Ứng dụng đánh dấu sinh học của các chấm lượng tử bán dẫn - Chu Việt Hà

Chu Việt Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 99(11): 151 - 159 151 ỨNG DỤNG ĐÁNH DẤU SINH HỌC CỦA CÁC CHẤM LƯỢNG TỬ BÁN DẪN Chu Việt Hà1, Trần Anh Đức1, Đỗ Thị Duyên1, Vũ Thị Kim Liên1*, Trần Hồng Nhung2 1Trường Đại học Sư phạm – ĐH Thái Nguyên 2Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam TÓM TẮT So sánh với chất màu hữu cơ truyền thống và các protein phát quang tự nhiên, các chấm lượng tử bán dẫn có đặc tính quang học và điện tử độc đáo: có thể điều khiển ánh sáng phát xạ nhờ thay đổi kích thước, phổ phát xạ hẹp và đối xứng ,độ chói cao, thời gian sống phát quang dài và điểm đặc biệt nhất là độ bền quang cao (gấp vài trăm lần so với chất màu hữu cơ), ít bị tẩy quang, và quang phổ hấp thụ rộng dễ kích thích đồng thời của nhiều màu sắc huỳnh quang. Với các tính chất quang lý đó, việc ứng dụng các hạt nano chấm lượng tử bán dẫn phân tán được trong nước để ứng dụng cho mục đích đánh dấu sinh học đã và đang được thực hiện cả trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Các tiến bộ gần đây giúp phát triển thiết bị thăm dò các hạt nano đa chức năng, cho thấy phát xạ của các hạt nano này là rất sáng và ổn định trong điều kiện phức tạp của cơ thể sống. Các chấm lượng tử ứng dụng trong đánh dấu sinh học đã đặt ra khả năng mới cho hình ảnh siêu nhạy và ghép các mục tiêu phân tử trong tế bào sống, các mô động vật và cơ thể con người. Chấm lượng tử hiện nay có rất nhiều ứng dụng trong y-sinh như làm chất đánh dấu hiện ảnh phân tử và tế bào cả in vitro và in vivo, làm các cảm biến sinh học. Bài báo này trình bày tổng quan về các ứng dụng đánh dấu sinh học của các chấm lượng tử trong giai đoạn hiện nay. Từ khóa: chấm lượng tử bán dẫn, đánh dấu sinh học, hạt nano TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤM LƯỢNG TỬ* Các chấm lượng tử kể từ khi được phát hiện, đã dần trở thành các chất dán nhãn huỳnh quang quan trọng dùng trong cảm biến sinh học và hiện ảnh [1]. Các chấm lượng tử là những tinh thể nano bán dẫn bao gồm các nguyên tử của các nguyên tố nhóm II - VI (ví dụ, Cd, Zn, Se, Te) hoặc III-V (ví dụ, In, P, As) trong bảng hệ thống tuần hoàn các nguyên tố hóa học. Các hiệu ứng lượng tử xảy ra khi kích thước tinh thể có thể so sánh với bước sóng de Broglie của điện tử và lỗ trống. Khi đó cả điện tử và lỗ trống đều bị giam giữ và các mức năng lượng của chúng bị lượng tử hóa. Sự giam giữ lượng tử làm gián đoạn các mức năng lượng theo chiều giam giữ và làm thay đổi mật độ trạng thái theo năng lượng. Kết quả là hấp thụ hay phát xạ của các chấm lượng tử phụ thuộc vào kích thước hạt, nghĩa là người ta có thể điều khiển được tính chất quang (ví dụ màu phát xạ huỳnh quang) theo kích thước của các chấm lượng tử. Các chấm lượng tử có phổ hấp thụ rộng, phổ phát xạ hẹp, do đó có thể linh hoạt lựa chọn bước sóng kích thích cũng như giảm thiểu sự chồng chập phổ phát xạ từ các chấm lượng tử đa * Tel: 0912 789436, Email: lienvusptn@gmail.com thành phần, làm cho chúng trở thành các chất dán nhãn tuyệt vời với sự sàng lọc thông lượng cao. Ngoài ra, việc lựa chọn bước sóng kích thích xa các bước sóng phát xạ có thể loại bỏ sự tán xạ nền. So với các chất màu hữu cơ, các chấm lượng tử có hiệu suất lượng tử tương tự nhưng hệ số dập tắt lớn hơn, làm giảm tốc độ dập tắt quang [2]. Độ chói huỳnh quang của các chấm lượng tử cũng lớn hơn độ chói của chất màu hữu cơ khoảng 10 đến 20 lần và độ bền quang cao gấp 100 đến 200 lần [2]. Ngoài ra, bằng cách sử dụng các chấm lượng tử khác nhau người ta có thể đánh dấu huỳnh quang trong khoảng rộng từ vùng khả kiến đến vùng hồng ngoại gần, trong khoảng từ 400nm đến 2000nm [3]. Các chấm lượng tử thường được sử dụng trong đánh dấu sinh học là các chấm lượng tử trên cơ sở CdSe và CdTe vì phổ phát xạ của chúng trải toàn bộ vùng phổ nhìn thấy tùy thuộc vào kích thước [3]. Các chấm lượng tử có phổ hấp thụ liên tục và rộng tương tự như của vật liệu bán dẫn khối với một số đỉnh. Phổ hấp thụ kéo dài từ vùng tử ngoại tới một bước sóng giới hạn trong vùng nhìn thấy, tương ứng với dịch chuyển cơ bản, được gọi là đỉnh hấp thụ thứ nhất. Các chấm lượng tử không hấp thụ ánh sáng có Chu Việt Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 99(11): 151 - 159 152 bước sóng lớn hơn bước sóng của