Tối ưu hóa điều kiện thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo pectic oligosaccharide (POS) - Vũ Kim Dung

SUMMARY Pectic oligosaccharides (POS) have been proposed as a new class prebiotics capable of exerting a number of health-promoting effects. POS can be obtained by limited hydrolysis enzyme of pectin. The present study investigates the conditions of limited hydrolysis passion fruit pectin (Passiflora edulis flavicarpa) by pectinase. Pectin with concentration 1-5% (w/v) was hydrolyzed by Pectinex Ultra SP-L 30-50 U/g, pH 3-5, 40-60°C at 200-350 rpm with hydrolysis time of 1-7 hours. Research results show that pectin 3% (w/v), 40 U/g, pH 4, 50oC, 250 rpm, products have 18.76 mg POS/ml. Response surface methodology was used to model the processes. The temperature (45-55°C), enzyme concentration (30-50 U/g), and speed agitation (200-300 rpm) were the factors studied. Operational conditions leading to a maximum POS production were calculated from models being 53oC, 44 U/g, 270 rpm. Under the conditions, the model predicted that 24.55 mg/ml of POS can be obtained from pectin. Conversions to product increased from 62,53 to 81,83%. Products contain di and tri galacturonic acid.

doc6 trang | Chia sẻ: thucuc2301 | Lượt xem: 406 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Tối ưu hóa điều kiện thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo pectic oligosaccharide (POS) - Vũ Kim Dung, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): TCSH14-106 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN GIỚI HẠN PECTIN VỎ CHANH LEO TẠO PECTIC OLIGOSACCHARIDE (POS) Vũ Kim Dung1, 2*, Nguyễn Thị Xuân Sâm2, Nguyễn Thị Thu Hương2, Đặng Thị Thu2 1Trường Đại học Lâm nghiệp, *dungvucnsh@gmail.com 2Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TÓM TẮT: Bài báo khảo sát quá trình thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo trong khoảng nồng độ 1-5% (w/v) bởi lượng Pectinex Ultra SP-L từ 30-50 U/g pectin ở khoảng pH 3-5, nhiệt độ 40-60oC, tốc độ khuấy 200-350 vòng/phút với thời gian thủy phân 1-7 giờ và đã tìm được phương án thủy phân phù hợp cho 18,76 mg POS/ml dịch phản ứng. Tối ưu điều kiện thủy phân theo quy hoạch thực nghiệm bậc 2 Box-Benken đã nâng cao được nồng độ POS lên 24,55 mg/ml (53oC, 44 U/g, 270 vòng/phút, pH 4 sau 4 giờ thủy phân). Phổ sản phẩm POS thu được chứa chủ yếu di-galacturonic và tri-galacturonic. Từ khóa: pectic oligosaccharide, pectin vỏ chanh leo, pectinase, prebiotic, thủy phân giới hạn. MỞ ĐẦU Pectin có nguồn gốc từ thực vật, có nhiều trong vỏ táo, cam, chanh, quýt, mận... Vỏ quả chanh leo chiếm khoảng 60% khối lượng quả và chứa 2-3% pectin, là một nguồn phụ phẩm đáng kể để thu nhận pectin. Pectic oligosaccharide (POS) là một prebiotic thế hệ mới được thu nhận bằng cách thủy phân giới hạn pectin [2, 6-9]. POS được cấu tạo từ 2-10 gốc D-galacturonic nối với nhau bằng liên kết α (1-4) glucoside và đã được chứng minh là loại prebiotic có nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe của người và vật nuôi [3, 4, 8]. Hàm lượng POS thu nhận từ dịch thủy phân giới hạn khác nhau tùy thuộc vào nguyên liệu pectin, thời gian và điều kiện phản ứng. Trên 100 kg cơ chất pectin củ cải đường, Martinez et al. (2009) [7] sử dụng hỗn hợp polygalacturonase 10 U/g pectin, cellulase 0,725 U/g trong 12,8 giờ thu được 26,7 kg oligosaccharide. Từ pectin oliu kết hợp pectinesterase, polygalacturonase và pectin lyase thủy phân ở 40oC trong 72 giờ thu được POS dưới 3.000 Da [7]. Sabajanes et al. (2012) [9] thủy phân pectin từ vỏ cam sau 20 giờ ở 37oC, pH 5 thu được 13 kg POS/100 kg nguyên liệu. Để nâng cao hiệu suất quá trình thủy phân, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện theo hướng thủy phân liên tục, sử dụng kỹ thuật thủy phân màng hoặc nâng cao nồng độ cơ chất pectin [1, 5]. Mục đích của nghiên cứu này nhằm lựa chọn và tối ưu hóa điều kiện thủy phân giới hạn pectin chanh leo bằng Pectinex Ultra SP-L để thu nhận POS. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu gồm polygalacturonic acid; mono, di-galacturonic, tri-galacturonic acid (G1, G2, G3 tương ứng); DNS, bản mỏng silica TLC, butanol, acetic acid (Merck); pectinex utra-SPL có hoạt độ endo polygalacturonase 6835,4 U/ml (Novozymes); pectin (từ vỏ chanh leo vàng (Passiflora edulis flavicarpa) chiết bằng acid citric, DE 38%, hàm lượng pectin 95%, Đại học Bách Khoa Hà Nội). Xác định hoạt độ endo polygalacturonase: theo Combo et al. (2012) [2]. Phản ứng được thực hiện với 1 ml dung dịch pectin 3% (w/v) và 250 µl dung dịch enzyme ở 50oC. Sự giảm độ nhớt của dung dịch thủy phân pectin được xác định với nhớt kế Elcometer (Model 2300RV, Hoa Kỳ), tốc độ quay 200 vòng/phút, trục L2 trong thời gian 30 phút. Một đơn vị hoạt độ endo polygalacturonase là lượng enzyme cần thiết làm giảm 50% độ nhớt của dung dịch trong 30 phút ở 50oC và pH 4,5. Xác định hàm lượng pectic oligosaccharide: giá trị POS được xác định bằng hiệu số của lượng đường khử tổng của dịch thủy phân 2 trừ đi lượng đường khử tổng của dịch thủy phân 1 và nhân với hệ số 0,9. Pectin + enzyme ® Dịch thủy phân 1 (chứa POS) Dịch thủy phân 1 + HCl ® Dịch thủy phân 2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân giới hạn pectin Ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình thủy phân được khảo sát trong 100 ml dịch phản ứng với khoảng nồng độ pectin 1-5% (w/v), tỷ lệ enzyme/cơ chất 30-50 U/g, pH 3-5, nhiệt độ 40-60oC, tốc độ khuấy 200-350 vòng/phút, thời gian 1-7 giờ. Dịch sau thủy phân được phân tích hàm lượng POS và phổ oligosaccharide bằng sắc ký lớp mỏng TLC với hệ dung môi butanol: axit acetic: nước là 9: 4: 7 (v/v/v), hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy ở 120oC trong 5 phút. Tối ưu hóa điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Hoa Kỳ) với quy hoạch Box-Benken, ma trận thực nghiệm gồm 17 thí nghiệm với khoảng chạy của 3 yếu tố khảo sát là nhiệt độ (45-55oC), tỷ lệ enzyme/cơ chất (30-50 U/g), tốc độ khuấy (200-300 vòng/phút). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Lựa chọn nồng độ cơ chất và tỷ lệ enzyme/cơ chất thích hợp Trong khoảng khảo sát, với cùng một lượng enzyme sử dụng, nhận thấy ở các nồng độ cơ chất thấp (1 và 2%) phản ứng diễn ra nhanh chóng, sản phẩm đạt cực đại chỉ sau 2-3 giờ. Khi tăng nồng độ cơ chất lên độ nhớt của dịch phản ứng tăng nhanh và vận tốc phản ứng cũng giảm xuống rõ rệt nhất là ở nồng độ 4-5%. Với nồng độ pectin 3% (w/v) tốc độ phản ứng được duy trì và ổn định trong khoảng 3 giờ, hàm lượng oligosaccharide ngày càng tăng lên (hình 1a). Phổ sản phẩm trên hình 1b cho thấy ở nồng độ 4-5% còn nhiều pectin chưa được thủy phân. Do vậy, nồng độ cơ chất 3% được lựa chọn cho các thử nghiệm tiếp với các lượng enzyme khác nhau nhằm tăng lượng POS tạo thành. G1 G2 G3 G2 G3 G1 b a c M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 Hình 1. Ảnh hưởng của nồng độ pectin (a, b) và tỷ lệ enzyme/cơ chất (c) đến thủy