Xác định độc lực và quá trình cảm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm (Lates calcarifer)

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 3 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VÀ QUÁ TRÌNH CẢM NHIỄM CỦA VI KHUẨN Streptococcus iniae VÀO CÁ CHẼM (Lates calcarifer) INVESTIGATION FOR THE VIRULENCE AND THE ROUTE OF INFECTION OF Streptococcus iniae IN BARRAMUNDI (Lates calcarifer) Trần Vĩ Hích1, Nguyễn Hữu Dũng2 Ngày nhận bài: 24/10/2012; Ngày phản biện thông qua: 27/11/2012; Ngày duyệt đăng: 15/5/2013 TÓM TẮT Việc ứng dụng kĩ thuật mô hóa miễn dịch đã làm sáng tỏ cách cảm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cơ thể cá chẽm khi ngâm cá vào môi trường có chứa 107 CFU/mL vi khuẩn (tương ứng với liều gây chết 50%). Kết quả thí nghiệm cho thấy sau 6 giờ thí nghiệm, vi khuẩn S. iniae đã được phát hiện ở mang cá. Sau 12 giờ thí nghiệm, vi khuẩn đã xâm nhập vào lách và thận. Sự xâm nhập của vi khuẩn vào mô ruột, mắt, não và gan chỉ xảy ra sau khi lách và thận cá đã bị vi khuẩn cảm nhiễm với số lượng lớn. Kết quả này chứng tỏ vi khuẩn S. iniae tồn tại trong môi trường xâm nhập vào cơ thể cá chẽm qua mang và gây cảm nhiễm hệ thống. Từ khóa: Barramundi, S.iniae, con đường cảm nhiễm ABTRACT The application of immunohistochemistry technique has allowed to investigate the mode of infection of Streptococcus niae in barramundi. A bacterial dose of 107CFU/mL corresponding to the LD50 delivered to barramundi through bath exposure in 1 hour. The results showed that S. iniae was detected fi rst in gill of fi sh at 6 hours after challenge (HAC). 12 HAC the bacteria was detected at spleen and kidney of fi sh. The infection of S. iniae in the tissue of the intestine, eye, brain and liver was only revealed after the spleen and kidney were infected seriously. It is suggested that S. iniae infections in barramundi are systemic infections. The bacteria entered through the gill to cause the disease. Key words: Barramundi, S. iniae, route of infection 1 ThS. Trần Vĩ Hích: Khoa Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang 2 TS. Nguyễn Hữu Dũng: Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh thủy sản - Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Thành công của những mô hình thử nghiệm nuôi cá chẽm ở các ao nuôi tôm hoang hóa đã khẳng định cá chẽm là đối tượng nuôi mang lại hiệu quả kinh tế cao. Đặc biệt, từ năm 2005, khi cá chẽm phi lê đã tìm được thị trường xuất khẩu, nghề nuôi cá chẽm đã phát triển nhanh chóng ở các tỉnh Khánh Hòa, Cà Mau, Bến tre... và đưa Việt Nam trở thành một nước xuất khẩu cá chẽm. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của nghề nuôi cá chẽm, dịch bệnh cũng đã bắt đầu xuất hiện trên đối tượng này và gây ra những thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi, đặc biệt là dịch bệnh do S.iniae gây ra. S.iniae được tìm thấy lần đầu tiên ở cá heo nước ngọt (Inia geoffrensis) sau đó vi khuẩn này được tìm thấy ở nhiều loài cá nuôi khác như cá rô phi Oreochromis niloticus × O. aureus và Tilapia nilotica x T. aureahybrids, cá đù đỏ Sciaenops ocellatus, cá chẽm Lates calcarifer. Dấu hiệu của cá mắc bệnh do S.iniae gây ra khác nhau giữa các loài nhưng thường có một số biểu hiện như bơi mất định hướng, màu sắc cơ thể chuyển sậm, xuất huyết ở thân, gốc vây, lồi mắt. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định con đường cảm nhiễm của vi khuẩn S. iniae từ môi trường vào cá chẽm nuôi. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 4 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Chuẩn bị vi khuẩn Streptococcus iniae Chủng vi khuẩn S.iniae VN091211R phân lập từ cá chẽm Lates calcarifer nuôi trong hệ thống mương nổi ở Khánh Hòa, được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường TSB bổ sung 2% NaCl đặt trong tủ ấm lắc đảo (180rpm) ở nhiệt độ 280C trong 24 giờ. Tế bào vi khuẩn sau khi thu hoạch được rửa 3 lần bằng dụng dịch muối sinh lý đệm phosphate (PBS, pH 7.4) rồi pha loãng trở lại bằng PBS để đạt mật độ 109 CFU/ml. Mật độ vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang bằng máy đo quang phổ () và xác định lại bằng cách nuôi cấy trên đĩa thạch TSA có bổ sung 2% NaCl. 2. Chuẩn bị cá chẽm thí nghiệm Cá chẽm (chiều dài thân 3,8 ± 0,2cm) dùng trong thí nghiệm này được sản xuất và ương nuôi thành cá giống tại Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh thủy sản - Trường Đại học Nha Trang. Khỏe mạnh, không có tiền sử bệnh tật và đã thích nghi với bể nuôi thí nghiệm từ giai đoạn cá hương cho đến khi bắt đầu sử dụng cho hoạt động nghiên cứu. 3. Bố trí thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn Thí nghiệm được bố trí với 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 40 cá chẽm đã được chuẩn bị ở mục 2 nuôi trong bể composite 1000L chứa 500L nước biển có độ mặn 30ppt. Tất cả cá thí nghiệm được ngâm vào các xô chứa 2L nước biển có chứa vi khuẩn S. iniae với mật độ tăng dần từ 103 CFU/mL cho nghiệm thức 1 đến 108 CFU/mL cho nghiệm thức 6 trong 1 giờ trước khi đưa lại bể nuôi 500L. Ở nghiệm thức đối chứng, cá cũng được đưa vào xô chứa 2L nước biển trong 1 giờ trước khi đưa vào bể nuôi. Liều gây chết 50% được xác định vào thời điểm sau 7 ngày kể từ khi cá thí nghiệm dừng chết dựa vào phân tích probit của phần mềm SPSS STATISTICS ver.19. 4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình xâm nhập của vi khuẩn vào cá chẽm Cho 1980ml nước biển (30 ppt) và cho thêm 20ml dịch huyền phù vi khuẩn đã được chuẩn bị ở trên vào xô nhựa 5L, sục khí và đưa 30 cá chẽm đã chuẩn bị như ở trên vào xô, giữ trong 60 phút. Sau đó, đưa cá trở lại nuôi trong nước biển (30 ppt), nhiệt độ từ 28 ± 20C và cho ăn thức ăn dành cho cá chẽm của công ty UP theo nhu cầu của cá. Tiến hành thu mẫu ngẫu nhiên 3 cá vào các thời điểm 6h, 12h, 24h, 48h và 72h sau khi cho cá vào bể nuôi, cố định các mẫu gan, thận, lách, não, mắt và ruột cá trong dung dịch Buffered Formallin 10% trong 24h để nghiên cứu mô học. 5. Kỹ thuật mô hóa miễn dịch Các cơ quan cá chẽm thu thập được xử lý theo phương pháp mô học truyền thống, gắn parafi n và cắt thành những lát mỏng dày 3-6µm. Sau khi loại bỏ parafi n và làm no nước, cho vào hỗn hợp H2O2 và methanol trong 10 phút nhằm bất hoạt men peroxidase nội bào. Khóa các vị trí gắn kết không đặc hiệu bằng cách cho mẫu cần nhuộm vào dung dịch skim milk 3% (w/v) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng (260C) trước khi cho 50 - 100µL kháng thể đơn dòng của chuột kháng S.iniae (mouse anti-Streptococcus iniae, MAbs, AQUATIC Diagnostics Ltd.) lên lát cắt và ủ trong buồng ẩm 60 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa lát cắt 3 lần trong TBS (Tris buffered saline) trước khi cho thêm kháng thể đa dòng của thỏ kháng immunoglobulin của chuột có gắn peroxidase (Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/ HRP, Dako) đã pha loãng trong TSB (1:50) và ủ trong 30 phút. Sau đó hoạt hóa peroxidase horseradish bằng dung dung dịch 3,3’-Diaminobenzidinetetrahy- drochloride (DAB) trong 10 phút. Kết thúc phản ứng hoạt hóa bằng cách rửa lát cắt dưới vòi nước và nhuộm thêm haematocyline trong 4 phút. Sự có mặt của vi khuẩn S. iniae ở lát cắt mô làm mô cá có màu nâu trên nền màu hơi xanh. Cường độ nhiễm khuẩn ở các tổ chức được đánh giá theo 3 mức. +, ++ và +++ tương ứng với tỉ lệ vùng tổ chức nhiễm khuẩn và vùng tổ chức đó (vùng có màu nâu/vùng màu xanh) lần lượt là 10%. Các mẫu mô cá khỏe được sử dụng làm mẫu đối chứng. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Xác định độc lực của chủng vi khuẩn VN091211R. bằng phương pháp ngâm Kết quả thu được từ thí nghiệm cho thấy đàn cá thí nghiệm xảy ra hiện tượng chết từ ngày thứ 2 sau khi cảm nhiễm. Số lượng cá chết tăng mạnh vào ngày thứ 3 và giảm nhiều vào ngày thứ 4, đến ngày thứ 6 thì dừng hẳn (hình 1). Hình 1. Tỉ lệ cá chẽm chết tích lũy sau khi ngâm vào môi trường có chứa vi khuẩn S.iniae với các nồng độ khác nhau Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 5 Hầu hết cá hấp hối đều thể hiện dấu hiệu bơi lội bất thường như mất thăng bằng, nổi đầu hoặc bơi lờ đờ. Các dấu hiệu khác như màu sắc cơ thể chuyển đen sậm, xuất huyết ngoài da, sưng thận cũng được tìm thấy ở cá sau thí nghiệm. Tuy nhiên có nhiều cá chết sau thí nghiệm mà không thể hiện dấu hiệu bệnh lý. Kết quả phân lập vi khuẩn từ cá thí nghiệm cũng thu được vi khuẩn S.iniae thuần khiết ở não, gan và thận cá. Không có bất kỳ hiện tượng chết nào xảy ra ở cá đối chứng. Nồng độ vi khuẩn gây chết 50% khi tắm cá trong 1 giờ được xác định là 106,8 CFU/mL (hình 2). Hình 2. Tương quan giữa nồng độ vi khuẩn S.iniae tiêm vào xoang bụng và tỉ lệ chết tích lũy của các nhóm cá chẽm thí nghiệm 2. Con đường cảm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae ở cá chẽm Kết quả kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn S.iniae ở các cơ quan của cá chẽm sau khi ngâm cá vào môi trường có chứa vi khuẩn S.iniae với mật độ 107CFU/mL trong 1 giờ cho thấy mang cá là nơi xuất hiện vi khuẩn lần đầu tiên (bảng 1). Sau 6 giờ thí nghiệm, có thể phát hiện sự tồn tại của vi khuẩn S.iniae ở tơ so cấp (hình 3A). Trong trường hợp nhiễm nặng, vi khuẩn S.iniae còn được phát hiện ở tơ mang thứ cấp và ở độ phóng đại lớn có thể dễ dàng nhận thấy sự xâm nhập của vi khuẩn S.iniae vào xoang tĩnh mạch (hình 3B). Bảng 1. Thời điểm phát hiện vi khuẩn S.iniae ở các cơ quan của cá chẽm Giờ sau khi ngâm (h) Mang Gan Thận Lách Não Mắt Ruột 6 + - - - - - - 12 +++ - ++ ++ - - - 24 +++ + +++ +++ + ++ - 48 +++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ 72 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Hình 3. Mang cá chẽm nhuộm mô hóa miễn dịch với vi khuẩn ở mang sơ cấp, mang thứ cấp và xoang tĩnh mạch mang (SL: mang thứ cấp; PL: mang sơ cấp; VS: xoang tĩnh mạch; C: tế bào sụn) Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 6 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Thận và lách là 2 cơ quan nội quan đầu tiên mà vi khuẩn S.iniae đến cảm nhiễm. Tại thời điểm 12h sau khi cảm nhiễm, vi khuẩn S.iniae đã xuất hiện ở thận và lách với mật độ cao. Lúc đầu, vi khuẩn chỉ được phát hiện ở mô kẽ quanh ống thận (hình 4A) tại thời điểm này cấu trúc ống thận chưa có sự thay đổi. Nhưng ở những mẫu thận nhiễm vi khuẩn S.iniae với mật độ cao, vi khuẩn tấn công vào bên trong ống thận, phá hủy mô tạo máu, gây hoại tử và để lại những thương tổn nặng nề cho tổ chức thận (hình 4B). Hình 4. Thận cá chẽm nhiễm S.iniae nhuộm mô hóa miễn dịch Sự hiện diện của S.iniae ở gan, não và mắt cũng được nhận biết bằng phương pháp mô hóa miễn dịch (hình 5). Kết quả thí nghiệm cho biết thời điểm vi khuẩn S.iniae xâm nhập vào gan, não và mắt tương đương nhau. Sau 24 giờ thí nghiệm vi khuẩn