Tuyển chọn và định danh một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro phân lập từ phân gia súc tại Việt Nam - Nguyễn Thị Thu Huyền

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 79-87 79 TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH HYDRO PHÂN LẬP TỪ PHÂN GIA SÚC TẠI VIỆT NAM Nguyễn Thị Thu Huyền1,2*, Nguyễn Thị Yên1, Vương Thị Nga1, Ðặng Thị Yến1, Nguyễn Thị Trang1, Lại Thúy Hiền1 1Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam 2Trường Ðại học Tôn Ðức Thắng, tp. Hồ Chí Minh, *huyen308@gmail.com TÓM TẮT: Hydro sinh học được coi là nguồn năng lượng sạch, bền vững và đầy hứa hẹn cho tương lai nhờ tính hiệu quả và thân thiện với môi trường. Có nhiều phương pháp để sản xuất hydro sinh học, trong số đó hầu hết là dựa vào vi khuẩn. Trong các quá trình sản xuất hydro sinh học, quá trình lên men sản xuất hydro nhờ vi khuẩn hóa tự dưỡng kỵ khí hoặc vi hiếu khí là một phương pháp triển vọng để sản xuất hydro biền vững. Trong bài báo này, bốn chủng vi khuẩn bản địa có khả năng sinh hydro đã được nghiên cứu. Cả bốn chủng vi khuẩn sinh hydro đều được phân lập từ phân gia súc tại Việt Nam, tế bào của chúng đều có dạng hình que với độ dài khác nhau, chủng Bo 4.1 có tiên mao, các chủng đều là vi khuẩn Gram (+) ngoại trừ chủng Tr2. Trong số các chủng Gram (+), chỉ có chủng Be DA không có khả năng tạo bào tử, trong khi đó hai chủng còn lại Bo 4.1 và Trau DAt đều tạo bào tử. Kết hợp đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen 16S rRNA, chủng vi khuẩn kỵ khí ưa ấm Bo 4.1 thuộc loài Clostridium beijerinckii với độ tương đồng 99,9%; chủng vi khuẩn kị khí ưa nhiệt Trau DAt thuộc loài Thermoanaerobacterium aciditolerans độ tương đồng 99,3%. Hai chủng vi hiếu khí, ưa ấm còn lại Be DA và Tr2 được xác định thuộc chi Clostridium dựa trên đặc điểm hình thái, kít chuẩn API và phân tích trình tự gen 16S rRNA. Từ khóa: Clostridium, Thermoanaerobacterium, hydrogen sinh học, phân gia súc, vi khuẩn sinh hydro. MỞ ĐẦU Trên thế giới, để giải quyết các vấn đề khó khăn về nguồn nhiên liệu cạn kiệt cũng như trái đất nóng lên mà một phần nguyên nhân là do quá trình đốt cháy nhiên liệu hóa thạch, các nhà khoa học đã và đang tập trung nghiên cứu tìm nguồn năng lượng mới, sạch và bền vững. Một trong những hướng khả thi nhất là hydro sinh học với các ưu điểm như không cần sử dụng đến nguồn nguyên liệu hóa thạch, ít đòi hỏi năng lượng, đảm bảo thân thiện với môi trường, tiến hành đơn giản, chi phí đầu tư thấp, hiệu quả sản xuất ổn định và hiệu quả kinh tế cao hơn [9]. Đặc biệt, sản xuất hydro theo phương pháp lên men tối nhờ nhóm vi khuẩn dị dưỡng còn có thể tận dụng được nguồn phế thải hữu cơ làm nguyên liệu cho sản xuất và giảm được chi phí cho sản xuất [1, 12]. Quá trình lên men tối sinh hydro được thực hiện bởi rất nhiều loài vi khuẩn khác nhau cả về đặc điểm sinh lý cũng như phân loại học. Các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hydro có thể là vi khuẩn ưa ấm, ưa nhiệt, thậm chí siêu ưa nhiệt [14, 20, 22]. Quá trình lên men sinh hydro chủ yếu diễn ra trong điều kiện kỵ khí, tuy nhiên chúng cũng vẫn có thể lên men sinh hydro trong điều kiệu vi hiếu khí. Có nhiều nhóm nghiên cứu phân lập thành công vi khuẩn sinh hydro từ các phế thải nông nghiệp và công nghiệp [5, 15, 17]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập và định danh bốn chủng vi khuẩn bản địa có khả năng sinh hydro từ nguồn phân gia súc tại Việt Nam nhằm định hướng ứng dụng chúng trong quá trình lên men tối sản xuất hydro sinh học. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu và môi trường nuôi cấy Các mẫu phân gia súc được lấy từ Đông Anh và Chương Mỹ, Hà Nội và Tân Yên, Bắc Giang. Môi trường nuôi cấy, phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro là môi trường NMV [7]. Đối với môi trường thạch, môi trường NMV được bổ sung 15 g agar trong 1 lit môi trường. Phương pháp Làm giàu vi khuẩn sinh hydro bằng nuôi cấy tích lũy trên môi trường dịch NMV Các mẫu được nuôi cấy trong môi trường dịch chọn lọc NMV cho nhóm vi khuẩn lên men Nguyen Thi Thu Huyen et al. 80 sinh hydro trong 4 điều kiện khác nhau: vi hiếu khí, ưa ấm (30oC); vi hiếu khí, ưa nhiệt (55oC); kỵ khí, ưa ấm (30oC); kỵ khí, ưa nhiệt (55oC). Sau 2-5 ngày nuôi cấy trong tủ ổn nhiệt, mẫu nào thấy có dấu hiệu có vi khuẩn sinh trưởng (làm đục môi trường) và tạo khí (xác định bằng phương pháp thế chỗ nước) thì được tiếp tục làm giàu bằng cách cấy hoạt hóa (10-20% giống). Cứ tiếp tục như vậy cho đến khi mẫu nào có vi khuẩn sinh trưởng tốt thì tiến hành phân lập vi khuẩn có khả năng sinh hydro. Phân lập vi khuẩn sinh hydro bằng cách nuôi cấy trên môi trường thạch NMV Các mẫu chứa vi khuẩn có khả năng sinh hydro được pha loãng theo cơ số 10 trong dung dịch muối sinh lý 0,9% NaCl đã khử trùng. Hút 0,1 ml mỗi ống nghiệm chứa dịch vi khuẩn có nồng độ pha loãng khác nhau vào các đĩa Petri khác nhau rồi đổ 20 ml môi trường thạch NMV lên mỗi đĩa để phân lập vi khuẩn vi hiếu khí hoặc các ống nghiệm (dung tích 10 ml) khác nhau rồi đổ đầy 10 ml môi trường thạch NMV vào mỗi ống để phân lập vi khuẩn kỵ khí. Các đĩa Petri và ống nghiệm chứa vi khuẩn được đưa vào tủ ổn nhiệt (30oC đối với vi khuẩn ưa ấm và 55oC đối với vi khuẩn ưa nhiệt). Sau 2-5 ngày nuôi, quan sát khuẩn lạc trên đĩa Petri và ống nghiệm. Các khuẩn lạc có hình thái khác nhau sẽ được tách và cấy chuyển sang môi trường dịch NMV để hoạt hóa. Các đơn chủng này tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường thạch theo các bước như vừa nêu để kiểm tra độ tinh sạch. Phân loại vi khuẩn theo nhóm bằng phương pháp nhuộm Gram hoặc thử KOH 3% Sau khi cấy hoạt hóa, các đơn chủng vi khuẩn sinh hydro được nuôi cấy trên môi trường dịch NMV. Sau 24 giờ nuôi cấy, ly tâm (8000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút) để thu sinh khối tế bào. Sinh khối tế bào được nhuộm Gram rồi quan sát trên kính hiển vi quang học, hoặc thử phản ứng với KOH 3%. Quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi quét (SEM) Đơn chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro được cấy hoạt hóa qua đêm trong môi trường dịch NMV. Dịch vi khuẩn được ly tâm (5000 vòng/phút) trong 10 phút ở 20oC để thu sinh khối tế bào. Sau khi rửa trong dung dịch PBS (pH 7,2), ly tâm (5000 vòng/phút) trong 10 phút để thu tế bào. Quy trình chuẩn bị mẫu và soi trên kính hiển vi điện tử quét HITACHI S4800 theo Phạm Thị Hằng & Lại Thúy Hiền (2010) [6]. Xác định khả năng tạo bào tử bằng phương pháp sốc nhiệt Đối với vi khuẩn ưa ấm: vi khuẩn có khả năng sinh hydro được nuôi trên môi trường NMV từ 5-7 ngày. Sau đó đem dịch nuôi cấy ủ trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 85oC trong 15 phút. Dịch nuôi cấy sau khi sốc nhiệt được nuôi cấy trong môi trường thạch đĩa NMV. Nếu thấy vi khuẩn sinh trưởng trở lại và có khả năng tạo khí thì vi khuẩn có khả năng sinh hydro đó có khả năng tạo bào tử. Đối với vi khuẩn ưa nhiệt: vi khuẩn có khả năng sinh hydro được nuôi trên môi trường NMV có bổ sung