Xác định Clamate trong các loại thực phẩm chế biến bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - Lê Thị Hoài My

Tạp chí Khoa học và Giáo dục, Trường Đại học Sư phạm Huế ISSN 1859-1612, Số 01(33)/2015: tr. 103-110 XÁC ĐỊNH CYCLAMATE TRONG CÁC LOẠI THỰC PHẨM CHẾ BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LÊ THỊ HOÀI MY NGÔ VĂN TỨ - PHẠM YÊN KHANG Trường Đại học Sư phạm - Đại học Huế Tóm tắt: Bài báo này mô tả phương pháp xác định hàm lượng cyclamate trong các loại thực phẩm chế biến bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Độ tin cậy của phương pháp được đánh giá qua giới hạn phát hiện, độ thu hồi và độ lặp lại. Với quy trình phân tích và điều kiện sắc ký thích hợp đã được lựa chọn, giới hạn phát hiện của phương pháp đối với cyclamate là 0,221 ppm; độ lặp lại và độ thu hồi tốt. Phương pháp đã được áp dụng để định lượng cyclamate trong một số mẫu thực phẩm chế biến ở Thừa Thiên Huế. Từ khóa: cyclamate, thực phẩm chế biến, chất ngọt tổng hợp, sắc ký lỏng hiệu năng cao 1. MỞ ĐẦU Chất ngọt tổng hợp (hay chất tạo ngọt) là phụ gia thực phẩm không phải là đường có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng với mục đích tạo vị ngọt cho thực phẩm [2]. Ngày nay, chúng được sử dụng khá phổ biến trong công nghệ chế biến và bảo quản thực phẩm. Trong đó, người ta thường dùng cyclamate để làm tăng độ ngọt của sản phẩm vì độ ngọt của nó lớn hơn 30 – 40 lần độ ngọt của saccarozơ; ngoài ra, cyclamate còn có tính bền nhiệt và chỉ bị phân hủy ở nhiệt độ khá cao 280 – 500oC, thuận lợi cho quá trình chế biến thực phẩm [5]. Việc sử dụng cyclamate với hàm lượng vượt giới hạn tối đa cho phép so với quy định theo thông tư 27/2012/TT-BYT của Bộ Y tế có thể gây ra một số ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người tiêu dùng [4]. Tuy nhiên, việc nghiên cứu xác định cyclamate có trong các loại thực phẩm chế biến trên thị trường nước ta vẫn còn hạn chế. Phương pháp HPLC là phương pháp hữu hiệu để xác định cyclamate trong thực phẩm [1]. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả xây dựng qui trình phân tích cyclamate bằng phương pháp HPLC và áp dụng qui trình này để định lượng cyclamate trong một số mẫu thực phẩm chế biến ở Thừa Thiên Huế. 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu Series 20A (Nhật Bản) với detector DAD; cột pha đảo: C18 cỡ hạt 5µm, chiều dài 250 mm, đường kính trong 4 mm, của hãng GL Sciences Inc, Nhật Bản; thiết bị lọc nước siêu sạch của hãng Barnstead International, 104 LÊ THỊ HOÀI MY và cs. Mỹ; cân phân tích AUW220D (± 0,10 mg) của hãng Shimadzu, Nhật Bản; máy lắc, máy trộn; thiết bị nghiền nhỏ, đồng nhất mẫu; bộ lọc hút chân không của hãng Gast, Mỹ; - Tất cả hóa chất đều là loại tinh khiết phân tích: metanol (CH3OH) - Merck (Đức); n- heptan (C7H16) - Merck (Đức); natri sunfat (Na2SO4), dạng khan; dung dịch natri cacbonat (Na2CO3) 50 g/L; dung dịch natri hypoclorit (NaClO) 1,7% clo hoạt động); axit sunfuric (H2SO4) - Merck (Đức); Natri cyclamate dùng để pha dung dịch chuẩn của hãng Merck (Đức). Dung dịch Carrez I: Hòa tan trong nước 15,00 g kali hexaxyanoferrat (II) (K4[Fe(CN)6].3H2O) có độ tinh khiết ít nhất 99% khối lượng và thêm nước vào đến 100 mL [1]. Dung dịch Carrez II: Hòa tan trong nước 30,00 g kẽm sunfat (ZnSO4.7H2O) có độ tinh khiết ít nhất 99,5% khối lượng và thêm nước đến 100 mL [1]. 