Thiết kế vector chuyển gen kháng virus mang gen chọn lọc thân thiện với môi trường - Lê Thị Thủy

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS MANG GEN CHỌN LỌC THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƯỜNG Lê Thị Thủy2, Nguyễn Thị Thu Hiền1, Phạm Thị Vân1, Lê Văn Sơn1* 1Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *leson_03@yahoo.com 2Trường Đại học Sư phạm Hà Nội TÓM TẮT: Việc tạo được một vector chuyển gen thực vật mang gen chọn lọc tích cực nhằm tạo ra những cây trồng biến đổi gen thân thiện với môi trường sẽ góp phần thúc đẩy việc thương mại hóa sản phẩm chuyển gen. Trong nghiên cứu này, một vector chuyển gen nhị thể, pK7M/TMV-CPi chứa cấu trúc RNAi TMV-CPi và gen manA đã được thiết kế. Cấu trúc RNAi TMV-CPi là một cát sét mang gen chuyển lặp lại đảo chiều - đọạn gen mã hóa protein vỏ (coat protein, CP) của virus TMV (Tobacco mosaic virus) nhằm làm bất hoạt gen CP của TMV trong các cây chuyển gen kháng virus này. Gen manA mã hóa cho enzyme phosphomannose isomerase (PMI) là một marker chọn lọc tích cực cho phép sử dụng mannose làm chất chọn lọc. Để kiểm tra hiệu quả của vector thiết kế, cấu trúc RNAi TMV-CPi và gen manA trong vector này đã được chuyển vào hai giống thuốc lá Nicotiana tabacum K326 và C9-1 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sử dụng hệ thống chọn lọc bằng đường mannose, 40 dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 của cả hai giống phát triển bình thường trên môi trường chọn lọc đã được phân tích bằng lây nhiễm nhân tạo virus và PCR. Kết quả cho thấy, có 64,3% (18/28) dòng thuốc lá chuyển gen K326 và 58,3% (7/12) dòng thuốc lá chuyển gen C9-1 có biểu hiện kháng virus TMV hoàn toàn và dương tính với PCR gen chuyển. Từ khóa: Nicotiana tabacum, RNAi, manA, chọn lọc tích cực, khảm thuốc lá, TMV. MỞ ĐẦU Việc thay thế các gen chọn lọc gây nên những lo lắng về độ an toàn với sức khỏe con người và môi trường như các gen kháng lại kháng sinh hygromycin (hpt) và kanamycin (nptII) hoặc kháng lại các chất diệt cỏ như phosphinothricin (bar) và chlorosulfuron (als) bằng thế hệ các gen chọn lọc tích cực, thân thiện với môi trường đang là vấn đề được quan tâm trong các nghiên cứu chuyển gen vào thực vật. Gen manA mã hóa cho enzyme phosphomannose isomerase (PMI) có nguồn gốc từ Escherichia coli [5] là một trong những gen chọn lọc tích cực được chuyển thành công ở một số loại thực vật như: củ cải đường [4], ngô [11, 12], lúa mì [12], Arabidopsis [9], cà chua [7], đủ đủ [13], hành tây [1] và dưa chuột [2]. Tế bào thực vật mang gen này thì trên môi trường có bổ sung mannose (Man), PMI sẽ biến đổi mannose-6-phosphate thành fructose-6-phosphate có thể sử dụng như là chất dinh dưỡng của tế bào. Vì thế các tế bào chuyển gen sẽ phát triển được trên môi trường có đường Man thay vì sacrose trong điều kiện bình thường. Đối với các tế bào không chuyển gen, bản thân đường Man không gây độc, nhưng khi bị phốt pho hóa bởi hexokinase thành mannose-6-phosphate dẫn đến các tế bào không thể phát triển được. RNAi là cơ chế tự nhiên của tế bào sống có thể làm bất hoạt một gen nào đó. Bằng sự phát triển của công nghệ sinh học, cơ chế của quá