Xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn escherichia coli gây tiêu chảy ở dê tại Thái Nguyên - Đặng Thị Mai Lan

Đặng Thị Mai Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 99 - 104 99 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở DÊ TẠI THÁI NGUYÊN Đặng Thị Mai Lan1, Đoàn Kiều Hưng2 1Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên 2 Trung tâm Giống vật nuôi - Thái Nguyên TÓM TẮT Vi khuẩn E.coli là một trong những nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy cho gia súc trong đó có dê. Bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế cho người chăn nuôi làm giảm số lượng và chất lượng gia súc nói chung cũng như dê nói riêng. Mục đích của nghiên cứu này nhằm cung cấp thông tin về các yếu tố gây bệnh, tính mẫn cảm với một số loại thuốc kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn E.coli. Từ 96 mẫu phân thu thập được từ dê bình thường và 96 mẫu phân từ dê tiêu chảy đã phân lập được ở dê bình thường 56 chủng E.coli chiếm tỷ lệ 58,33%; dê tiêu chảy có 89 chủng E.coli chiếm tỷ lệ 92,71%. Vi khuẩn E.coli phân lập có khả năng gây dung huyết mạnh trên môi trường thạch máu với các kiểu dung huyết khác nhau và có độc lực cao trên chuột thí nghiệm, gây chết 100% chuột trong vòng 16-48h. Các chủng vi khuẩn E.coli phân lập đều mẫn cảm với Enrofloxacin; Oxytetracyclin và Kanamycin. Từ khóa: Bệnh tiêu chảy, Hội chứng tiêu chảy, vi khuẩn E.coli, dê. ĐẶT VẤN ĐỀ* Dê là loài gia súc đã được nuôi từ lâu đời. Chăn nuôi dê đã đem lại lợi ích thiết thực cho đời sống của con người như: cung cấp phân bón cho trồng trọt và sản phẩm phụ cho ngành nông nghiệp chế biến, đặc biệt thịt và sữa là hai loại thực phẩm quý có giá trị dinh dưỡng cao. Tuy nhiên, chăn nuôi dê cũng gặp không ít khó khăn, đặc biệt với thời tiết khí hậu nước ta thì quá trình chăm sóc nuôi dưỡng cũng vấp phải không ít những trở ngại. Trong đó dịch bệnh vẫn đang là một yếu tố gây thiệt hại kinh tế lớn nhất cho chăn nuôi, tiêu biểu là bệnh tiêu chảy do trực khuẩn E.coli gây nên. Bệnh khó phòng và gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi. Dê dễ mắc bệnh, nếu điều trị không kịp thời sẽ dẫn đến tử vong hoặc sống sẽ còi cọc, chậm lớn, ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi và gây thiệt hại lớn đến nền kinh tế. Trên cơ sở đó để xác định đặc điểm dịch tễ, các yếu tố gây bệnh và khả năng mẫn cảm với các loại thuốc kháng sinh và hóa dược nhằm xây dựng phác đồ điều trị bệnh thích hợp cho * Tel: 0912975021, Email: landangmaiorchiddhtn@gmail.com dê bị bệnh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm góp phần bổ sung cơ sở khoa học và thực tiễn giúp các nhà khoa học và các nhà chăn nuôi có những biện pháp thích hợp để khống chế dịch bệnh, góp phần tăng năng suất chăn nuôi. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dê ở các lứa tuổi nuôi tại Thái Nguyên. Vi khuẩn E.coli gây bệnh tiêu chảy ở dê. Phân và bệnh phẩm của dê ốm, chết được mổ khám Phương pháp nuôi cấy, phân lập và giám định theo quy trình thường quy của Viện Thú y Quốc gia - Hà Nội. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli từ dê tiêu chảy và dê bình thường Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli từ phân dê nuôi trên địa bàn nghiên cứu Chúng tôi đã tiến hành lấy các mẫu phân từ dê nuôi tại 6 huyện, thị trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên để tiến hành kiểm tra vi khuẩn học bằng cách lấy phân trong trực tràng của những con dê bình thường và dê bị mắc bệnh tiêu chảy đem nuôi cấy và phân lập vi khuẩn, kết quả được trình bày qua bảng 1: Đặng Thị Mai Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 99 - 104 100 Bảng 1. Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli từ phân dê khoẻ và dê bị tiêu chảy Địa điểm Số mẫu kiểm tra Dê bình thường Dê tiêu chảy n (+) (%) n (+) (%) Phú Lương 18 10 55,56 16 94,44 Đại Từ 29 18 62,07 27 93,13 Định Hoá 20 11 55,00 18 90,00 Đồng Hỷ 14 9 64,29 13 92,86 Sông Công 9 5 55,56 9 100,0 Phổ Yên 6 3 50,00 6 100,0 Tính chung 96 56 58,33 96 89 Bảng 2. Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli từ phủ tạng của dê chết do tiêu chảy Nguồn gốc mẫu Kết quả Số mẫu kiểm tra (n) E.coli n (+) (%) n (-) (%) Ruột non 9 9 100,0 0 0 Ruột già 9 8 100,0 0 0 Gan 9 6 66,67 3 33,33 Hạch ruột 9 8 88,89 1 11,11 Lách 9 4 44,44 5 55,56 Máu tim 9 6 66,67 3 33,33 Tính chung 54 41 75,93 13 24,07 Kết quả bảng 1 cho thấy từ 96 mẫu phân thu thập được từ dê bình thường và 96 mẫu phân từ dê tiêu chảy, chúng tôi đã phân lập được ở dê bình thường 56 chủng E.coli chiếm tỷ lệ 58,33 và 89 chủng E.coli ở dê tiêu chảy chiếm tỷ lệ 92,71%. Trong đó đối với dê tiêu chảy thì huyện có số mẫu dương tính với E.coli cao nhất là thị xã Sông Công và huyện Phổ Yên chiếm 100%, huyện Phú Lương chiếm 94,44%. Các huyện khác có số mẫu dương tính dao động từ 90,00 - 93,13%. Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli từ phủ tạng của dê chết do tiêu chảy Trong quá trình mổ khám chúng tôi đã tập trung lấy mẫu là các cơ quan phủ tạng dê để xét nghiệm, phân lập vi khuẩn E.coli xác định rõ nguyên nhân gây bệnh và sự phân bố của chúng trong một số cơ quan phủ tạng của dê bị tiêu chảy. Kết quả được trình bày ở bảng 2: Chúng tôi đã mổ khám và thu thập 54 mẫu từ dê ở các lứa tuổi khác nhau kết quả thể hiện ở bảng 2 như sau: khi dê bị bệnh tiêu chảy thì tất cả các cơ quan phủ tạng (ruột non, ruột già, gan, hạch ruột, lách, máu tim) đều xác định được sự có mặt của vi khuẩn E.coli nhưng với tỷ lệ khác nhau, tỷ lệ phân lập được vi khuẩn E.coli cao nhất ở ruột non và ruột già 9/9 mẫu có chiếm 100%; 8/9 mẫu ở hạch ruột chiếm 88,89%. Kết quả xác định số lượng vi khuẩn E. coli trong phân dê bệnh và dê bình thường Chúng tôi đã nghiên cứu xác định số lượng vi khuẩn ở hai trạng thái của dê bình thường và dê mắc bệnh tiêu chảy để làm cơ sở cho việc xác định rõ hơn về vai trò của căn nguyên gây ra bệnh. Kết quả bảng 3 cho thấy trong đường ruột của dê khoẻ số vi khuẩn E.coli trung bình/gram phân là 38,94 triệu vi khuẩn và biến động cao nhất là ở Đại Từ 40,36 triệu; thấp nhất ở Định Hoá là 37,18 triệu VK/gram phân. Đặng Thị Mai Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 99 - 104 101 Bảng 3. Biến động số lượng vi khuẩn E. coli trong phân dê tiêu chảy và dê bình thường Huyện, thị Dê tiêu chảy Dê bình thường Tăng tiêu chảy/bình thường Pα < a&b Số mẫu kiểm tra (n) SLVK/gr (x106) Số mẫu kiểm tra (n) SLVK/gr (x106) SLVK/gr (x106) Tỷ lệ (%) Phú Lương 18 86,54 18 39,14 47,40 221,10 0,001 Đại Từ 29 89,67 29 40,36 49,31 222,17 0,001 Định Hoá 20 86,25 20 37,18 49,07 220,13 0,001 Đồng Hỷ 14 87,89 14 38,63 49,26 227,52 0,001 Sông Công 9 85,32 9 39,27 48,05 217,26 0,001 Phổ Yên 6 85,84 6 39,09 47,75 219,59 0,001 Tính chung 96 86,92 96 38,94 48,47 221,29 - Bảng 4. Đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ dê tiêu chảy Ký hiệu chủng VK Số chủng