MnCl2.4H2O 0,001% (w/v) từ 5-7 ngày. Sau đó đem dịch nuôi cấy đun sôi nhiệt độ 100oC trong 30 phút. Dịch nuôi cấy sau khi sốc nhiệt được nuôi cấy trở lại trong môi trường dịch NMV với tỷ lệ tiếp giống là 20%. Nếu thấy vi khuẩn sinh trưởng trở lại và có khả năng tạo khí thì vi khuẩn có khả năng sinh hydro đó có khả năng tạo bào tử. Định danh vi khuẩn Gram âm bằng kit chuẩn sinh hóa API 20NE Chủng vi khuẩn Gram âm có khả năng sinh hydro sau khi nuôi cấy qua đêm trong môi trường NMV được ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để thu sinh khối. Sinh khối tế bào được pha loãng trong dung dịch muối sinh lý NaCl 0,9% đã khử trùng sao cho OD600nm khoảng 0,5. Tiến hành thử nghiệm dịch huyền phù tế bào với các phản ứng sinh hóa của kit chuẩn API 20NE theo hướng dẫn của hãng BioMerieux (Pháp). Đọc kết quả dựa vào bảng hướng dẫn và tra phần mềm Apiweb hoặc bảng đối chiếu (API 20NE profile index) để xác định tên chi/loài của vi khuẩn thử nghiệm. Định danh đến loài bằng phân tích trình tự gen 16S rRNA Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro được nuôi cấy trên môi trường dịch NMV qua đêm, sau đó ly tâm 8000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút để thu tế bào. DNA tổng sổ của các TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 79-87 81 chủng này được tách theo kit tách DNA vi khuẩn (Qiagen, Mĩ). Chất lượng DNA tổng số được kiểm tra trên gel agarose. Các bước tiếp theo được tiến hành theo Sakiyama et al. (2009) [19]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh khí hydro Quá trình lên men sinh hydro có thể được thực hiện bởi các đơn chủng hoặc các tập đoàn vi khuẩn. Sản xuất hydro nhờ các tập đoàn vi khuẩn có ưu điểm là nguồn vật liệu dùng cho lên men rất đa dạng và không cần phải khử trùng nguồn vật liệu đầu vào. Tuy nhiên, nhược điểm của quá trình này là sản phẩm khí tạo thành không chỉ chứa hydro mà còn chứa cả các khí khác, vì vậy, việc thu hồi và làm sạch khí hydro gặp nhiều khó khăn hơn. Ngoài ra, hydro tạo thành có thể bị các vi khuẩn có khả năng sử dụng hydro tiêu thụ [21]. Hơn nữa, việc tối ưu hóa quá trình sản xuất hydro cũng khó khăn hơn bởi tập đoàn vi khuẩn chứa nhiều loại vi khuẩn có đặc tính sinh lý khác nhau. Vì vậy, sản xuất hydro bằng đơn chủng thường được ứng dụng nhiều hơn ở qui mô công nghiệp. Cũng chính vì thế, chúng tôi tiến hành phân lập các đơn chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro để từ đó lựa chọn những chủng có khả năng sinh hydro cao nhằm hướng tới ứng dụng chúng trong sản xuất hydro công nghiệp. Từ các mẫu có sinh khí sau khi làm giàu, chúng tôi tiến hành phân lập đơn chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro trên môi trường thạch NMV và thử khả năng tạo khí của chúng. Trong số các chủng phân lập được, có chủng có khả năng sinh khí và có chủng không có khả năng sinh khí (kết quả không trình bày ở đây). Vì vậy, chúng tôi chỉ lựa chọn 14 chủng vi khuẩn có khả năng sinh khí. Các chủng này bao gồm 2 chủng kỵ khí, ưa ấm; 7 chủng kỵ khí, ưa nhiệt và 5 chủng vi hiếu khí ưa ấm, sau đó, các chủng này được nuôi cấy trong môi trường dịch NMV để đánh giá khả năng sinh khí. Kết quả được trình bày ở bảng 1 cho thấy, các chủng kỵ khí ưa ấm có khả năng sinh khí tốt nhất trong khi đó các chủng kỵ khí, ưa nhiệt sinh khí kém nhất ngoại trừ chủng Trau DAt. Trong số các chủng vi hiếu khí, ưa ấm thì chủng Tr2 và chủng Be DA2 có khả sinh khí tốt. Thành phần khí thu được từ các chủng này được phân tích để xác định lương khí