trình này đã được làm sáng tỏ. Cho đến nay, RNAi được phát triển thành kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu trong việc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật [8]. Trong bài báo này, một vector chuyển gen kháng virus TMV theo cơ chế RNAi đã được thiết kế mang gen chọn lọc Man. Cấu trúc này đã được thử nghiệm chuyển vào cây thuốc lá, cây công nghiệp mẫn cảm với virus TMV, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của thuốc lá. Các dòng thuốc lá chuyển gen thu được trên môi trường chọn lọc Man đã được phân tích khả năng kháng virus TMV nhân tạo. Kết quả thu được là cơ sở cho thiết kế vector mang cấu trúc RNAi và gen chọn lọc an toàn với sức khỏe con người. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Gen CP (coat protein) của virus TMV thu thập tại Bắc Giang có trong vector pENTRY [10]. Vi khuẩn E. coli chủng DH5a và DB3.1, Agrobacterium tumefaciens CV58C1 mang plasmid gây độc pGV2260. Vector chuyển gen pK7GWIWG2(II), pNOV-gusplus. Giống thuốc lá Nicotiana tabacum L. K326 và C9-1 đang nuôi cấy trong điều kiện in vitro. Các nguồn vật liệu được cung cấp bởi Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học. Phương pháp Thiết kế vector RNAi gốc chọn lọc bằng đường Man Vector RNAi gốc chọn lọc bằng đường Man được tạo từ 2 vector pK7GWIWG(II) và pNOV-gusplus có chứa gen manA. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn SphI, HindIII và enzyme tạo đầu bằng T4 DNA polymerase để tạo trình tự gốc RNAi từ pK7GWIWG(II). Trình tự gen manA thu được nhờ phản ứng cắt bởi 2 enzyme PmeI và HindIII với vector pNOV-gusplus. Vector pK7-M là vector RNAi gốc chọn lọc bằng đường Man được tạo ra bằng phản ứng ghép nối từ 2 đoạn RNAi gốc và PMI nhờ enzyme T4 ligase. Sản phẩm được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DB3.1. Plasmid từ các khuẩn lạc được tách chiết theo Sambrook et al. (2001) [6] và tiến hành kiểm tra bằng 2 enzyme cắt giới hạn HindIII và XbaI (Fermentas). Thiết kế vector RNAi chuyển gen đơn đoạn kháng virus TMV Sử dụng phương pháp LR (Gateway-Invitrogen) để tạo vector RNAi chuyển gen kháng virus từ vector gốc pENTRY/CP chứa trình tự của gen CP của virus TMV được thu thập từ Bắc Giang và vector RNAi chứa gen chọn lọc bằng mannose (pK7-M). Sản phẩm phản ứng LR được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Plasmid được tách, thu và kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn XbaI và HindIII. Các dòng khuẩn lạc đã biến nạp thành công sẽ được kiểm tra một lần nữa với phản ứng khuếch đại đoạn gen CP thông qua phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu TMV-Fi và TMV-Ri. Tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng virus TMV Mảnh lá của hai giống thuốc lá K326 và C9-1 được nhiễm khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen trong thời gian 10 phút. Sau đó, các mảnh lá được đặt trên môi trường đồng nuôi cấy 2 ngày. Sau 2 ngày, mảnh lá được chuyển sang môi trường chọn lọc chứa 30 g/l Man, MS (I-V), 1 mg/l BAP và 250 mg/l Cefotaxim. Sau 3-4 tuần, các chồi tái sinh từ mảnh lá được cắt chuyển sang môi trường ra rễ (MS (I-V), 30 g/l Man, 250 mg/l Cefotaxim). Các chồi ra