày ở 260C, 18h/6 sáng tối. à chuyển sang C4 C4 PH= 5,8 ½ MS salts; B5 vitamins; BAP 1,5 mg/l; Sucrose 30g/l; Kanamycin 200mg/l (*); Agar 13g/l. Dùng để nhân chồi từ mẫu chuyển gen Nuôi 21 ngày à chuyển sang C5 C5 PH= 5,8 ½ MS salts; B5 vitamins; BAP 1,5 mg/l; Sucrose 30g/l; GA 0,5mg/l; IBA 0,1mg/l; Kanamycin 200mg/l (*); Hygromycin 200mg/l (*); Agar 13g/l. Kéo dài chồi và chọn lọc thực vật Nuôi đến khi nào chồi dài 3-5cm thì chuyển sang C6 C6 PH=5,8 ½ MS salts; B5 vitamins; Sucrose 30g/l; IBA 1,5mg/l; BAP 0,5mg/l; Agar 13g/l. Kích thích mẫu ra rễ Đến khi mẫu ra rễ khỏe mạnh thì chuyển ra đất Ghi chú: (*) – lọc qua màng lọc và bổ sung sau khu khử trùng môi trường.