đỉnh hấp thụ thứ nhất. Do sự phụ thuộc của các mức năng lượng điện tử - lỗ trống vào kích thước và thành phần hóa học của chấm lượng tử nên bước sóng đỉnh hấp thụ thứ nhất cũng phụ thuộc vào kích thước và thành phần hóa học của chấm lượng tử. Các chấm lượng tử càng nhỏ thì đỉnh hấp thụ thứ nhất càng ở bước sóng ngắn. Mỗi đỉnh ứng với dịch chuyển năng lượng giữa các mức năng lượng gián đoạn của các điện tử - lỗ trống (exciton) [4]. Các chấm lượng tử có phổ hấp thụ rộng nên huỳnh quang có thể được kích thích ở bước sóng nào ngắn hơn bước sóng huỳnh quang. Vì vậy nhiều chấm lượng tử với màu huỳnh quang khác nhau có thể được kích thích bằng một ánh sáng đơn sắc (hay bằng một nguồn đơn). Điều này trái ngược với chất màu hữu cơ, có tần số cộng hưởng hấp thụ chỉ trong một vùng tần số hẹp, do đó với mỗi chất màu hữu cơ chỉ có một bước sóng kích thích xác định và mỗi bước sóng xác định chỉ kích thích được một chất màu hữu cơ xác định [5, 6]. Các chấm lượng tử có các mức năng lượng phụ thuộc vào kích thước nên có thể điều khiển tính chất quang theo kích thước. Hình 1 trình bày ảnh phát xạ huỳnh quang của dung dịch các chấm lượng tử CdSe/CdS được chế tạo tại phòng thí nghiệm Vật lý Chất rắn, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên với các màu phát xạ khác nhau dưới ánh sáng kích thích của đèn tử ngoại. Hình 1. Ảnh phát xạ của các chấm lượng tử CdSe/CdS dưới ánh sáng của đèn tử ngoại với các kích thước lõi CdSe từ trái sang phải là 2,5; 5 và 7 nm [6] Các kết quả về nghiên cứu động học hạt tải của các các chấm lượng tử cho thấy thời gian sống phát quang của chấm lượng tử là khá lớn, khoảng 10-50 ns, lớn hơn thời gian sống huỳnh quang của các chất màu hữu cơ chỉ khoảng 5 ns [1]. Đối với các chấm lượng tử mà thành phần chỉ là một loại chất bán dẫn (còn gọi là hiệu suất lượng tử thấp, chỉ cỡ 10% do các tái hợp không phát xạ tại các trạng thái bề mặt. Để loại bỏ một cách hiệu quả và bền vững các tâm tái hợp không bức xạ tại trạng thái bề mặt, người ta thường tiến hành bọc 1 hoặc 2 đơn lớp các chất bán dẫn với hằng số mạng tương tự và độ rộng vùng cấm lớn hơn độ rộng vùng cấm của bán dẫn lõi, khi đó các hạt mang điện bị bẫy trong hố thế do việc tạo vỏ bọc xung quang lõi bán dẫn bằng vật liệu bán dẫn có vùng cấm lớn hơn vật liệu làm lõi (ví dụ: vỏ ZnS bao quanh lõi CdSe). Với cấu trúc lõi - vỏ, các hạt mang điện bị giam trong hố thế, làm giảm sự tái hợp không phát xạ trên bề mặt chấm lượng tử, do đó hiệu suất lượng tử tăng lên. Ví dụ đối với tinh thể nano lõi - vỏ CdSe/ZnS hiệu suất lượng tử có thể đạt đến 70-80% [5-8]. Các chấm lượng tử có độ bền quang cao và cao hơn nhiều so với các chất màu hữu cơ trong cùng một điều kiện do các chấm lượng tử được tổng hợp từ vật liệu vô cơ nên chúng ít bị tẩy quang (photobleaching). Ví dụ so sánh giữa chấm lượng tử CdSe đã có lớp vỏ bọc (ví dụ CdSe/ZnS) và phân tử Rhodamine thì chấm lượng tử có độ chói cao gấp 20 lần và độ bền quang cao hơn 100 lần so với Rhodamine [5, 9]. Đây là ưu việt của chấm lượng để dùng trong các thí nghiệm sinh học diễn ra trong khoảng thời gian dài. YÊU CẦU CỦA CÁC CHẤM LƯỢNG TỬ TRONG ĐÁNH SINH HỌC Vì môi trường sinh học chủ yếu là nước nên các chấm lượng tử dùng trong đánh dấu sinh học phải phân tán được trong nước. Mặt khác, các chấm lượng tử muốn đánh dấu được các đối tượng sinh học như ADN, protein, kháng thể, tế bào thì chúng phải gắn kết được với các đối tượng sinh học đó. Vì vậy các chấm lượng tử phải có các nhóm chức hóa học thích hợp để có thể phân tán được trong nước và gắn kết với các phân tử sinh học, do đó chúng phải có lớp hợp sinh ưa nước bao quanh. Ví dụ đối với các chấm lượng tử CdSe/ZnS tồn tại trong các dung môi hữu cơ với các ligand là các phân tử TOPO, người ta phải thực hiện việc trao đổi ligand để làm sao trên bề mặt của các chấm lượng tử có các nhóm chức làm cho chấm lượng tử có thể tan được trong nước và gắn kết được với các đối tượng sinh Chu Việt Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 99(11): 151 - 159 153 học. Có hai cách chính để làm các chấm lượng tử này phân tán được trong nước [3], đó là: i) thay đổi những phân tử bề mặt kỵ nước TOPO bằng những phân tử hai nhóm chức mà một đầu tan trong nước liên kết với phân tử sinh học và một đầu còn lại liên kết với bề mặt chấm lượng tử; và ii) phủ cho tinh thể