mới hiện diện ở các cơ quan này và mật độ vi khuẩn tiếp tục tăng cao ở 48 giờ tiếp theo. Mặt dù không thấy sự khác biệt về vị trí xâm nhập của vi khuẩn ở gan và não cá nhưng ở mắt, vị trí ưa thích của vi khuẩn S.iniae có lẽ là tầng ngoài của võng mạc mắt. Quá trình cảm nhiễm vào ruột của vi khuẩn S.iniae hình như tốn nhiều thời gian hơn. Phải sau 24 giờ mới phát hiện được sự có mặt của vi khuẩn này ở ruột cá. Hình 5. Một số cơ quan cá chẽm nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae sau khi nhuộm mô hóa miễn dịch (A: gan; B,C: lách; D: não; E: võng mạc; F: ruột) B D Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 7 3. Thảo luận Dấu hiệu bệnh lý của cá mắc nhiễm vi khuẩn S.iniae đã được báo cáo ở nhiều loài cá khác nhau. Những tổn thương về mô học do vi khuẩn S.iniae gây ra khác nhau giữa các loài và điều kiện môi trường khác nhau. Ở thí nghiệm này, cá ít thể hiện dấu hiệu bệnh lý đặc trưng ra bên ngoài ngoại trừ dấu hiệu bơi mất định hướng. Tuy nhiên điều này đã từng xảy ra ở nhiều nghiên cứu khác. Evans (2000) và các cộng sự cho rằng dấu hiệu bệnh lý của cá nhiễm S.iniae khác nhau tùy thuộc vào cá mắc nhiễm tự nhiên hay cá bị nhiễm trong thí nghiệm và với các phương pháp cảm nhiễm khác nhau thì cá cũng thể hiện dấu hiệu bệnh lý ra bên ngoài khác nhau. So sánh với kết quả thí nghiệm tương tự do Bromage 1999 và Suanyuk 2010 đã tiến hành thì dường như độc lực của chủng vi khuẩn S.iniae phân lập từ cá chẽm bị bệnh ở Khánh Hòa thấp hơn độc lực của chủng vi khuẩn S.iniae phân lập từ cá chẽm nuôi ở Úc (LD50 = 3,2 x 104CFU) và ở Thái Lan (LD50 = 1,08 x 104CFU) (Bromage 1999; Suanyuk 2010). Tuy nhiên, rất khó để có một sự so sánh một cách chính xác về độc lực của các chủng vi khuẩn S.iniae ở nghiên cứu này và các nghiên cứu trước vì ngoài phương thức lây nhiễm, diễn tiến bệnh của cá chẽm còn phụ thuộc nhiều yếu tố khác như kích thước cá, tình trạng sức khỏe của cá hay tác động của các yếu tố môi trường nuôi Kết quả nghiên cứu của Bromage và các cộng sự năm 1999 cho biết sau khi kết thúc thí nghiệm cảm nhiễm, vi khuẩn S.iniae vẫn còn tồn tại ở não của cá chẽm khỏe mạnh. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, không phân lập được vi khuẩn ở bất kì cơ quan nào ở tất cả cá sống sót sau khi cảm nhiễm. Việc nghiên cứu con đường cảm nhiễm của vi khuẩn S.iniae vào cá đã từng được Nguyen thực hiện trên cá bơn (Paralichthys olivaceus) vào năm 2000. Kết quả nghiên cứu của Nguyen cho thấy S.iniae xâm nhập vào cơ thể của cá bơn thông qua những vị trí thương tổn của da và vây. Mắt, mũi và mang cá là nơi vi khuẩn cảm nhiễm sau khi đã vào bên trong cơ thể. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Rasheed & Plumb (1984) trên cá Fundulus grandis cũng như nghiên cứu của Foo và các cộng sự (1985) ở cá Siganus canaliculatus. Tuy nhiên, nghiên cứu của Bromage và Owens (2002) về khả năng cảm nhiễm của vi khuẩn S.iniae thực hiện trên cá chẽm (Lates calcarifer) theo phương pháp ngâm kết hợp với việc gây tổn thương da cá bằng cách lấy đi 1cm2 vảy cá chẽm đã chứng minh rằng những thương tổn trên da của cá không có tác động gì đến khả năng xâm nhập của vi khuẩn S.iniae vào cơ thể cá. Kết quả kiểm tra quá trình xâm nhập của vi khuẩn S.iniae từ môi trường nuôi vào cơ thể cá chẽm bằng phương pháp mô hóa miễn dịch cho thấy mang là vị trí mà vi khuẩn xâm nhập đầu tiên. Sau 6 giờ thí nghiệm, vi khuẩn đã xuất hiện ở mang sơ cấp sau đó xâm nhập vào xoang tĩnh mạch. Thận và lách là 2 cơ quan vi khuẩn hướng đến trước khi cảm nhiễm vào gan, mắt và não và sau đó là ruột. Kết quả này phù