2.2. Quy trình phân tích 2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu Lấy mẫu ngẫu nhiên một số mẫu thực phẩm chế biến trên thị trường Thừa Thiên Huế, bảo quản theo quy định ghi trên nhãn sản phẩm. 2.2.2. Chuẩn bị dung dịch chạy HPLC Dung dịch chuẩn: Cân 898,00 mg natri cyclamate, chính xác đến 0,10 mg, cho vào bình định mức 200 mL và pha loãng bằng nước đến vạch. Dùng pipet lấy 0,25 mL, 1,00 mL, 2,50 mL, 5,00 mL, 10,00 mL và 20,00 mL dung dịch này cho vào bình định mức 100 mL và pha loãng bằng nước đến vạch. Nồng độ natri cyclamate của các dung dịch này là 10 ppm, 40 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 400 ppm và 800 ppm. Tạo dẫn xuất: Để có được dung dịch mẫu chuẩn, lấy 20,00 mL các dung dịch mẫu chuẩn trên cho vào phễu chiết, thêm 1,00 mL axit sunfuric 50%, 10,00 mL n-heptan và 2,50 mL dung dịch natri hypochlorit (1,7% clo hoạt động), và lắc mạnh trong 1 phút. Để tách pha, gạn bỏ lớp nước phía dưới. Làm khô lớp n-heptan bằng 1 g natri sunfat khan và lọc qua giấy lọc, thu được dung dịch mẫu chuẩn. 2.2.3. Xử lý mẫu [1] - Các sản phẩm dạng lỏng và sản phẩm tạo dung dịch trong (ví dụ: nước quả trong, nước muối dưa chuột đã lọc, kẹo cứng,...). - Sản phẩm nửa rắn (ví dụ: sản phẩm sữa, món tráng miệng, nước quả đục, mứt). - Socola và sản phẩm liên quan. - Chất béo dạng nhũ tương và các sản phẩm chứa nhũ tương (ví dụ: mayonnaise). Các loại mẫu trên được xử lý theo quy trình phân tích TCVN 8472:2010 [1]. XÁC ĐỊNH CYCLAMATE TRONG CÁC LOẠI THỰC PHẨM CHẾ BIẾN 105 2.2.4. Phân tích trên hệ thống HPLC - Điều kiện làm việc: cột pha đảo C18 cỡ hạt 5µm, chiều dài 250 mm, đường kính trong 4 mm; detector DAD; bước sóng phát hiện 314 nm; tốc độ dòng pha động 1,5 mL/phút; dung môi pha động là MeOH : H2O = 90 : 10; thể tích tiêm 20 µL [1], [8]. - Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn: khoảng tuyến tính của detector được khảo sát qua các dung dịch chuẩn cyclamate (đã tạo dẫn xuất) có nồng độ 40, 80, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 2000, 4000 ppm, điều kiện sắc ký như trên. Đường chuẩn xác định cyclamate được xây dựng trên cơ sở khảo sát khoảng tuyến tính. - Đánh giá phương pháp qua giới hạn phát hiện, độ lặp lại, độ thu hồi [6], [7]. - Áp dụng quy trình phân tích để xác định cyclamate trong một số mẫu thực phẩm chế biến ở Thừa Thiên Huế. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tính tương thích hệ thống Tiến hành tiêm 5 lần mẫu có nồng độ cyclamate là 40 ppm (đã tạo dẫn xuất) vào hệ thống HPLC ở các điều kiện đã lựa chọn. Kết quả được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Các thông số sắc ký của peak cyclamate (đã tạo dẫn xuất) Nhận xét: - Thời gian lưu trung bình của peak cyclamate (đã tạo dẫn xuất) là 4,821 phút (RSD% = 0,602%) là khoảng thời gian thích hợp cho quá trình phân tích sắc ký. - Diện tích peak trung bình của peak cyclamate (đã tạo dẫn xuất) là 281411 (RSD% = 1,27%) chứng tỏ kết quả thu được rất ổn định. - Số đĩa lý thuyết trung bình là 6036 (RSD% = 1,42%) đạt yêu cầu N > 2000, RSD% < 2%. Những kết quả trên cho thấy hệ thống sắc ký mà chúng tôi tiến hành là phù hợp và đảm bảo sự ổn định cho quá trình định lượng cyclamate. 