VK Lactoza Saccaroza Galactoza H2S MR Indol n(+) (%) n(+) (%) n(+) (%) n(+) (%) n(+) (%) n(+) (%) PL 11 11 100,0 9 81,82 10 90,90 0 0 11 100,0 11 100,0 ĐT 23 23 100,0 21 91,30 21 91,30 0 0 23 100,0 23 100,0 ĐH1 14 14 100,0 13 92,86 11 78,57 0 0 14 100,0 14 100,0 ĐH2 8 8 100,0 8 100,0 8 100,0 0 0 8 100,0 8 100,0 SC 5 5 100,0 4 80,00 5 100,0 0 0 5 100,0 5 100,0 PY 5 5 100,0 4 80,00 4 80,00 0 0 5 100,0 5 100,0 Tính chung 66 66 100,0 59 89,39 59 89,39 0 0 66 100,0 66 100,0 Khi dê mắc bệnh tiêu chảy thì 100% mẫu phân lập cho kết quả dương tính xác định được vi khuẩn E.coli với số lượng khá lớn, trung bình số vi khuẩn/gram phân là 86,92 triệu. So sánh về số lượng vi khuẩn trong phân dê tiêu chảy và phân dê bình thường ta thấy số lượng vi khuẩn trong phân dê tiêu chảy ít nhất tăng gấp đôi số lượng vi khuẩn trong phân dê bình thường. Kết quả giám định đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập từ dê tiêu chảy Sau khi tiến hành giám định các đặc điểm về hình thái và nuôi cấy trên môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu, MacConkey... của các chủng vi khuẩn phân lập được. Chúng tôi đã thu được kết quả trình bày ở bảng 4. Bảng 4 cho thấy các chủng vi khuẩn E.coli phân lập được hầu hết lên men với 3 loại đường dùng trong phản ứng. Trong đó lên men đường Lactoza chiếm tỷ lệ cao nhất là 100%; tiếp theo là đuờng Saccaroza và Galactoza chiếm 89,39%. Vi khuẩn E.coli không có phản ứng sinh H2S nhưng có phản ứng MR và Indol là 100%. Kết quả xác định yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli Tác động của độc tố có khả năng gây dung huyết, phá huỷ hồng cầu, có thể gây nhiễm độc huyết và gây hoại tử đường tiêu hoá cho dê. Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và xác định các yếu tố gây bệnh cho 89 mẫu khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch máu từ các bệnh phẩm khác nhau ở dê tiêu chảy sau 24h nuôi cấy ở 370C kết quả thu được như sau: Đặng Thị Mai Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 99 - 104 102 Bảng 5. Xác định khả năng dung huyết của các chủng E. coli phân lập Ký hiệu chủng VK Số chủng kiểm tra Kiểu dung huyết α β Không dung huyết n (+) (%) n (+) (%) n (+) (%) PL 18 9 50,00 4 22,22 5 27,78 ĐT 20 7 35,00 6 30,00 7 35,00 ĐH1 18 9 50,00 5 27,78 4 22,22 ĐH2 15 5 33,33 7 46,67 3 20,00 SC 8 5 62,50 2 25,00 1 12,50 PY 10 5 50,00 2 20,00 3 30,00 Tính chung 89 40 44,94 26 29,21 23 25,84 Bảng 6. Kết quả xác định độc lực của các chủng E. coli phân lập trên chuột bạch Ký hiệu chủng VK Liều tiêm (ml) Đường tiêm Số chuột tiêm (con) Số chuột đối chứng (con) Kết quả theo dõi Phân lập lại VK Số chuột chết (con) Tỷ lệ chết (%) Thời gian chết (h) PL 0,2 Pm 3 1 3 100,0 24-48 + ĐT 0,2 Pm 3 1 3 100,0 18-24 + ĐH1 0,2 Pm 3 1 3 100,0 24-48 + ĐH2 0,2 Pm 3 1 3 100,0 18-24 + SC 0,2 Pm 3 1 3 100,0 18-24 + PY 0,2 Pm 3 1 3 100,0 16-48 + Tính chung 0,2 Pm 18 6 18 100,0 16-48 + Kết quả xác định khả năng gây dung huyết của các chủng E. coli phân lập Kết quả cho thấy tất cả các địa phương đều có các chủng E.coli có khả năng gây dung huyết điều đó chứng tỏ các chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh cho dê tại Thái Nguyên có độc lực cao. Trong tổng số 89 chủng E.coli kiểm tra dung huyết thì có 66/89 chủng dung huyết chiếm 74,15% và chủng không dung huyết có 23 chủng chiếm 25,84%. Kết quả xác định độc lực vi khuẩn phân lập được Chúng tôi chọn 6 mẫu E.coli điển hình phân lập từ dê khỏe và