nano bán dẫn kỵ nước vỏ polymer ưa nước. Trong phương pháp này đuôi kỵ nước của polymer tương tác với phân tử kỵ nước trên bề mặt tinh thể và vì vậy hình thành thêm lớp vỏ. Tính ưa nước của tinh thể nano vỏ polymer được đảm bảo bởi nhóm ưa nước của polymer quay ra ngoài. Một cách tiếp cận để có được các chấm lượng tử phục vụ cho các ứng dụng đánh dấu sinh học là chế tạo chúng trực tiếp trong môi trường nước. Trên thế giới và cả ở nước ta hiện nay, các chấm lượng tử như CdSe, CdTe đã và đang được nghiên cứu chế tạo trực tiếp trong môi trường nước phục vụ cho các ứng dụng đánh dấu sinh học, rút ngắn bớt thời gian chế tạo và giảm độ độc hại so với các chấm lượng tử chế tạo trong dung môi hữu cơ truyền thống. MỘT SỐ ỨNG DỤNG ĐÁNH DẤU SINH HỌC CỦA CÁC CHẤM LƯỢNG TỬ Cảm biến sinh học (biosensors) Cảm biến sinh học là một thiết bị có khả năng tích hợp tác nhân sinh học enzyme, chất nền, kháng nguyên, kháng thể trong đầu dò để đo đạc, phát hiện hoặc phân tích hóa chất. Biosensors phát hiện các phân tử sinh học quan trọng qua việc tạo ra các tín hiệu quang hoặc tín hiệu điện, từ đó nhận ra chất phân tích. Phần lớn các biosensors hoạt động trên nguyên lý nhận dạng các phân tử; các chuỗi kháng thể, peptides, protein, ADN được liên kết chặt chẽ với các phân tử đích với tính đặc hiệu cao. Các chất màu được gắn kết với các phân tử nhận biết này để tạo ra một điểm huỳnh quang khi có sự liên kết đặc hiệu. Biosensors sử dụng các chấm lượng tử có nhiều ưu điểm nổi trội so với loại sử dụng các chất đánh dấu cổ điển. Bề mặt của chấm lượng tử có thể dễ dàng thay đổi, tạo ra lộ trình đơn giản cho sự nhận biết các phân tử. Thêm vào đó, do kích thước nhỏ nên dễ cho phép đưa chúng vào sử dụng trong các thiết bị điện tử hiện nay. Nhiều loại biosensors đã được nghiên cứu nhưng thông dụng nhất là loại dựa trên sự truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (fluorescence resonance energy transfer - FRET) hoặc sự kết hợp nhiều đầu dò huỳnh quang để phát hiện ra chất phân tích. Hình 2 là một ví dụ sử dụng chấm lượng tử làm biosensor. Đây là một nanosensor chấm lượng tử được dùng để phát hiện đường maltose. Chấm lượng tử được chức năng hóa bề mặt với protein liên kết với đường maltose (MBP) có chứa thành phần β-cyclodextrin- QSY-9 được gắn chặt vào vị trí liên kết để dập tắt sự phát xạ của chấm lượng tử (do sự truyền năng lượng từ chấm lượng tử sang β- cyclodextrin-QSY-9). Khi maltose có trong mẫu thì maltose sẽ thay thế cho thành phần β- cyclodextrin-QSY-9 ngăn cản sự truyền năng lượng làm chấm lượng tử phát xạ. Hình 2. Sơ đồ chức năng của một nanosensor chấm lượng tử phát xạ ở 560 nm nhằm phát hiện đường maltose [9] Ví dụ về cảm biến sinh học dựa trên chấm lượng tử sử dụng trong các phép phân tích di truyền là xác định động học trong việc sao chép ADN [10]. Cảm biến sinh học ADN dựa trên kĩ thuật FRET-QD đã được Patolsky và cộng sự thực hiện [11]. ADN được kẹp giữa một đầu dò được biotin hóa và phần tử báo cáo được dán nhãn với chất màu Cy5. Một đích ngắm được dán nhãn với một chấm lượng tử được gắn streptavidin với vài oligonucleotide gắn xung quanh (xem hình 3). Chấm lượng tử QD650 và chất màu Cy5 được chọn làm cặp donor – acceptor. So với đèn hiệu phân tử thường được sử dụng trong các ứng dụng ADN lai, phương pháp này tạo ra một sự đáp ứng cảm biến cao hơn nhiều tại hầu hết các nồng độ đích được thử nghiệm. Ứng dụng làm chất đánh dấu huỳnh quang các tế bào Ứng dụng phổ biến nhất của các chấm lượng tử trong sinh học là đánh dấu huỳnh quang Chu Việt Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 99(11): 151 - 159 154 các tế bào. Các chấm lượng tử được gắn kết với kháng thể đặc hiệu với các cấu trúc đích trong tế bào. Hình 4a mô tả các thụ thể tế bào (màu đen) được đánh dấu bởi các chấm lượng tử đã được thay đổi các ligand tương thích với các thụ thể này. Các chấm lượng tử cũng có thể được dùng để theo dõi sự phát triển của các tế bào trong nuôi cấy tế bào. Khi tế bào được đưa vào dung dịch chấm lượng tử, các chấm lượng tử bắt đầu xâm nhập vào chúng. Vì các chấm lượng tử có độ bền quang cao nên có thể quan sát sự phân chia tế bào ở trên được truyền qua cho cả các tế bào con và tín hiệu huỳnh quang có thể được quan sát trong thời gian dài. Hình 4b cho thấy nếu một tế bào trong một cụm tế bào được đánh dấu với QDs