hydro có trong hỗn hợp khí. Kết quả thu được (không trình bày ở đây) cho thấy, cả 2 chủng này đều sinh khí hydro. Dựa trên kết quả thu được, chúng tôi lựa chọn 2 chủng kỵ khí (ưa ấm Bo 4.1 và ưa nhiệt Trau DAt) và 2 chủng vi hiếu khí (Tr2 và Be DA2-ký hiệu là Be DA) cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo. Bảng 1. Khả năng sinh khí của các chủng vi khuẩn sinh hydro S TT Chủng Khả năng sinh khí S TT Chủng Khả năng sinh khí S TT Chủng Khả năng sinh khí Kị khí, ưa ấm Kị khí, ưa nhiệt Vi hiếu khí, ưa ấm 1 Bo 4.1 +++ 3 Be DAt1 + 10 Tr1 + 2 Bo 4.2 ++ 4 Be DAt3 + 11 Tr2 ++ 5 Trau DAt ++ 12 Tr3 + 6 Bo BGt1.4 + 13 Be DA1 + 7 Bo BGt1.5 + 14 Be DA2 ++ 8 Bo BGt1.7 + 9 Bo BGt2 + (+). sinh khí thấp; (++). sinh khí trung bình; (+++). sinh khí cao. Đặc điểm tế bào của một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh khí hydro Quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi điện tử cho thấy 4 chủng Bo 4.1, Trau DAt, Tr2 và Be DA đều là vi khuẩn hình que có độ dài khác nhau. Tế bào của ba chủng Bo 4.1, Trau Nguyen Thi Thu Huyen et al. 82 DAt và Tr 2 có hình que dài trong khi chủng Be DA có hình que ngắn (hình 1). Riêng chủng Bo 4.1 còn có tiên mao. Theo các báo cáo đã công bố [13, 18], các vi khuẩn tạo khí hydro hầu hết là các vi khuẩn hình que. Vì vậy, kết quả quan sát được của chúng tôi cho thấy chủng vi khuẩn tạo khí mà chúng tôi phân lập được cũng có đặc tính chung đó. Hình 1. Hình thái tế bào của chủng Bo 4.1 (a), Trau DAt (b), Tr 2 (c) và Be DA (d). Kết quả nhuộm Gram và thử KOH cho thấy, 3 chủng vi khuẩn Bo 4.1, Trau DAt và Be DA là vi khuẩn Gram dương, trong khi đó chủng Tr2 là vi khuẩn Gram âm. Các công trình đã công bố cho thấy, vi khuẩn có khả năng sinh khí hydro bao gồm cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương trong đó vi khuẩn Gram dương là chủ yếu [13, 18], kết quả thu được của chúng tôi cũng khẳng định lại phát hiện trên. Các chủng Gram dương được thử nghiệm khả năng sinh bào tử bằng phương pháp sốc nhiệt. Kết quả cho thấy, 2 chủng kị khí Bo 4.1 và Trau DAt đều có khả năng sinh bào tử trong khi chủng Be DA không có khả năng này (hình 2). Các nghiên cứu trước đây về vi khuẩn có khả năng sinh hydro cho thấy nhiều vi khuẩn Gram dương tạo khí hydro không sinh bào tử [13, 18, 21]. Trong khi đó, 2/3 số chủng Gram dương của chúng tôi có khả năng sinh bào tử. Hình 2. Khả năng sinh trưởng trở lại của các chủng Bo 4.1 (a) và Trau DAt (b) sau khi sốc nhiệt a b c d TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 79-87 83 Như vậy, cả 4 chủng vi khuẩn Bo 4.1, Trau DAt, Tr 2 và Be DA điều là vi khuẩn hình que. Chủng Tr 2 là vi khuẩn Gram âm. Ba chủng Bo 4.1, Trau DAt và Be DA là vi khuẩn Gram dương, trong đó 2 chủng đầu có khả năng sinh bào tử. Các kết quả này góp phần khẳng định các nghiên cứu trước đây (vi khuẩn sinh hydro chủ yếu là vi khuẩn Gram dương, hình que) đồng thời bổ sung thêm rằng đặc tính tạo bào tử của vi khuẩn Gram dương, sinh hydro không phải là hiếm gặp. Định danh vi khuẩn có khả năng sinh hydro Định danh vi khuẩn bằng kít chuẩn sinh hóa API 20NE Các phản ứng đặc trưng trong chuỗi chuyển hóa trong quá trình trao đổi chất đối với từng loại vi sinh vật là khác nhau, kết quả nhuộm Gram cho thấy chủng Tr 2 thuộc nhóm Gram âm. Vì vậy, chúng tôi sử dụng kit chuẩn API 20NE để nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa của chủng Tr 2 từ đó định danh vi khuẩn này. Kết quả thử kít Api 20NE cho thấy, chủng Tr.2 có khả năng sử dụng các nguồn cơ chất: Esculin, gelatine, -galactosidase, glucose, mannose, N-acetyl-glucosamine, malate và không có khả năng tham gia phản ứng: khử nitrate, chuyển hóa indole, axit hóa glucose, arginine dihydrolase, urease, arabinose, citrate, phenyl acetate, cytochrome oxidase, maltose, gluconate, caprate, adipate, manitol. Với kết quả đạt được, tiến hành tra phần mềm APIweb kết hợp khóa phân loại chuẩn của Bergey, chủng Tr2 có độ tương đồng 99,6% với loài Chryseobacterium menigosepticum. Cho đến nay chưa có công trình nào công bố khả năng sinh khí hydro của loài này. Định danh vi khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16 S rRNA Chủng Be DA cũng được thử nghiệm với kit chuẩn API 50 CHL, tuy nhiên, dựa trên kết quả thu được không xác định được vị trí phân loại của chủng này (kết quả không trình bày ở đây). Do đó, để định danh các chủng vi khuẩn này, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự gen 16S rRNA của chủng Be DA cũng như 2 chủng kị khí Bo 4.1, Trau DAt. Đồng thời chủng Tr 2 cũng được phân tích trình tự gen 16S rRNA để kiểm chứng kết quả phân loại bằng kit chuẩn sinh hóa API. So sánh với trình tự gen 16S rRNA của các loài trên ngân hàng gen cho thấy, trình tự gen 16S rRNA của chủng Bo 4.1 tương đồng 99,9% (1395/1396 bp) với đoạn 16S của Clostridium roseum_Y18171, tương đồng 99,9% (1394/1396 bp) với đoạn 16S rRNA của Clostridium beijerinckii_X68179 và Clostridium diolis_AJ458418; trình tự gen 16S rRNA của chủng Trau DAt tương đồng 99,3% (1393/1403 bp) với đoạn 16S rRNA của Thermoanaerobacterium aciditolerans _AY350594; tương đồng 98,9% (1388/1403 bp) với đoạn 16S rRNA của Thermoanaerobacterium islandicum_EF088330; tương đồng 98,8% (1386/1403 bp) với đoạn 16S của Clostridium thermoamylolyticum _X76743; trình tự gen 16S rRNA của chủng Tr 2 tương đồng 99,9% (1394/1396 bp) với đoạn 16S rRNA của Clostridium roseum_Y18171, tương đồng 99,8% (1393/1396 bp) với đoạn 16S của Clostridium beijerinckii _X68179 và Clostridium diolis_AJ458418; trình tự gen 16S rRNA của chủng Be DA tương đồng 99,9% (1395/1396 bp) với đoạn 16S rRNA của Clostridium roseum_Y18171, tương đồng 99,9% (1394/1396 bp) với đoạn 16S rRNA của Clostridium beijerinckii_X68179 và Clostridium diolis_AJ458418. Như vậy, mặc dù đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, đặc tính Gram khác nhau, khả năng tạo bào tử khác nhau nhưng kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA của 3 chủng Bo 4.1, Tr 2 và Be DA lại cho kết quả tương tự nhau. Dựa trên kết quả thu được chúng tôi tiến hành xây dựng cây phát sinh chủng loại của 4 chủng này, kết quả được trình bày ở hình 3 và 4. Định danh vi khuẩn Đặc điểm hình thái, kết quả thử kit API và phân tích trình tự gen 16S rRNA của chúng tôi cho thấy, các đặc điểm này ở chủng Bo 4.1 và Trau DAt có sự tương đồng, bổ trợ cho nhau, trong khi đó, ở chủng Be DA và Tr 2 lại có sự không tương thích. Chủng Bo 4.1: các đặc điểm sinh lý và hình thái của chủng Bo 4.1 cho thấy, chủng này là vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt, Gram dương, hình que, có khả năng tạo bào tử là các minh chứng giúp khẳng định thêm kết luận Nguyen Thi Thu Huyen et al. 84 chủng Bo 4.1 thuộc chi Clostridium. Chủng Bo 4.1 có khả năng sinh trưởng trên nguồn cacbon tinh bột (kết quả không trình bày ở đây). Điều này giống với đặc điểm sinh hóa của loài Clostridium roseum [3], Clostridium beijerinckii [16]. Tuy nhiên, tế bào chủng Bo 4.1 còn có tiên mao, đặc điểm này chỉ tương đồng với chủng Clostridium