106 LÊ THỊ HOÀI MY và cs. 3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Khoảng tuyến tính của detector được khảo sát qua các dung dịch chuẩn cyclamate có nồng độ từ: 40, 80, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 2000, 4000 ppm. Kết quả cho thấy detector cho khoảng tuyến tính tốt đối với cyclamate trong khoảng nồng độ 40 – 4000 ppm. Trong khoảng này, đường chuẩn xác định cyclamate có hệ số tương quan R2 đạt 0,9997; với phương trình đường chuẩn là: y = (7187,300 ± 106,723)x + (-131208,505 ± 159078,844) Kết quả được trình bày ở hình 1. Hình 1. Đường chuẩn xác định cyclamate 3.3. Đánh giá phương pháp 3.3.1. Xác định độ lặp lại của phương pháp Tiến hành định lượng cyclamate trong 5 mẫu thử (ô mai) song song theo các điều kiện đã chọn, đo kết quả ba lần, lấy giá trị trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Kết quả khảo sát độ lặp lại XÁC ĐỊNH CYCLAMATE TRONG CÁC LOẠI THỰC PHẨM CHẾ BIẾN 107 Vì RSD (%) ≤ ½ RSDHorwitz nên phương pháp phân tích có độ lặp lại cao, phù hợp để định lượng cyclamate trong mẫu thực phẩm chế biến. 3.3.2. Xác định độ đúng của phương pháp Tiến hành thêm ở ba mức 80%; 100%; 120% lượng chất có sẵn trong 100 mL mẫu chuẩn 300 ppm, ứng với mỗi mức thêm, làm 2 thí nghiệm, đo kết quả ba lần, lấy giá trị trung bình. Kết quả được trình bày trong bảng 3 và 4. Bảng 3. Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu ô mai (n=3) Kiểm tra độ đúng của phương pháp đo, dựa vào giá trị RSDHorwitz. Kết quả tính được cho ở bảng 4. Bảng 4. Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp đo Kết quả ở bảng 3.3 và 3.4 cho thấy: phương pháp đạt được độ đúng tốt với độ thu hồi nằm trong khoảng từ 98,09% - 101,12%, thỏa mãn hàm Horwitz. Chứng tỏ phương pháp phân tích đã chọn là hoàn toàn phù hợp để xác định hàm lượng cyclamate trong các loại thực phẩm chế biến. 3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Để xác định LOD và LOQ của phương pháp, tiến hành phân tích 3 lần lặp lại đối với các dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ: 0,4; 0,8; 4,0; 8,0 ppm. Giá trị LOD, LOQ được xác định theo “quy tắc 3σ” [7]. Kết quả tính toán LOD và LOQ của phương pháp được trình bày qua bảng 5. 108 LÊ THỊ HOÀI MY và cs. Bảng 5. Kết quả xác định LOD và LOQ Như vậy giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp là: LOD = 0,221 ppm, LOQ = 0,738 ppm. 3.4. Xác định cyclamate trong một số mẫu thực phẩm chế biến ở Thừa Thiên Huế Trên cơ sở phương pháp phân tích đã được xây dựng, tiến hành định lượng cyclamate trong 5 mẫu thực tế. Mẫu áp dụng là các mẫu: ruốc thịt lợn, ô mai xí muội, hạt dẻ, hạt hạnh nhân, nước ngọt Coca-Cola, hiện đang lưu hành trên thị trường Thừa Thiên Huế. Kí hiệu mẫu: M1: Ruốc thịt lợn M2: Ô mai xí muội M3: Hạt dẻ M4: Hạt hạnh nhân M5: Nước ngọt Coca-Cola Kết quả hàm lượng cyclamate được trình bày như trong bảng 6, 7 và 8. Bảng 6. Thông tin chi tiết về các mẫu thực phẩm chế biến Bảng 7. Kết quả phân tích các mẫu thực tế bằng phương pháp HPLC Mẫu Hàm lượng (mg/Kg) Trung bình x Độ lệch chuẩn SD (n = 3) Độ tin cậy ε (p = 0,95) Số lần đo 1 2 3 M1 2620,00 2599,00 2625,00 2614,70 13,79 34,27 M2 2110,00 2105,00 2118,00 2111,00 6,55 16,28 M3 117,00 122,00 119,00 119,30 2,51 6,25 M4 108,00 113,00 115,00 112,00 3,60 8,96 M5 < LOD XÁC ĐỊNH CYCLAMATE TRONG CÁC LOẠI THỰC PHẨM CHẾ BIẾN 109 Bảng 8. Kết quả kiểm tra hàm lượng cyclamate Mẫu Mẫu thực phẩm Hàm lượng cyclamate (mg/Kg) Giới hạn cho phép (**) (mg/Kg) Kết quả M1 Ruốc thịt lợn 2614,70 ± 34,27 Không được có Không đạt M2 Ô mai xí muội 2111,00 ± 16,28 1000 Không đạt M3 Hạt dẻ 119,30 ± 6,25 Không được có Không đạt M4 Hạt hạnh nhân 112,00 ± 8,96 Không được có Không đạt M5 Nước ngọt Coca-Cola < LOD 350 Đạt (*) Thông tư 27/2012/TT-BYT : Thông tư hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm [4]. 