thì khi tế bào này phân chia, các tế bào con có thể quan sát được thấy. Hình 3. Giản đồ hình thành một nanosensor tự tập hợp (nanosensor assembly) trong sự xuất hiện của các đích (hình trên) và huỳnh quang của Cy5 xuất hiện khi kích thích QD do FRET từ QD (donor) đến Cy5 (acceptor) trong một nanosensor [12] Việc dán nhãn bên ngoài tế bào bởi các chấm lượng tử tương đối đơn giản, nhưng việc đánh dấu nội bào là khó khăn hơn rất nhiều. Có một số phương pháp để nhuộm cấu trúc nội bào bằng chấm lượng tử, song cho đến nay vẫn chưa có phương pháp nào đặc biệt thành công. Kỹ thuật vi tiêm (microinjection) đã được sử dụng trong dán nhãn tế bào chất ở phôi ếch và cá ngựa nhưng rất mất thời gian với quy định phân tích ở thể tích lớn. Chấm lượng tử hấp thụ vào tế bào qua cả hai con đường là nội bào và không bào. Việc dán nhãn tế bào chất bằng chấm lượng tử thông qua việc tiếp hợp với protein Tat bằng cách bọc pullulan chịu cholesterol (CHP) có nhóm amin đã được Hasegawa U và cộng sự thực hiện [14]. Thêm nữa, việc ghi nhãn sợi actin – F (một loại protein có trong cơ động vật) bởi QDs được bọc streptavidin [15] cho thấy có thể sử dụng chấm lượng tử để bảo vệ các protein được dán nhãn trong sự hoạt động của enzyme. Hình 4. Mô tả tế bào được đánh dấu bằng QDs (a – QDs được gắn trên các thụ thể của tế bào). Khi tế bào phân chia, có thể quan sát được các tế bào con (b) [13] Ứng dụng để theo dõi tế bào (cell tracking) Ứng dụng đáng chú ý của chấm lượng tử trong đánh dấu tế bào là theo dõi động học tế bào. Thay vì đánh dấu toàn bộ cấu trúc tế bào thì các phân tử riêng biệt, đơn lẻ cũng có thể được đánh dấu huỳnh quang bằng chấm lượng tử, do đó có thể theo dõi chuyển động của protein màng riêng biệt. Việc phát hiện các chuyển động của tế bào tăng cho phép đánh giá, ước lượng khả năng di căn của các tế bào ưng thư. Các tế bào khi di căn có thể “ăn” (ingest) các phân tử khác khi chúng di chuyển tới các phân tử đó, việc để lại phía sau đường dẫn được biết đến như theo dõi động học thực bào (phagokinetic track) Chúng có thể dễ dàng gắn trên cơ chất và kích thước của chúng thì không ảnh hưởng đến chuyển động của tế bào. Trong một số thử nghiệm, người ta đã dùng chấm lượng tử để phân biệt giữa tế bào ung thư và tế bào không ung thư và chấm lượng tử vẫn còn phát quang trong hơn một tuần sau khi được gắn với tế bào. Công trình đáng chú ý của Tada và cộng sự [16] đã làm sáng tỏ cơ chế phân phối của các chấm lượng tử vào các tế bào ung thư vú của con người. Các tác giả đã sử dụng một dòng tế bào mang Chu Việt Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 99(11): 151 - 159 155 các thụ thể HER2 (kháng nguyên ung thư vú) có trên màng tế bào. Các chấm lượng tử được tiếp hợp với kháng thể đơn dòng trastuzumab (trastuzumab là kháng thể đơn dòng chọn lọc với protein HER2, khi liên kết với các khiếm khuyết protein HER2, protein HER2 không còn khiến các tế bào trong vú sinh sản không kiểm soát được; làm tăng sự sống còn của người bị ung thư) cho hiển thị các hạt nano trong mạch máu phục vụ các tế bào khối u ở chuột. Các chấm lượng tử đã giúp xác định vận tốc và hướng dịch chuyển, sự liên kết của kháng thể với kháng nguyên HER2 trên màng tế bào, và sự di chuyển vào khu vực xung quanh nhân tế bào (perinuclear) (hình 5). Hình 5. Sơ đồ minh họa phức chấm lượng tử – kháng thể trastuzumab lưu thông trong mạch máu khối u di chuyển đến các thụ thể HER2 trên tế bào ung thư vú [16] Những ứng dụng in vivo của chấm lượng tử Ứng dụng hấp dẫn nhất của đánh dấu chấm lượng tử là sử dụng được trong các phân tích in vivo [3, 17]. Sự ổn định lâu dài và độ sáng của chấm lượng tử làm cho chúng trở nên lý tưởng cho hiện ảnh trong cơ thể sống.Tuy nhiên, ứng dụng này vẫn còn đầy thách thức. Đối với các chất màu truyền thống không có ứng dụng này. Sự truyền qua của ánh sáng kích thích và phát xạ trong cơ thể sống là rất khó, chẳng hạn như mô chỉ cho ánh sáng hồng ngoại truyền qua. Mặt khác sự chuyển hóa và tính thích ứng sinh học của các tinh thể nano in vivo phức tạp hơn trong các tế bào đơn lẻ. Phần lớn các hạt nano chấm lượng tử được dùng trong các ứng dụng sinh học được dựa trên cấu trúc Cd-X, với X là Te, S, Se. Cd gây ra trở ngại cho việc tái tổ hợp cặp đôi của ADN, là chất gây ung thư. Sự thụ động hóa bề mặt và tạo lớp vỏ bọc có thể làm giảm bớt đáng kể