beijerinckii [23]. Đồng thời, chủng Bo 4.1 được phân lập từ phân bò, đây cũng là nguồn nguyên liệu giàu Clostridium beijerinckii [23]. Kết hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử, chúng tôi kết luận chủng Bo 4.1 thuộc loài Clostridium beijerinckii với độ tương đồng 99,9%. Hình 3. Vị trí phân loại của chủng Bo 4.1, Tr2 và Be DA với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen 16S rRNA. Hình 4. Vị trí phân loại của chủng Trau DAt với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen 16S rRNA. Chủng Trau DAt: các đặc điểm sinh lý và hình thái của chủng Trau DAt cho thấy, chủng này là vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt, Gram dương, hình que, có khả năng tạo bào tử là các minh chứng giúp khẳng định thêm kết luận cho thấy chủng Trau DAt thuộc chi TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 79-87 85 Thermoanaerobacterium hoặc chi Clostridium, chủng này phân lập từ phân trâu. Đây cũng là nguồn được biết đến như là nguồn chứa vi khuẩn Thermoanaerobacterium [17]. So sánh với các đặc điểm của chủng Trau DAt với loài Thermoanaerobacterium aciditolerans do Kublanov et al. công bố năm 2007 [10] cho thấy, chủng Trau DAt có nhiều đặc điểm tương đồng: vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng sinh bào tử, lên men glucose sinh hydro (kết quả không trình bày ở đây). Do đó, chúng tôi kết luận chủng Trau DAt thuộc loài Thermoanaerobacterium aciditolerans với độ tương đồng 99,3%. Chủng Tr2: kết quả phân tích 16S rRNA và kết quả thử kit API 20NE của chủng này hoàn toàn khác nhau, chính vì vậy, chúng tôi phải kết hợp thêm các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng này để xác định vị trí phân loại. Theo kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA, chủng Tr 2 thuộc chi Clostridium. Đây là chi được biết là nhóm vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt, Gram dương, sinh bào tử [5]. Trong khi đó, chủng Tr 2 lại là vi khuẩn Gram âm, sống trong điều kiện vi hiếu khí. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng chi Clostridium cũng có cả những loài Gram âm và có những loài có thể chịu được điều kiện có oxi [4, 8, 11]. Chủng Tr 2 lại có khả năng lên men sinh hydro tương đồng với các loài thuộc chi Clostridium, do đó, chúng tôi kết luận rằng, chủng Tr2 thuộc chi Clostridium. Chủng Be DA: kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy, chủng Be DA thuộc chi Clostridium. Cũng như trên vừa nêu chi Clostridium cũng có những loài không tạo bào tử và có những loài có thể chịu được điều kiện có oxi [4, 8, 11]. Đây là những đặc điểm phù hợp với chủng Be DA, vì vậy, chúng tôi kết luận rằng chủng Be DA thuộc chi Clostridium. Như vậy, phối hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử, 4 chủng có khả năng lên men sinh hydro cao trong nghiên cứu này thuộc 2 chi Thermoanaerobacterium và Clostridium. Chủng Trau DAt thuộc loài Thermoanaerobacterium aciditolerans với độ tương đồng 99,3%. Chủng Bo 4.1 thuộc loài Clostridium beijerinckii với độ tương đồng 99,9%. Hai chủng Tr 2 và Be DA chưa đủ căn cứ để định tên đến loài mà mới chỉ xác định được 2 chủng này thuộc chi Clostridium. Kết quả thu được còn cho thấy trong 4 chủng có khả năng sinh hydro cao trong nghiên cứu này thì 3 chủng thuộc chi Clostridium. Điều này một lần nữa cho thấy chi Clostridium là chi phổ biến về khả năng sinh hydro như khẳng định của Calusinska et al. (2010) [2]. Lời cảm ơn: Công trình được hỗ trợ về kinh phí thuộc đề tài của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số VAST 05.02/11-12 và sự hợp tác của Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương và Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Blackburn J., Liang Y., Das D., 2009. Biohydrogen from complex carbohydrate wastes as feedstocks-cellulose degraders from a unique series enrichment. Int J. Hydrogen Energy, 34: 7428-7434. 