4. KẾT LUẬN Chúng tôi đã lựa chọn được quy trình phân tích thích hợp để xác định cyclamate trong các loại thực phẩm chế biến bằng phương pháp HPLC và áp dụng phương pháp để phân tích cyclamate trong 5 mẫu thực phẩm chế biến ở Thừa Thiên Huế. Kết quả cho thấy: 4 mẫu có chứa cyclamate với hàm lượng vượt giới hạn cho phép của Bộ Y tế và 1 mẫu không phát hiện cyclamate. Điều đó nói lên rằng, chất tạo ngọt cyclamate đã được sử dụng trong quá trình sản xuất một số loại thực phẩm, các nhà sản xuất đã quá lạm dụng cyclamate nhưng lại thiếu quan tâm đến vấn đề liều lượng. Vì vậy, chúng ta cần phải tăng cường kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, nguyên liệu sản xuất, quy trình sản xuất các loại thực phẩm chế biến có sử dụng chất tạo ngọt nhằm bảo vệ sức khỏe và quyền lợi của người tiêu dùng. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bộ Khoa học và Công nghệ, TCVN 8472:2010, Thực phẩm - Xác định Cyclamate - phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. [2] Bộ Y tế (2010). Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm - Chất ngọt tổng hợp QCVN 4-8:2010/BYT. Hà Nội. [3] Bộ Y tế (2001). Quy định danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm (Ban hành kèm theo Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31/8/2001). Hà Nội. [4] Bộ Y tế (2012), Thông tư hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm, số 27/2012/TT- BYT. Hà Nội. [5] Tôn Nữ Khánh Minh, Trần Ngọc Trường Giang (2009). “Chất tạo ngọt trong thực phẩm”, 123doc.vn, 30/10/2012. [6] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [7] Miller J. C., Miller J. N. (1988). Statistics for Analytical Chemistry, Ellis Horwood Limited, England. [8] Serdar M., Knezevic Z. (2011). “Determination of artificial sweeteners in beverages and special nutrional products using high performance liquid chromatography”, ncbi.nlm.nih.gov, 06/2011. 110 LÊ THỊ HOÀI MY và cs. Tittle: DETERMINATION OF CYCLAMATE IN SOME KIND OF PROCESSED FOODS USING HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Abstract: This article describes the method of determining cyclamate in some kind of processed foods using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). This method was appreciated by means of detection limit, recovery and precision. With the analytical procedure and the working conditions for chromatographic system which was chosen, detection limit of the method for cyclamate was 0.221 ppm; and its recovery and precision might be accepted. This method was applied to determine cyclamate in some food samples in Thua Thien Hue province. Keywords: cyclamate, processed foods, artificial sweetener, High Performance Liquid Chromatography. LÊ THỊ HOÀI MY Học viên Cao học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Huế PGS. TS. NGÔ VĂN TỨ Khoa Hóa học, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Huế ThS. PHẠM YÊN KHANG Khoa Hóa học, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Huế