nguy cơ xuất hiện của Cd tự do. Với độ chói tốt, độ bền quang cao khi kích thích bằng laser trong khoảng thời gian dài và tối ưu hóa lớp vỏ bọc đã cho thấy rằng lớp bọc đặc hiệu polyethylene glycol (PEG) đã làm tăng thời gian lưu thông in vivo, tăng độ bền và giảm sự kết bám không đặc hiệu tối đa. Đây là những yếu tố cần thiết và quan trọng trong hiện ảnh in vivo. Thí nghiệm in vivo đầu tiên là hiện ảnh mặt cắt (section) của mô trong các cơ quan của chuột sau khi tiêm vào tĩnh mạch chuột một lượng chấm lượng tử đã gắn kết với peptide. Các ứng dụng gần đây chủ yếu tập trung vào hiện ảnh động vật sống kết hợp với kính hiển vi đa photon (multiphoton exitation microscopy) hoặc với việc dùng các tinh thể QDs bức xạ hồng ngoại gần (NIR). Thiết diện hấp thụ hai photon lớn của chấm lượng tử cho phép phát hiện các mẫu dày với hiệu suất cao hơn nhờ kính hiển vi kích thích đa photon. Sử dụng kỹ thuật này có thể phát hiện được hàng trăm các tín hiệu huỳnh quang ở độ sâu micromet dưới da của chuột sống và của các mẫu mô dày và quan sát được các mạch máu của khối u, theo dõi sự di chuyển của các tế bào đã được đánh dấu bằng chấm lượng tử, điều này không thể làm được với các chất đánh dấu truyền thống. Những phát hiện này chứng tỏ chấm lượng tử có tiềm năng trong vai trò chất đánh dấu trong các nghiên cứu sinh lý học bệnh lý khối u và là các hạt dẫn truyền thuốc. Những ứng dụng in vitro của chấm lượng tử Với những nỗ lực không ngừng trong việc phát triển các đặc tính thích ứng sinh học của chấm lượng tử, các hạt nano gắn kết được với các kháng thể, peptide, và ADN đã được chế tạo và sử dụng để nhận biết các tế bào và mô đặc hiệu, nhờ đó cho phép đánh dấu đa kênh và thực hiện những nghiên cứu đòi hỏi thời gian dài [18]. Dahan và cộng sự [19] đã phát triển phương pháp nghiên cứu các mô hình đơn tinh thể nano phát quang sử dụng kính hiển vi lệch tiêu (defocused microscopy). Bằng cách liên kết các mô hình này với các cấu trúc tinh thể nano phát quang lưỡng cực (emission dipoles), các nhà thực nghiệm đã xác định được sự định hướng 2 chiều của các hạt nano và đã thành công khi ứng dụng công nghệ này để theo dõi sự định hướng màng thụ thể đơn (single membrance reception) trong các tế bào sống. Các chấm lượng tử cũng Chu Việt Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 99(11): 151 - 159 156 nhận được nhiều sự quan tâm trong các ứng dụng như bộ phát quang để nghiên cứu các quá trình động học lý sinh. Yildiz và Selvin [20] đã chứng minh rằng kính hiển vi phản xạ nội toàn phần (total internal reflection microscopy) được dùng kết hợp với chất phát quang hữu cơ có thể đem lại độ chính xác cỡ 1 nm khi hiện ảnh huỳnh quang (fluorescence imaging with one nanometer accuracy - FIONA). Công nghệ cho phép các nhà nghiên cứu xác định được vị trí trung tâm của mẫu huỳnh quang với độ chính xác cao. FIONA cũng được ứng dụng để làm sáng tỏ cơ chế đánh thức (waking) các cơ vận động của phân tử myosin V, myosin VI, và kinesin. Các tác giả tin rằng việc ứng dụng chấm lượng tử sẽ nâng độ nhậy lên ít nhất 10 lần trong phân tích và mở rộng những ứng dụng của FIONA trong các vận động cơ. Ứng dụng trong phép thử miễn dịch Phép thử miễn dịch dựa trên nguyên lý kháng nguyên – kháng thể: Để xác định một loại bệnh nào đó người ta lấy kháng nguyên của một người bị nghi vấn cho kết hợp với kháng thể của bệnh đó, liên kết đặc hiệu xảy ra khi người đó bị bệnh. Đây là những phản ứng xảy ra ở mức độ phân tử. Nếu gắn protein chứa kháng thể mầm bệnh với một chất chỉ thị thì ta sẽ biết được bệnh qua chất chỉ thị đó khi kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với kháng thể có chất chỉ thị. Ví dụ, chấm lượng tử CdSe-ZnS gắn kết với leucine zipper của protein G (PG-zb), sau đó gắn kết với kháng thể G (IgG) trở thành QD/PG-zb/IgG được dùng trong phép thử miễn dịch huỳnh quang. Khuẩn tụ cầu B gây độc trong ruột (SEB) đã được phát hiện bằng cách trên [20]. Ngoài ra, chấm lượng tử gắn kết với kháng thể có thể phát hiện được lượng nhỏ chất nổ 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) trong mẫu lỏng [21]. Ứng dụng trong dẫn truyền thuốc và chữa bệnh Một trong những ứng dụng quan trọng của các chấm lượng tử đang phát triển hiện nay là theo dõi quá trình phân phối thuốc, bởi nó có khả năng làm rõ quá trình vật lý và hóa học của thuốc