hợp với nhận định của Nguyen 2000 về quá trình phân tán của vi khuẩn S.iniae trong cơ thể cá. Vi khuẩn đi theo các mạch máu vào thận, lách của cá sau đó lại theo máu và xâm nhập vào các cơ quan khác. Tuy nhiên, trong kết quả này, vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá qua mang chứ không phải qua những tổn thương ở vây như nghiên cứu của Nguyen 2000. IV. KẾT LUẬN Vi khuẩn S.iniae VN091211R là tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho cá chẽm. Liều gây chết 50% khi ngâm cá trong 1 giờ được xác định là 106,8CFU/mL. Vi khuẩn S.iniae VN091211R xâm nhập từ nước vào cơ thể cá chẽm qua mang theo máu đến thận, lách sau đó lại theo máu xâm nhập đến các cơ quan khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Agnew W. and Barnes A.C. (2007) Streptococcus iniae: an aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Veterinary Microbiology, 122:1-15. 2. AL-Harbi A.H. (1994) First isolation of Streptococcus sp. from hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. aureus) in Saudi Arabia. Aquaculture, 128:195-201. 3. Bromage E. and Owens L. (2002) Effect of the route of exposure with Streptococcus iniae to infection of barramundi Lates calcarifer. Diseases of Aquatic Organisms, 52(3):199-205. 4. Bromage E.S., Thomas A. and Owens L. (1999) Streptococcus iniae, a bacterial infection in barramundi Lates Calcarifer. Disease of aquatic organisms, 36:177-181. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 8 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 5. Colorni A., Diamant A., Eldar A., Kvitt H. and Zlotkin A. (2002) Streptococcus iniae infections in Red Sea cage-cultured and wild fi shes. Diseases of Aquati c Organisms, 49:165-170. 6. Creeper J. and Buller N. (2006) An outbreak of Streptococcus iniae in barramundi (Lates calcarifer) in freshwater cage culture. Australian Veterinary Journal, 84:408-411. 7. Eldar A., Perl S., Frelier P.F. and Bercovier H. (1999) Red drum Sciaenops ocellatus mortalities associated with Streptococcus iniae infection. Disease of aquatic organism, 36:121-127. 8. Evans J.J., Shoemaker C.A. and Klesius P.H. (2000) Experimental Streptococcus iniae infection of hybrid striped bass (Morone chrysops x Morone saxatilis) and tilapia (Oreochromis niloticus) by nares inoculation. Aquaculture, 189(3-4): 97-210. 9. Foo J.T.W., Ho B. and Lam T.J. (1985) Mass mortality in Siganus canaliculatus due to streptococcal infection. Aquaculture, 49:185-195. 10. Nguyen T.H., 2000, Study on the infection mechanism of Streptococcus iniae in Japanese fl ounder (Paralichthys olivaceus) [Doctor of phisolophy in marine science]. Nagasaki University; 123 p. 11. Perera R.P., Johnson S.K., Collins M.D. and Lewis D.H. (1994) Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica x T. aureahybrids. Journal of Aquatic Animal Health, 6:335-340. 12. Pier G. B. and Madin S. H. (1976) Streptococcus iniae sp. nov., a beta-hemolytic treptococcus isolated from an Amazon freshwater dolphin, Inia geoffrensis. International Journal of Systematic Bacteriology, 26:545- 553. 13. Rasheed V. and Plumb J. (1984) Pathogenicity of a non-haemolytic group B Streptococcus sp. in gulf killifi sh (Fundulus grandis Baird and Girard). Aquaculture, 37:97-105. 14. Suanyuk N., Sukkasame N., Tanmark N., Yoshida T, Itami T., Thune R.L., Tantikitti C. and Supamattaya K. (2010) Streptococcus iniae infection in cultured Asian sea bass (Lates calcarifer) and red tilapia (Oreochromis sp.) in southern Thailand. Songklanakarin Journal of Science and Technology, 32 (4):341-348.