dê tiêu chảy tiêm cho chuột thí nghiệm để tiến hành kiểm tra độc lực. Trong thời gian theo dõi nếu chuột chết tiến hành mổ khám, kiểm tra bệnh tích và lấy bệnh phẩm để phân lập lại vi khuẩn. Kết quả được trình bày ở bảng 6: Bảng 6 cho thấy, cả 6 chủng E.coli được chọn đều có độc lực mạnh, giết chết chuột dễ dàng, tỷ lệ chết chiếm 100%. Thời gian giết chuột sau tiêm nằm trong khoảng từ 16-48 giờ. Sau khi chuột chết, mổ khám kiểm tra bệnh tích thấy rằng chuột chết do tiêm canh trùng E.coli có bệnh tích điển hình của bệnh do E.coli như bụng chướng to, phổi viêm xuất huyết bề mặt, gan sưng tụ huyết, xuất huyết ruột, cơ tim và mỡ vành tim, khi lấy máu tim nuôi cấy trên môi trường phân lập lại vi khuẩn đều phát hiện được vi khuẩn đã tiêm thuần khiết. Kết quả xác định tính mẫn cảm của các chủng vi khuẩn phân lập được với một số loại kháng sinh và hoá dược Sau khi phân lập được các chủng vi khuẩn từ các mẫu phân và bệnh phẩm, chúng tôi tiến hành thử kháng sinh đồ với mục đích kiểm tra xem loại kháng sinh nào mẫn cảm nhất, đồng nghĩa với việc sử dụng loại kháng sinh có hiệu quả nhất trong điều trị. Kết quả thể hiện ở bảng 7: Đặng Thị Mai Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 99 - 104 103 Bảng 7. Kết quả xác định sự mẫn cảm của các chủng E. coli phân lập được với kháng sinh và hoá dược Loại kháng sinh Số chủng thử Mức độ mẫn cảm Mẫn cảm Mẫn cảm TB Kháng thuốc n (%) n (%) n (%) Neomycin 17 7 41,18 6 35,29 4 23,53 Kanamycin 17 9 52,94 5 29,41 3 17,65 Enrofloxacin 17 12 70,59 2 11,76 3 17,65 Oxytetracyclin 17 10 58,82 2 11,76 5 29,41 Penicilin 17 0 0 2 11,76 15 88,24 Tetracyclin 17 5 29,41 8 47,06 4 23,53 Ampicillin 17 3 17,65 12 70,59 2 11,76 Streptomycin 17 2 11,76 3 17,65 12 70,59 Kết quả ở bảng 7 cho thấy: các chủng E.coli có mức độ mẫn cảm thuốc như sau: - Mức mẫn cảm: có 70,59% chủng vi khuẩn mẫn cảm với Enrofloxacin; 58,82% với Oxytetracyclin; 52,94% với Kanamycin; các chủng thử này mẫn cảm với các loại kháng sinh khác Neomycin, Tetracyclin, Ampicillin, Streptomycin lần lượt là 41,18%; 29,41%; 17,65%; 11,76%. - Mức độ mẫn cảm trung bình: có 70,59% chủng được thử mẫn cảm với Ampicillin; 47,06% với Tetracyclin.... thấp nhất là Enrofloxacin, Oxytetracyclin và Penicillin có 11,76% chủng vi khuẩn mẫn cảm. - Khả năng kháng thuốc: Ngoài những kết quả thu được về độ mẫn cảm của các chủng E.coli phân lập được ở trên, kết quả kiểm tra còn cho thấy khả năng kháng thuốc của vi khuẩn E.coli với một số loại kháng sinh khá cao. Cụ thể: có 88,24% chủng vi khuẩn được thử đã kháng lại với Penicillin; 70,59% chủng kháng với Streptomycin. KẾT LUẬN - Tỷ lệ phân lập được E.coli ở dê khoẻ và dê tiêu chảy khác nhau. Dê khoẻ tỷ lệ phân lập được E.coli là (58,33%), dê tiêu chảy là (92,71%). Dê bị tiêu chảy tỷ lệ phân lập được vi khuẩn E.coli cao nhất ở ruột non, ruột già chiếm (100%). - Dê khoẻ có 38,94 triệu VK E.coli/gram phân, dê mắc bệnh tiêu chảy có 86,92 triệu VK E.coli/gram phân. - Các chủng vi khuẩn E.coli phân lập được mang đầy đủ những đặc điểm về hình thái nuôi cấy và đặc tính sinh hoá mà các tài liệu trong và ngoài nước đã mô tả. - Vi khuẩn E.coli phân lập có khả năng gây dung huyết mạnh trên môi trường thạch máu với các kiểu dung huyết khác nhau. - Vi khuẩn E.coli phân lập có độc lực cao trên chuột thí nghiệm, gây chết 100% chuột trong vòng 16-48h. - Các chủng vi khuẩn E.coli phân lập đều mẫn cảm với Enrofloxacin; Oxytetracyclin và Kanamycin. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Đặng Xuân Bình, Trần Thị Hạnh (2001), “Xác định vai trò của E.coli và Clostridium perfringens đối với bệnh tiêu chảy ở lợn con”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y tập XIII (3), tr.19-23. [2]. Trần Thị Hạnh, Kiều Thị Dung, Lưu Quỳnh Hương, Đặng Xuân Bình (2000), “Xác định vai trò của E.coli và C.perfringens đối với bệnh ỉa chảy ở lợn con và bước đầu nghiên cứu một số sinh phẩm phòng bệnh”, Kết quả nghiên cứu KHKT Thú y (1996-2000), Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 190-199. [3]. Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh, Đỗ Ngọc Thuý (2000). “Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập được và biện pháp phòng trị”, Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y, 1996 - 2000, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr.171 - 176. Đặng Thị Mai Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 99 - 104 104 [4]. Trương Quang (2005), “Kết quả nghiên cứu vai trò gây bệnh của E.coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn 1-60 ngày tuổi”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y tập XII (1), tr.27-32. [5]. Phạm Thế Sơn, Lê Văn Tạo, Cù Hữu Phú, Phạm Khắc Hiếu (2008), “Đặc tính của vi khuẩn E.coli, Salmonella, C.perfringens gây bệnh lợn con tiêu chảy”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y tập XV (1), tr.73-77. [6]. Võ Thành Thìn, Lê Đình Hải, Vũ Khắc Hùng (2010), “Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập từ lợn con mắc bệnh tiêu chảy”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y tập XVII (5), tr.5-10. [7]. Cadman H, Kelly P, Zhou R, Davelaar F and Mason P (1994), A serosurvey using enzyme- linked immunosorbent assay for antibodies against poultry pathogens in ostriches (Struthio camelus) from Zimbabwe. Avian Diseases, pp.621-625. [8]. Uzal F.A, Kelley W.R (1998), Enterotoxaemia in goats, Vet Res Comun, 20 (6), pp. 481-492. [9]. Smith, H.W., Halls, S. (1967), "The transmissible nature of the genetic factor in E. coli that controls hemolysin production", J.Gen.Microbiol., (47), pp. 153 -161. SUMMARY SOME FACTORS DETERMINING THE DISEASE CAUSED BY BACTERIA ESCHERICHIA COLI CAUSE DIARRHOEA IN GOAT IN THAI NGUYEN Dang Thi Mai Lan1*, Doan Kieu Hung2 1College of Agriculture and Forestry - TNU 2 Thai Nguyen Center for Domestic animals E. coli is one of the causes of diarrhoea for livestock including goats. Disease causing huge economic losses to farmers to reduce the quantity and quality of livestock in general as well as particular goat. The purpose of this study was to provide information on the factors that cause disease, susceptibility to some antibiotics and pharmaceutical E. coli. From the 96 samples collected from normal goats and 96 diarrheal stool samples from goats were isolated in normal goat 56 strains of E. coli accounting for 58.33%; goat diarrhoea, 89 strains of E. coli accountedrate of 92.71%. E. coli isolates have the ability to build strong blood on blood agar with different blood content types and highly virulent in mice, the mouse 100% lethal within 16-48h. The strain of E. coli isolates were susceptible to Enrofloxacin; Oxytetracycline and Kanamycin. Key words: Diarrhoea, diarrhoea syndrome, E. coli, and goats. Ngày nhận bài:10/9/ 2012, ngày phản biện: 17/9/ 2012, ngày duyệt đăng: 10/10/2012 * Tel: 0912975021, Email: landangmaiorchiddhtn@gmail.com