2. Calusinska M., Happe T., Joris B., Wilmotte A., 2010. The surprising diversity of clostridial hydrogenases: a comparative genomic perspective. Microbiol., 156: 1575- 1588. 3. Cato E. P., George W. L., Finegold S. M., 1986. Genus Clostridium Prazmowski 1880, 23AL. In: P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe, and J.G. Holt (ed.) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore pp. 1141-1200. 4. Collins M. D., Lawson P. A., Willems A., Cordoba J. J., Fernandez-Garayzabal J., Garcia P., Cai J., Hippe H., Farrow J. A., 1994. The phylogeny of the genus Clostridium: proposal of five new genera and eleven new species combinations. Int. J. Syst. Bacteriol., 44: 812-826. 5. Hasson A., 2009. Biohydrogen production from industrial organic wastes. J. Appl. Sci. Environt. Sanit., 4(1): 7-10. 6. Phạm Thị Hằng, Lại Thúy Hiền, 2010. Nghiên cứu vi khuẩn Dietzia sp. A343.4 mới phát hiện trong JetA1 và ảnh hưởng của Nguyen Thi Thu Huyen et al. 86 nó đến chất lượng nhiên liệu máy bay. Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(3A): 853-863. 7. Nguyễn Thị Thu Huyền, Đặng Thị Yến, Nguyễn Thị Yên, Vương Thị Nga, Lại Thuý Hiền, 2012. Sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt để tối ưu hoá quá trình sản xuất hydro sinh học của chủng Clostridium sp. Tr2 phân lập ở Việt Nam. Tạp chí sinh học, 34(4): 479-484. 8. Kalia V. C., Mukherjee T., Bhushan A., Joshi J., Shankar P., Huma N., 2011. Analysis of the unexplored features of rrs (16S rDNA) of the Genus Clostridium. BMC Genomics, 12: 18. 9. Kalia V. C., Purohit H. J., 2008. Microbial diversity and genomics in aid of bioenergy. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 35(5): 403- 419. 10. Kublanov I. V., Prokofeva I. M., Kostrikina A. N., Kolganova V. T., Tourova P. T., Wiegel J., Osmolovskaya B. A., 2007. Thermoanaerobacterium aciditolerans sp. nov., a moderate thermoacidophile from a Kamchatka hot spring. Inter. J. Syst. Evol. Microbiol., 57: 260-264. 11. Lawson P. A., Llop-Perez P., Hutson R. A., Hippe H., Collins M. D., 1993. Towards a phylogeny of the clostridia based on 16S rRNA sequences. FEMS Microbiol. Lett., 113: 87-92. 12. Ming L., Youcai Z., Qiang G., Xiaoqing Q., Dongjie N., 2008. Bio-hydrogen production fromfoodwaste and sewage sludge in the presence of aged refuse excavated from refuse landfill. Renew. Energy, 33: 2573- 2579. 13. Oh Y.-K., Park M. S., Seo E.-H., Lee S.-J., Park S., 2003. Isolation of Hydrogen- producing Bacteria from Granular Sludge of an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor. Biotechnol. Bioproc. Engineer 8: 54-57. 14. Orlygsson J., Sigurbjornsdottir M. A., Bakken H. E., 2010. Bioprospecting thermophilic ethanol and hydrogen producing bacteria from hot springs in Iceland. Icel. Agric. Sci., 23: 73-85. 15. O-Thong S., Hniman A., Prasertsan P., Imai T., 2011. Biohydrogen production from cassava starch processing wastewater by thermophilic mixed cultures. Int. J. Hydrogen Energy, 36: 3409-3416. 16. Qureshi N., Blaschek H. P., 2001. Recent advances in ABE fermentation: hyper- butanol producing Clostridium beijerinckii BA101. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 27(5): 287-291. 17. Romano I., Dipasquale L., Orlando P., Lama L., d’Ippolito G., Pascual J., Gambacorta A., 2010. Thermoanaerobacterium thermostercus sp. nov., a new anaerobic thermophilic hydrogen-producing bacterium from buffalo-dung. Extremophiles 14: 233-240. 18. Sakai S., Yagishita T., 2007. Microbial Production of Hydrogen and Ethanol from Glycerol-Containing Wastes Discharged from a Biodiesel Fuel Production Plant in a Bioelectrochemical Reactor with Thionine. Biotechnol. Bioeng., 98(2): 340-348. 19. Sakiyama Y., Nguyen K. N. T., Nguyen M. G., Miyadoh S., Duong V. H., Ando K., 2009. Kineosporia babensis sp. nov., isolated from plant litter in Vietnam. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 59: 550-554. 20. Shin H. S., Youn J. H., Kim S. H., 2004. Hydrogen production from food waste in anaerobic mesophilic and thermophilic acidogenesis. Int. J. Hydrog Energy, 29: 1355-1363. 21. Wang A., Gao L., Ren N., Xu J., Liu C., 2009. Bio-hydrogen production from cellulose by sequential co-culture of cellulosic hydrogen bacteria of Enterococcus gallinarum G1 and Ethanoigenens harbinense B49. Biotechnol. Lett., 31: 1321-1326. 22. Wu S. Y., Hung C. H., Lin C. N., Chen H. W., Lee A. S., Chang J. S., 2006. Fermentative hydrogen production and bacterial community structure in high-rate anaerobic bioreactors containing silicone- immobilized and self-flocculated sludge. Biotechnol. Bioeng., 93: 934-946. TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 79-87 87 SELECTION AND IDENTIFICATION OF SOME HYDROGEN PRODUCING BACTERIA ISOLATED FROM CATTLE FECES IN VIETNAM Nguyen Thi Thu Huyen1,2, Nguyen Thi Yen1, Vuong Thi Nga1, Dang Thi Yen1, Nguyen Thi Trang1, Lai Thuy Hien1 1Institute of Biotechnology, VAST 2Ton Duc Thang university, Ho Chi Minh city SUMMARY Global warming and dwindling fossil fuel supplies have led to a need to develop new, clean and sustainable energy supplies. Amongst, biohydrogen is recognized as a clean, renewable and promising energy alternative for the future since it is efficient and environmentally friendly. There are many possible solutions and a number of these are based on bacteria. Among biological hydrogen production processes, fermentative hydrogen production by strict or facultative anaerobic chemoheterotrophs is a promising method of sustainable hydrogen production. In present paper, four indigenous bacterial strains that are able to produce biohydrogen were studied. All four hydrogen producing bacteria were isolated from cattle feces in Vietnam. Cells of all strain are rod-shaped with different length. Strain Bo 4.1 has flagellum. All strains are Gram posititve bacteria excepting strain Tr2. Among Gram positive strains, only strain Be DA can not make sporulation whereas others Bo 4.1 and Trau DAt can. By combining morphological properties and 16S rRNA analyses, the anaerobic, mesophilic bacteria strain Bo 4.1 and the anaerobic, thermophilic bacterial strain Trau DAt were identified as Clostridium beijerinckii and Thermoanaerobacterium aciditolerans with 99.9%, 99.3% identity, respectively. The other facultative, mesophilic bacterial strains Be DA and Tr2 were characterized as Clostridium sp. basing on morphological properties, API standard kits and 16S rRNA analyses. Keywords: Clostridium, Thermoanaerobacterium, biohydrogen, hydrogen producing bacteria, cattle feces, Vietnam. Ngày nhận bài: 30-6-2013