trong cơ thể (pharmacokinetics), tác dụng của thuốc lên cơ thể (pharmacodynamics) và cung cấp các nguyên lý của kỹ thuật vận chuyển thuốc [22]. Việc theo dõi các phân tử thuốc hoặc các phân tử mang thuốc không xâm nhập trong các tổ chức sống đòi hỏi các kỹ thuật hiện ảnh chuyên dụng. So sánh với các phương thức hiện ảnh truyền thống như chụp cộng hưởng từ (MRI), chụp positron cắt lớp (PET) thì phương pháp dùng QDs cho hình ảnh quang học với độ nhạy cao, cho kết quả định lượng, khả năng ghép kênh cao hơn, giảm chi phí và rút ngắn thời gian trong việc phát triển các loại thuốc mới. Các ứng dụng hiện nay của chấm lượng tử trong vận chuyển thuốc tập trung vào 2 hướng chính: là phân tử mang thuốc, đánh dấu trong điều trị bệnh hoặc là chất đánh dấu trong các phân tử mang thuốc. Ứng dụng làm quang mã hóa đa màu cho các xét nghiệm sinh học Các chấm lượng tử cũng được sử dụng làm quang mã hóa đa màu cho các xét nghiệm sinh học. Các chấm lượng tử dùng làm mã hóa quang học và phân tích thông lượng cao các gen và protein đã được Nie và cộng sự [23] thực hiện. Các hạt polystyrene chứa các chấm lượng tử CdSe phát xạ với các màu sắc và cường độ khác nhau được sử dụng để mã hóa các protein và các trình tự axit nucleic (hình 6). Việc sử dụng sáu màu sắc khác nhau và 10 mức cường độ về mặt lý thuyết có thể mã hóa đến 1.000.000 protein hoặc trình tự axit nucleic. Các phân tử cụ thể như peptide, protein, và oligonucleotides liên kết cộng hóa trị với các hạt nano và được mã hóa bằng tín hiệu quang phổ của hạt với một nguồn sáng duy nhất được sử dụng để đọc tất cả các mã của chấm lượng tử. Công nghệ mã vạch (barcoding) với việc sử dụng các chấm lượng tử cung cấp các lợi thế đáng kể trên các thiết bị chip phẳng (ví dụ như cải thiện động học liên kết và phạm vi hoạt động), và cho thấy nhiều khả năng sử dụng trong các ứng dụng công nghệ sinh học khác nhau. Sử dụng trong máy đếm dòng tế bào Máy đếm dòng tế bào dùng để đếm và kiểm tra các các tế bào, các nhiễm sắc thể, protein, bằng cách xây dựng một hệ đếm các đối tượng sinh học có trong một đơn vị thể tích chất lỏng khi cho chất lỏng chảy qua một bộ dò tìm điện tử dựa trên tính chất quang của đối tượng. Hiện nay máy đếm dòng Chu Việt Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 99(11): 151 - 159 157 tế bào đã trở nên phổ biến trong nghiên cứu lâm sàng, nhất là trong các xét nghiệm ung thư máu. Máy đếm dòng tế bào cho phép phân tích đồng thời nhiều thông số về các đặc tính lý hóa của các đối tượng sinh học. Thông thường, các đối tượng không có sẵn các tính chất để ta dễ dàng phát hiện. Vì vậy, trước khi tiến hành đếm số lượng các đối tượng, người ta phải dán nhãn huỳnh quang cho các đối tượng này để khi tiến hành đếm, máy sẽ thu nhận các xung tín hiệu quang phát ra từ các đối tượng đã được đánh dấu khi được kích thích. Bên cạnh việc đếm dựa vào ánh sáng huỳnh quang, các ánh sáng tán xạ và truyền qua cũng được sử dụng. Hình 6. Minh họa mã hóa quang học dựa trên bước sóng và cường độ của các QDs [23] (A) Các hạt cầu polymer chứa các hạt nhỏ với màu sắc khác nhau (là các chấm lượng tử phát xạ các màu khác nhau) theo tỷ lệ cường độ được xác định trước. Các đầu dò phân tử (từ A đến E) được đính trên bề mặt các hạt cầu phục vụ cho việc gắn kết sinh học và nhận ra các tương tác ADN – ADN lai, kháng nguyên – kháng thể, phần tử nhận và các ligand. Số các hạt cầu màu (đỏ, xanh lục và xanh lam) không đại diện cho các chấm lượng tử riêng lẻ mà dùng để minh họa các mức cường độ huỳnh quang. Kết quả quang học được đọc ra bằng cách đo phổ huỳnh quang của các đơn hạt. Cả cường độ tuyệt đối và tỷ lệ cường độ tương đối tại các bước sóng khác nhau đều được sử dụng cho mục đích mã hóa, ví dụ: (1:1:1) (2:2:2), và (2:1:1) là các mã để phân biệt. (B) Ảnh phát xạ của mười chấm lượng tử CdSe/ZnS với các kích thước CdSe khác nhau dưới ánh sáng kích thích của đèn tử ngoại. Từ trái sang phải lần lượt là các đỉnh phát xạ: 443, 473, 481, 500, 518, 543, 565, 587, 610 và 655 nm. (C) Hiển vi huỳnh quang của hỗn hợp các hạt nano polystyrene chứa QDs CdSe/ZnS phát xạ các tín hiệu màu duy nhất tại các bước sóng 484, 508, 547, 575, và 611 nm. Các hạt này được trải cố định trên một phiến thủy tinh phủ polylysine gây ra một hiệu ứng phân nhóm nhỏ. Do có các tính chất huỳnh quang ưu việt như đã biết, các chấm