phân pectin chanh leo tạo POS M: oligosaccharide chuẩn; b: giếng 1-5 tương ứng nồng độ cơ chất 1, 2, 3, 4, 5%; c: giếng 1-5 tương ứng với tỷ lệ enzyme/cơ chất 20, 30, 40, 50, 60 U/g. Bảng 1. Ảnh hưởng của một số yếu tố thủy phân tới lượng POS thu được Hàm lượng POS (mg/ml phản ứng) Tỷ lệ E/S (U/g) 20 9,65±0,42 Tốc độ khuấy (vòng/phút) 200 11,97±0,55 Thời gian (giờ) 1 7,02±0,31 30 13,95±0,65 250 18,43±0,90 2 9,98±0,45 40 15,65±0,70 300 13,84±0,62 3 13,79±0,65 50 12,64±0,60 350 11,04±0,52 4 18,76±0,90 60 10,57±0,52 5 18,53±0,91 Nhiệt độ (oC) 40 13,34±0,61 pH 3 10,07±0,50 6 18,05±0,90 50 16,13±0,80 4 17,63±0,81 7 17,87±0,85 60 9,06±0,43 5 13,05±0,62 Thử nghiệm thủy phân ở nồng độ cơ chất 3% cho thấy khi sử dụng tỷ lệ enzyme/cơ chất 20 và 30 U/g, lượng enzyme khá ít nên sau 4 giờ phản ứng vẫn còn nhiều pectin chưa được thủy phân. Tuy nhiên, khi tăng tỷ lệ này lên tới 50 và 60 U/g, quá trình thủy phân xảy ra sâu hơn, phổ sản phẩm xuất hiện lượng đường đơn (G1) khá nhiều (hình 1c). Ở tỷ lệ 40 U/g phổ sản phẩm chứa chủ yếu là đường đôi, đường ba và hàm lượng POS lớn nhất (bảng 1). Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy và thời gian Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân pectin tạo POS được diễn ra ở khoảng 40-60oC (hình 2a). Ở nhiệt độ 40°C tốc độ phản ứng thủy phân chậm (lượng G2 và G3 ít). Khi tăng nhiệt độ phản ứng lên 60°C, lượng đường đơn tạo ra quá nhiều. Trong khi phản ứng tiến hành ở 50°C, dịch thủy phân đã xuấthiện lượng G2 và G3 mong muốn. Thử nghiệm ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân pectin biểu diễn trên hình 2b cho thấy ở pH 4 lượng G2 và G3 được tạo thành nhiều và đường đơn ít, trong khi đó ở giá trị pH 3 và pH 5 cho kết quả ngược lại. Do dịch pectin có độ nhớt khá cao nên tốc độ phản ứng thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tốc độ khuấy. Trong các thử nghiệm, tốc độ khuấy 250 vòng/phút được lựa chọn do phổ sản phẩm thu được chủ yếu là G2 và G3 (hình 2c và bảng 1). Thời gian thủy phân phù hợp được lựa chọn sau 4 giờ, khi đó lượng POS đạt cao nhất (bảng 1), có thể do trong 3 giờ đầu pectin chưa phân cắt thành các oligosaccharide nên tạo vệt dài trên bản sắc ký (hình 2d). Kéo dài thời gian thủy phân đến 5-7 giờ, pectin bị thủy phân triệt để tạo thành đường đơn nên lượng POS giảm dần. G2 G3 G1 a b G2 G3 G1 G2 G3 G1 czb d G1 G2 G3 a M 1 2 3 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 Hình 2. Ảnh hưởng nhiệt độ (a), pH (b), tốc độ khuấy (c) và thời gian (d) đến thủy phân pectin chanh dây tạo POS M: oligosaccharide chuẩn; a: giếng 1-3 tương ứng với nhiệt độ 40, 50, 60oC; b: giếng 1-3 với pH 3, pH 4, pH 5; c: giếng 1-4 với tốc độ khuấy 200, 250, 300, 350 vòng/phút; d: giếng 1-6 với thời gian thủy phân 1, 2, 3, 4, 5 và 6 giờ Sau khi thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo 3% (w/v) bởi lượng Pectinex Ultra SP-L 40 U/g pectin ở pH 4, nhiệt độ 50oC, tốc độ khuấy 250 vòng/phút và thời gian thủy phân 4 giờ lượng POS thu được 18,76 mg/ml dịch phản ứng. Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân pectin tạo POS Qua khảo sát nhận thấy nhiệt độ (X1), tỷ lệ enzyme (X2), tốc độ khuấy (X3) ảnh hưởng mạnh đến quá trình thủy phân pectin tạo POS. Nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời của 3 yếu tố trên được xác định theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai để tối ưu điều kiện thủy phân pectin tạo POS. Các điều kiện thí nghiệm và hàm lượng POS được thể hiện ở bảng 2. Kết quả phân tích phương sai của mô hình tối ưu bằng phần mềm DX7.1.5 trình bày trong bảng 3 cho thấy, cả 3 yếu tố tỷ lệ enzyme/cơ chất, tốc độ khuấy và nhiệt độ đều ảnh hưởng mạnh đến quá trình thủy phân pectin tạo POS (giá trị p của X1, X2, X3 0,05) cho thấy mô hình này tương hợp với thực nghiệm. Giá trị p của X1X2, X1X3 và X2X3<0,05 nên sự đồng tác động của nhiệt độ và tỷ lệ enzyme/cơ chất với tốc độ khuấy ảnh hưởng mạnh tới quá trình thủy phân pectin tạo POS. Bảng 2. Ma trận thực nghiệm quá trình thủy phân pectin tạo POS TN X1 X2 X3 POS (mg/ml) TN X1 X2 X3 POS (mg/ml) 1 45 30 250 14,03 10 50 50 200 14,98 2 55 30 250 16,15 11 50 30 300 15,20 3 45 50 250 11,57 12 50 50 300 22,06 4 55 50 250 21,60 13 50 40 250 24,10 5 45 40 200 13,81 14 50 40 250 24,19 6 55 40 200 19,89 15 50 40 250 23,18 7 45 40 300 16,82 16 50 40 250 24,06 8 55 40 300 20,20 17 50 40 250 23,68 9 50 30 200 18,06 Bảng 3. Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình Thông số Phương sai Chuẩn F Mức có nghĩa p Thông số Phương sai Chuẩn F Mức có nghĩa p Mô hình 308,27 76,17 <0,0001 X2.X3 24,68 54,87 <0,0001 X1 58,38 129,82 <0,0001 X12 73,51 163,48 <0,0001 X2 5,73 12,74 0,0021 X22 77,22 171,72 <0,0001 X3 7,09 15,76 0,0011 X32 25,09 55,79 <0,0001 X1.X2 15,06 34,69 0,0001 Không tương thích 1,08 0,70 0,2475 X1.X3 1,80 4,01 0,0318 Phương trình hồi quy biểu hiện hàm lượng POS (Y) mô tả ảnh hưởng của các yếu tố được biểu diễn như sau: Y = +23,80 + 2,70*X1 + 0,85*X2 + 0,94*X3 + 1,98*X1*X2 - 0,68*X1*X3 + 2,48*X2*X3 - 3,95X12 - 4,05X22 - 2,21*X32. Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hóa hàm lượng POS thu được sau quá trình thủy phân thu được 43 phương án thí nghiệm. Với phương án tốt nhất là 43,72 U/g pectin, nhiệt độ 52,68°C và tốc độ khuấy là 269,62 vòng/phút, hàm lượng POS tính toán đạt 24,55 mg/ml (hiệu suất thủy phân 81,83%). Thực nghiệm tại điều kiện nhiệt độ 53oC, pH 4,0, tỷ lệ enzyme/cơ chất 44 U/g, tốc độ khuấy 270 vòng/phút sau 4 giờ thủy phân lượng POS thu được là 24,35 mg/ml, có độ tương thích cao so với lý thuyết. Hơn nữa, hình 3 cho thấy, dịch thủy phân pectin 3% thu được sau khi tối ưu có hàm lượng POS cao hơn so với trước khi tối ưu và chủ yếu chứa các di, tri galacturonic. G2 G3 G1 M 1 2 3 Hình 3. Sản phẩm thủy phân giới hạn pectin tạo POS sau khi tối ưu M: oligosaccharide chuẩn; 1: pectin chưa thủy phân; 2: dịch thủy phân trước tối ưu; 3: dịch thủy phân sau tối ưu Mặc dù nguồn gốc, nồng độ cơ chất và enzyme khác nhau dẫn đến điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS khác với công bố của một số tác giả [2, 6-9]. Nikolic & Mojovic (2007) [8] thủy phân pectin táo ở điều kiện (1% pectin, 162 U polygalacturonase/l, pH 4,5; 50oC) sau 12 giờ đạt hiệu suất thủy phân 29% trong đó dạng G3 chiếm 28,4% và 34,1% sau 24 giờ. Combo et al. (2012) [2] thủy phân 0,2% polygalacturonic acid bằng endo-polygalacturonase trong 2 giờ ở 40oC, pH 5,5 thu được POS có hàm lượng G3>G2>G1 lần lượt là 58%, 18% và 13%. Tuy nhiên, dịch thủy phân giới hạn pectin chanh leo tạo POS ở điều kiện tối ưu chiếm chủ yếu G2 và G3 tương tự như kết quả của Combo et al. (2012), Nikolic & Mojovic (2007) [2, 8]. KẾT LUẬN Bài báo đã lựa chọn được nồng độ pectin 3% và các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân pectin chanh leo tạo POS (24,55 mg/ml). Hiệu suất thủy phân đạt 81,83% và đã cải thiện so với trước khi tối ưu. Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài 04.14/CNSHCB từ Bộ Công thương. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bélafi-Bakó K., Eszterle M., Kiss K., Nemestóthy N., Gubicza L., 2007. Hydrolysis of pectin by Aspergillus niger polygalacturonase in a membrane bioreactor. J. Food Eng., 78: 438-442. Combo A. M. M., Aguedo M., Goffin D., Wathelet B., Paquot M., 2012. Enzymatic production of pectic oligosaccharides from polygalacturonic acid with commercial pectinase preparations. Food Bioprod. Process., 90: 588-596. Gullo’n B., Gullo´n P., Sanz Y., Alonson J.L., 2011b. Prebiotic potential of a refined product containing pectic oligosaccharides. LWT-Food Sci. Technol., 44: 1687-1696. Gullo´n P., Gonza´lez-Mun˜oz M. J., Parajo´J. C., 2011a. Manufacture and prebiotic potential of oligosaccharides derived from industrial solid wastes. Bioresource Technol., 102: 6112-6119. Kiss K., Nemestothy N., Gubicza L., Belafi-Bak K., 2009. Vacuum assisted membrane bioreactor for enzymatic hydrolysis of pectin from various agro-wastes. Desalination, 241: 29-33. Lama-Munoz A., Rodriguez-Gutierrez G., Rubio-Senent F., 2012. Production, characterization and isolation of neutral and pectic oligosaccharides with low molecular weights from olive by-products thermally treated. Food Hydrocoll., 28: 92-104. Martınez M., Gullon B., Yanez R., Alonso J. L., Parajo J. C., 2009. Direct enzymatic production of oligosaccharide mixtures from sugar beet pulp: experimental evaluation and mathematical modeling. J. Agric. Food Chem., 57(12): 5510-5517. Nikolic M. V., Mojovic L., 2007. Hydrolysis of apple pectin by the coordinated activity of pectic enzymes. Food Chem., 101: 1-9. Sabajanes M. M., Yáñez R., Alonso J. L., Parajó J. C., 2012. Pectic oligosaccharides production from orange peel waste by enzymatic hydrolysis. Int. J. Food Sci. Technol., 47(4): 747-754. CONDITIONS OF LIMITED HYDROLYSIS PRODUCING PECTIC OLIGOSACCHARIDES (POS) OF HIGH CONCENTRATION PASSION FRUIT PECTIN Vu Kim Dung1, 2*, Nguyen Thi Xuan Sam2, Nguyen Thi Thu Huong2, Dang Thi Thu2 1Vietnam Forestry University, *dungvucnsh@gmail.com 2Institute of Biological and Food Technology, Hanoi University of Science and Technology SUMMARY Pectic oligosaccharides (POS) have been proposed as a new class prebiotics capable of exerting a number of health-promoting effects. POS can be obtained by limited hydrolysis enzyme of pectin. The present study investigates the conditions of limited hydrolysis passion fruit pectin (Passiflora edulis flavicarpa) by pectinase. Pectin with concentration 1-5% (w/v) was hydrolyzed by Pectinex Ultra SP-L 30-50 U/g, pH 3-5, 40-60°C at 200-350 rpm with hydrolysis time of 1-7 hours. Research results show that pectin 3% (w/v), 40 U/g, pH 4, 50oC, 250 rpm, products have 18.76 mg POS/ml. Response surface methodology was used to model the processes. The temperature (45-55°C), enzyme concentration (30-50 U/g), and speed agitation (200-300 rpm) were the factors studied. Operational conditions leading to a maximum POS production were calculated from models being 53oC, 44 U/g, 270 rpm. Under the conditions, the model predicted that 24.55 mg/ml of POS can be obtained from pectin. Conversions to product increased from 62,53 to 81,83%. Products contain di and tri galacturonic acid. Keywords: Limited hydrolysis, passion fruit pectin, pectic oligosaccharide, pectinase, prebiotic. Ngày nhận bài: 22-10-2014

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • doc6057_21946_1_pb_8095_5016_2017973.doc
Tài liệu liên quan