rễ, sinh trưởng tốt trên môi trường khi đạt chiều cao 4-6 cm sẽ tiến hành ra cây ở nhà lưới. Phân tích sự có mặt của gen chuyển bằng PCR và lây nhiễm nhân tạo DNA tổng số được tách chiết nhanh từ mẫu lá các cây chuyển gen. Phân tích PCR được thực hiện để khuếch đại đoạn gen chuyển CP của virus TMV bằng cặp mồi TMV-Fi (5’-CACCATGAAACCTTCACCACA-3’) và TMV-Ri (5’- CTAGGTCCAAACCAAACCA G-3’). Các dòng cây chuyển gen được kiểm tra tính kháng bằng phương pháp lây nhiễm virus nhân tạo của Herbers et al. (1996) [3] có cải tiến. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tạo vector chuyển gen pK7-M gốc mang gen chọn lọc Man Để thiết kế được cấu trúc RNAi, vector pK7GWIWG(II) đã được cắt bằng enzyme SphI. Sản phẩm cắt thu được chứa đoạn gen có kích thước khoảng 4935 bp là đoạn DNA mang cấu trúc RNAi chứa ccdB và intron. Vì enzyme SphI cắt tạo đoạn gen có đầu lệch, nên chúng được tạo đầu bằng nhờ enzyme T4 DNA polymerase. Sản phẩm này tiếp tục được xử lý bởi enzyme HindIII để tạo nên đoạn gen có vị trí cắt enzyme hạn chế thích hợp với vector chuyển gen mong muốn pNOV-gusplus (hình 1a). Vector pNOV-gusplus được cắt đồng thời bởi 2 enzyme PmeI và HindIII. Sản phẩm cắt thu được có hai phân đoạn kích thước khoảng 7000 và 3500 bp. Trong đó, đoạn DNA có kích thước 7000 bp là đoạn có mang gen manA mã hóa PMI cần quan tâm được tinh sạch phục vụ cho phản ứng ghép nối với cấu trúc RNAi (hình 1b). Đoạn gen RNAi và manA được ghép nối với nhau tạo vector pK7-M nhờ enzyme T4 ligase. Sản phẩm của phản ứng ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DB3.1 (hình 1c) và được phân tích bằng PCR và enzyme hạn chế HindIII. Kết quả cho thấy, sản phẩm cắt pK7-M bởi HindIII đã thu được một phân đoạn có kích thước khoảng 12000 bp đúng như tính toán lý thuyết (hình 1d). Điều này chứng tỏ việc thiết kế vector pK7-M đã thành công. a b c d Hình 1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen pK7-M a. Sản phẩm cắt vector pK7GWIWG(II) bằng SphI và HindIII; b. Sản phẩm cắt vector pNOV-gusplus bằng PmeI và HindIII; c. Sản phẩm tách plasmid pK7-M; d. Sản phẩm cắt pK7-M bằng HindIII; M. Thang DNA chuẩn; 1, 2, 3, Mẫu thí nghiệm. Thiết kế vector RNAi chuyển gen kháng virus TMV chọn lọc bằng Man Kỹ thuật Gateway là một kỹ thuật dòng hóa phổ biến, cho phép chuyển đoạn DNA giữa các vector tách dòng khác nhau trong khi vẫn duy trì định hướng chính và cấu trúc đọc, thay thế việc sử dụng enzyme cắt giới hạn và enzyme nối hiệu quả. Kỹ thuật này là một phương pháp có hiệu quả cao cho việc tách dòng có định hướng của các sản phẩm PCR. Kỹ thuật này gồm có hai loại phản ứng LR và BR. Trong nghiên cứu này, phản ứng LR được thực hiện giữa vector tiếp nhận pENTRY mang đoạn gen CP của virus TMV và vector đích pK7-M dưới sự xúc tác bởi hỗn hợp enzyme LR ClonaseTM II . Vector tái tổ hợp tạo thành sau phản ứng được kí hiệu là pK7M/TMV-CPi, là cấu trúc vector cần thiết kế (hình 2). Cấu trúc vector này đã được kiểm tra bằng phản ứng colony- PCR và enzyme cắt hạn chế XbaI và HindIII. Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm plasmid pK7M/TMV-CPi cắt bởi hai enzyme này thu được hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 8000 bp và 2700 bp, tương ứng với vector pK7M gốc cả hai phân đoạn có kích thước 8600 và 3300 bp. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme hạn chế trên hình 3a cho thấy, dòng khuẩn lạc số 1 và 2 thu được các phân đoạn có kích thước như dự tính. Điều này khẳng định hai dòng khuẩn lạc này đều chứa vector chuyển gen pK7M/TMV-CPi có cả hai vị trí tái tổ hợp chứa đoạn gen CPi chèn vào. Để khẳng định thêm sản phẩm mang gen CP của virus TMV, các dòng khuẩn lạc này được thực hiện PCR với các cặp mồi đặc hiệu TMV-Fi/TMV-Ri. Từ kết quả điện di trên hình 3b cho thấy các dòng có kết quả PCR dương tính với kích thước đúng như mong đợi. Điều này chứng tỏ gen CP đã được thiết kế thành công vào vector RNAi. Kết quả chọn dòng bằng phản ứng PCR và phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn đã thu được dòng khuẩn lạc dương tính mang vector pK7M/TMV-CPi quan tâm. Cấu trúc này sẽ tạo ra RNA CPi dạng kẹp tóc bổ sung chính nó có intron (intron-hairpin RNA, ihpRNA) sau khi được chuyển vào cây trồng. Cấu trúc RNAi pK7M/TMV-CPi này tiếp tục được kiểm tra khả năng biểu hiện trong cây thuốc lá. Hình 2. Bản đồ cấu trúc vector pK7M/TMV-CPi P35S, Promoter 35S của Cauliflower mosaic virus; attB1 và attB2, các vị trí tái tổ hợp trong phản ứng LR. LB, left T-DNA border; RB, right T-DNA border; T35S, terminator 35S; PMI, gen kháng mannose; CmR, gen kháng Chloramphenicol. Vị trí các điểm cắt giới hạn của enzyme XbaI và HindIII; TMV, đoạn gen CPi của virus TMV. a b Hình 3. Sản phẩm colony-PCR các dòng khuẩn lạc mang vector pK7-M/TMV-CPi a. Sản phẩm cắt plasmid pK7-M/TMV-CPi bằng 2 enzyme XbaI và HindIII; b. Sản phẩm colony-PCR các dòng khuẩn lạc mang vector pK7-M/TMV-CPi; Đường chạy 1, 2, 3, các dòng khuẩn lạc được kiểm tra; Đường chạy (-), đối chứng âm (mẫu không chứa DNA khuôn); Đường chạy (+), đối chứng khuôn (DNA là vector pENTRY/TMV-CPi) d c a b Hình 4. Các cây thuốc lá chuyển gen giống K326 a. Các chồi thuốc lá chuyển gen trên môi trường Man 30mg/l; b. Rễ các chồi thuốc lá chuyển gen trên môi trường Man 30 mg/l; c. Cây chuyển gen biểu hiện bệnh khảm sau lây nhiễm virus TMV; d. Cây chuyển gen không nhiễm bệnh sau lây nhiễm virus TMV. 313 bp Hình 5. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá M. Thang DNA chuẩn 1 kb (Fermentas) ; Đường chạy 1-14. Sản phẩm PCR bằng cặp mồi TMV Fi/TMV Ri của mẫu thuốc lá chuyển gen C9-1 và K326; Đường chạy (+). đối chứng dương là plasmid TMV-RNAi; Đường chạy (-). đối chứng âm. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen chọn lọc Man kháng TMV Thuốc lá là một trong những cây mô hình trong nghiên cứu chuyển gen bởi khả năng nuôi cấy invitro dễ dàng, tỷ lệ tái sinh và hiệu quả chuyển gen cao. Ngoài ra, thuốc lá là một trong những cây chủ phổ biến của TMV. Vì vậy, nhằm mục đích kiểm tra hiệu quả của vector chuyển gen thiết kế, 2 giống thuốc lá thương mại ở Việt Nam là K326 và C9-1 hiện đang chịu thiệt hại nặng nề do virus TMV gây ra đã được lựa chọn để chuyển cấu trúc pK7M/TMV-CPi thông qua A. tumefaciens. Có 40 dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 phát triển bình thường trên môi trường chọn lọc Man 30 mg/l