lượng tử sẽ đại diện cho một công nghệ mới đầy hứa hẹn trong ứng dụng máy đếm dòng tế bào. Mặc dù sự ứng dụng chấm lượng tử cho công nghệ này vẫn còn trong giai đoạn đầu của sự phát triển, chiến lược và các cân nhắc cần thiết để sử dụng thành công, công nghệ này đang ngày càng được biết đến. Chỉ cần thay đổi thành phần hóa học và kích thước của các chấm lượng tử thì sẽ có các chấm lượng tử phát xạ huỳnh quang trải từ vùng nhìn thấy đến hồng ngoại gần. Do đó sẽ có rất nhiều lựa chọn đối với chấm lượng tử để sử dụng trong máy đếm dòng tế bào. CHẾ TẠO CÁC CHẤM LƯỢNG TỬ CHO ỨNG DỤNG ĐÁNH DẤU SINH HỌC TẠI VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI Hiện nay trên thế giới, các chấm lượng tử cho ứng dụng đánh dấu sinh học đã được chế tạo dưới dạng thương phẩm với chất lượng cao, điển hình là các chấm lượng tử CdSe/CdS bọc polythyleneglycol (PEG) phân tán trong nước có các nhóm chức sinh học bên ngoài của hãng Invitrogen (Mỹ). Các chấm lượng tử này có thể đánh dấu trực tiếp sinh học cả in vivo và in vitro. Tại Việt Nam, việc chế tạo chấm lượng tử ứng dụng đánh dấu sinh học cũng đã được tập trung nghiên cứu. Các chấm lượng tử CdSe/ZnS phân tán trong dung môi hữu cơ được chức năng hóa bề mặt ứng dụng làm cảm biến sinh học dò tìm peptit được chế tạo bởi nhóm nghiên cứu của PGS Phạm Thu Nga, viện Khoa học Vật liệu [24], các chấm lượng tử CdTe được bọc MPA chế tạo bởi nhóm nghiên cứu của PGS Nguyễn Quang Liêm đã được đánh dấu thành công trên kháng thể phage đặc hiệu ưng thư vú HER2 [25]. Tại phòng thí nghiệm Vật lý Chất rắn, trường Đại học Sư phạm thái nguyên, chúng tôi cũng đã chế tạo các chấm lượng tử CdSe/CdS định hướng đánh dấu sinh học. Các chấm lượng tử này được chế tạo trực tiếp trong môi trường nước, với độ pH thích hợp với môi trường sinh học, phân tán tốt trong nước nhờ được bao quanh bởi các phân tử natri citrate (một chất không độc hại, được dùng trong công nghệ thực phẩm). Các chấm lượng tử CdSe/CdS phân tán trong nước có hiệu suất lượng tử tương đối cao và độ bền quang tốt, tuổi thọ kéo dài (độ bền quang hóa cao sau nhiều tháng chế tạo). Để thực hiện Chu Việt Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 99(11): 151 - 159 158 khả năng ứng dụng đánh dấu sinh học của các chấm lượng tử, chúng tôi bọc các chấm lượng tử này một lớp PEG hoặc lớp protein BSA. Kết quả cho thấy, các chấm lượng tử đã được bọc lớp PEG hay BSA có cường độ huỳnh quang được tăng cường, độ bền quang ổn định và độ phân tán tốt hơn [26]. Các chấm lượng tử này hứa hẹn làm các chất đánh dấu sinh học hữu ích. KẾT LUẬN Các chấm lượng tử với độ chói, độ bền quang cao, hiệu suất phát quang lớn đang và sẽ được sử dụng trong các ứng dụng đánh dấu và hiện ảnh sinh học, và đặc biệt trong các thí nghiệm theo dõi các hiện tượng và phản ứng sinh học theo thời gian. Do bước sóng phát xạ phụ thuộc vào kích thước và thành phần hóa học nên các chấm lượng tử nên các chấm lượng tử rất được chú trọng ứng dụng trong các phép phân tích đa kênh. Tuy nhiên do độ độc hại và tính chất huỳnh quang nhấp nháy, các chấm lượng tử vẫn cần được nghiên cứu để có thể ứng dụng trong các nghiên cứu in vivo. LỜI CẢM ƠN Công trình được thực hiện dưới sự hỗ trợ kinh phí của đề tài NCKH cấp đại học Thái Nguyên, mã số ĐH2012-TN04-15. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1].Wenwan Zhong, Nanomaterials in fluorescence-based biosensing, Anal. Bioanal. Chem. (2009) 394, Springer:47–59 [2]. Gao X, Yang L, Petros JA, Marshall FF, Simons JW, Nie S., In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots, Curr Opin Biotechnol, 16, 63–72 (2005) [3]. Challa S. S. R. Kumar, Nanotechnologies for the Life Sciences Vol. 1, Biofunctionalization of Nanomaterials. Edited by Copyright 8 2005 WILEY-VCH [4]. Roszek B., W.H. de Jong, Geertsma R.E., Nanotechnology in medical application, 2005 [5]. Bailey R. E., Smith A. M., Nie N., Quantm dots in biology and medicine, Physica E 25 (2004) 1-12 [6]. Parak W. J., Gerion D., Pellegrino T., Zanchet D, Micheel C, Williams S. C., Boudreau R., Le Gros M., Larabell C. A., and Alivisatos P., Biological application of colloidal nanocrystal, Nanotechlogy 14 (2003) 15-27 [7]. Chan W: Semiconductor Quantum Dots for Ultrasensitive Biological Detection and Imaging. PhD thesis. Department of Chemistry, Indiana University; 2001 [8]. Parak W. J., Pellegrino T., and Plank C., Labeling of cell with quantum dots, Nanotechnology 16 (2005) 9-25 [9]. J. Matthew Mauro et al, Self-assembled nanoscale biosensors based on quantum dot FRET donors, Nature materials | VOL 2 | SEPTEMBER 2003, 630-638 [10]. T. Jamieson et al. / Biomaterials 28 (2007) 4717–4732. [11]. Patolsky F, Gill R, Weizmann Y, Mokari T, Banin U, Willner I. Lighting-up the dynamics of telomerization and DNA replication by CdSe– ZnS quantum dots. J Am Chem Soc 2003;125:13918–9 [12]. Zhang CY, Yeh HC, Kuroki MT, Wang TH. Single-quantum-dotbased DNA nanosensor. Nat Mater 2005;4:826–31 [13]. Parak W. J. et al, Bioanalytics and biolabeling with semiconductor nanoparticles (quantum dots), J. Mater. Chem., 2007, 17, 1343–1346 [14]. Hasegawa U, Nomura SIM, Kaul SC, Hirano T, Akiyoshi K. Nanogel-quantum dot hybrid nanoparticles for live cell imaging. Biochem Biophys Res Commun 2005; 331:917–21 [15]. Mansson A, Sundberg M, Balaz M, Bunk R, Nicholls IA, Omling P, et al. In vitro sliding of actin filaments labelled with single quantum dots. Biochem Biophys Res Commun 2004;314:529–34 [16]. Tada, H.; Higuchi, H.; Wanatabe, T.M.; Ohuchi, N. In Vivo Real-time Tracking of Single Quantum Dots Conjugated with Monoclonal Anti- HER2 Antibody in Tumors of Mice. CancerRes. 2007, 67, 1138-1144. [17]. Aihua Fu,, Weiwei Gu, Carolyn Larabell and A Paul Alivisatos, Semiconductor nanocrystals for biological imaging, Current Opinion in Neurobiology 2005 [18]. Michael J. Murcia and Christoph A. Naumann, Biofunctionalization of Fluorescent Nanoparticles, Nanotechnologies for the Life Sciences Vol. 1, 2005 [19]. Xavier Brokmann, Marie-Virgine Ehrensperger, Jean-Pierre Hermier , Antoine Triller and Maxime Dahan, Orientational imaging and tracking of single CdSe nanocrystals by defocused microscopy, Chemical Physics Letters Volume 406, Issues 1-3, 23 April 2005, Pages 210-214 [20]. Yildiz and Selvin, Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors, Acc. Chem. Res. 2005, 38, 574-582 [21]. Kim E. Sapsford, Thomas Pons, Igor L. Medintz, and Hedi Mattoussi, Biosensing with Chu Việt Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 99(11): 151 - 159 159 Luminescent Semiconductor Quantum Dots, Sensors 2006, 6, 925-953 [22]. H. Mattoussi et al, Luminescent Quantum Dot-Adaptor Protein-Antibody Conjugates for Use in Fluoroimmunoassays, Phys. stat. sol. (B) 229, No. 1, 407–414 (2002) [23]. Han MY, Gao X, Su JZ, Nie SM: Quantum- dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules. Nat Biotechnol 2001, 19:631-635. [24]. Nguyen Ngoc Hai, Vu Duc Chinh, Pheng Xiong, Nguyen Xuan Nghia, Phan Tien Dzung, Nguyen Van Hung, Pham Thu Nga, Nguyen Quang Liem, Optical detection of the pesticide by funtionalized CdSe/ZnS quantum dots as fluorescence-based biosensor, Adv. Opts., Photonics, Spectroscopy and Applications VI (2011), 422-425 [25]. Viet Ha Chu, Thi Ha Lien Nghiem, Thi Huyen La, Thi Dieu Thuy Ung, Quang Huan Le, Kim Thuan Tong, Quang Liem Nguyen and Hong Nhung Tran. Attaching quantum dots to HER2 specific phage antibodies, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, IOP Publishing, 2 (2010) 025005 [26]. Chu Viet Ha, Tran Hong Nhung and Vu Thi Kim Lien, Photoluminescent emission properties of CdSe/CdS quantum dots synthesized directly in aqueous solution, Adv. Opts., Photonics, Spectroscopy and Applications VI (2011), 526–531 SUMMARY BIOLABELING APPLICATION OF QUANTUM DOTS NANOCRYSTALS Chu Viet Ha1, Tran Anh Duc1, Do Thi Duyen1, Vu Thi Kim Lien1*,Tran Hong Nhung2 1College of Education – TNU 2Vietnam Academy of Science and Technology Quantum dots nanocrystals have now great potential for use as diagnostic and imaging agents in biolebeling and biomedicine since they have strong photoluminescence and tunable optical capabilities. Because of toxicity and blinking fluorescence properties, the quantum dots have been studied further for possible in vivo applications. The biolabeling applications of quantum dots are known such as bio imaging, biosensors, cell tracking, biological barcoding and cell flow cytometry. Keywords: semiconductor quantum dots, biomarkers, nanoparticles Ngày nhận bài:21/11/2012, ngày phản biện:03/12/2012, ngày duyệt đăng:10/12/2012 * Tel: 0912 789436, Email: lienvusptn@gmail.com