từ 2 giống thuốc lá K326 và C9-1 được đánh giá khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo và PCR (bảng 1). Bảng 1. Kết quả chuyển gen và phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen pK7M/TMV-CPi ở thế hệ T0 Giống thuốc lá Chuyển gen và tái sinh Lây nhiễm nhân tạo PCR dương tính Số mẫu thí nghiệm x số lần thí nghiệm Số mẫu cảm ứng tạo chồi* Tổng số chồi tách* Số chồi phát triển bình thường** Số cây lây nhiễm Số cây kháng virus hoàn toàn Tỷ lệ kháng (%) Gen CPi Gen manA K326 50 x 2 46,5 ± 0,7 131,0 ± 4,2 14,0 ± 2,8 28 18 64,3 18 18 C9-1 50 x 2 43,5 ± 2,1 73,0 ± 2,8 6,0 ± 1,4 12 7 58,3 7 7 WT-K326 5 x 2 4,5 ± 0,7 13,5± 2,1 0 10 0 0 0 0 WT-C9-1 5 x 2 3,5 ± 0,7 11,0± 1,4 0 10 0 0 0 0 WT-K326, WT-C9-1: Cây thuốc lá không chuyển gen giống K326 và C9-1; *: mẫu thí nghiệm nuôi cấy trên môi trường không có Man; **: Mẫu thí nghiệm nuôi cấy trên môi trường có Man 30 mg/l. Sau ba lần lây nhiễm nhân tạo virus TMV, 64,3% (18/28) dòng thuốc lá chuyển gen K326 và 58,3% (7/12) dòng thuốc lá C9-1 chuyển gen ở thế hệ T0 có biểu hiện kháng bệnh hoàn toàn. Tất cả những dòng có biểu hiện kháng bệnh hoàn toàn này tiếp tục được kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng PCR. Kết quả, có 100% dòng kiểm tra dương tính với PCR. Điều này đã chứng tỏ vector thiết kế đã hoạt động hiệu quả. Việc thiết kế vector chuyển gen kháng virus mang gen chọn lọc Man đã thành công. KẾT LUẬN Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi TMV-M-CPi và gen chọn lọc mannose thân thiện với môi trường đã được thiết kế thành công. Đồng thời cấu trúc này đã được chuyển thành công vào 2 giống thuốc lá K326 và C9-1 với tỉ lệ kháng virus TMV lần lượt là 64,3% và 58,3% trên tổng số dòng kiểm tra. Lời cảm ơn: Công trình được hỗ trợ về kinh phí từ đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu tạo giống thuốc lá kháng bệnh khảm lá và xoăn đọt bằng kĩ thuật chuyển gen”. Tập thể tác giả xin chân thành cảm ơn Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ chúng tôi thực hiện nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO Aswath C. R., Mo S. Y., Kim D. H., Park S. W., 2006. Agrobacterium and biolistic transformation of onion using non-antibiotic selection marker phosphomannose isomerase. Plant Cell Rep., 5: 92-99. He Z., Duan Z., Liang W., Chen F., Yao W., Liang H., Yue C., Sun Z., Chen F., Dai J., 2006. Mannose selection system used for cucumber transformation. Plant Cell Rep., 25(9): 953-958. Herbers K., Meuwly P., Wolf B., Metraux J. P., Sonnowald U., 1996. Systemic acquired resistance mediated by the ectopic expression of invertase: possible hexose sensing in the secretory pathway. Plant Cell, 8: 793-803. Joersbo M., Donaldson I., Kreiberg J.,Petersen S. G., Brunstedt J., Okkels F. T., 1998. Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet. Mol. Breed., 4: 111-117. Miles J. S., Guest J. R., 1984. Nucleotide sequence and transcriptional start point of the phosphomannose isomerase gene (manA) of Escherichia coli. Gene, 32: 41-48. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T., 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Sigareva M., Spivey R., Willits M. G,, Kramer C. M., Chang Y. F., 2005. An efficient mannose selection protocol for tomato that has no adverse effect on the ploidy level of transgenic plants. Plant Cell Rep., 23: 236-245. Smith N. A., Singh S. P., Wang M. B., Stoutjesdijl P. A., Green A. G., Waterhouse P. M., 2000. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature, 407: 319-20. Todd R., Tague G. W., 2001. Phosphomannose isomerase: a versatile selectable marker for Arabidopsis thaliana germ-line transformation. Plant Mol. Biol. Rep., 19: 307-319. Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Hà Viết Cường, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, 2009. Tạo cây thuốc lá kháng virus TMV bằng kỹ thuật RNAi. Hội thảo quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam. Ninh Thuận, 25-26/07/2009. Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội: 32-40. Wang A.S., Evans R.A., Altendorf P.R., Hanten J.A., Doyle M.C., Rosichan J.L., 2000. A mannose selection system for production of fertile transgenic maize plants from protoplasts. Plant Cell Rep., 19:654-660. Wright M., Dawson J., Dunder E., Suttie J., Reed J., Kramer C., Chang Y., Novitzky R., Wang H., Artim-Moore L., 2001. Efficient biolistic transformation of maize and wheat using the phosphomannose isomerase gene, pmi as the selectable marker. Plant Cell Rep., 20: 429-436. Zhu Y. J., Agbayani R., McCafferty H., Albert H. H., Moore P. H., 2005. Effective selection of transgenic papaya plants with the PMI/Man selection system. Plant Cell Rep., 24:426-432. CONSTRUCTION OF TRANSFORMATION VECTOR CARRYING ENVIROMENTAL FRENDLY SELECTION MARKER AND VIRUS RESISTANT GENE Le Thi Thuy2, Nguyen Thi Thu Hien1, Pham Thi Van1, Le Van Son1 1Institute of Biotechnology, VAST 2Hanoi National University of Education SUMMARY The design of a plant transformation vector carrying environmental friendly selection marker gene for production of bio-safety transgenic plants will promote the commercialization of transgenic products. In this study, a binary transformation vector pK7M/TMV-CPi containing TMV-CPi RNAi construct and manA gene was constructed. TMV-CPi RNAi construct is a inverted repeat transgene cassette, containing partial coat protein gene sequence of tobacco mosaic virus (TMV), that can silence the CP gene of TMV in the TMV resistant transgenic plants. ManA gene encoding phosphomannose isomerase (PMI) enzyme is a positive selectable marker which allows using mannose for selection. With this vector, the TMV-CPi RNAi construct and manA gene have been transformed into two Nicotiana tabacum cv. K326 and C9-1 via Agrobacterium tumefaciens. There were 100 T0 transgenic tobacco lines (64 of K326 and 34 of C9-1 transgenic tobacco lines) which growing well on mannose selective medium were analyzed by artificial inoculation with TMV and PCR. The result showed that 64.3% (18 of 28) and 58.3 % (7 of 12) of K326 and C9-1 transgenic tobacco lines, respectively, were completely resistant to TMV and positive PCR with transgene. Keywords: Nicotiana tobacum, RNA interference (RNAi), manA gene, positive selection, tobacco mosaic virus. Ngày nhận bài: 20-6-2013