Tạo nguyên liệu in Vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch hoa xà (plumbago zeylanica L.) - Bùi Đình Thạch

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169 161 TẠO NGUYÊN LIỆU IN VITRO VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) Bùi Đình Thạch*, Nguyễn Minh Hiếu, Phạm Thị Phương Uyên, Ngô Kế Sương, Nguyễn Hữu Hổ Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)thachden78@yahoo.com TÓM TẮT: Với mục tiêu nhân giống in vitro cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) từ đoạn thân tạo nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy in vitro và chuyển gen, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, thời gian khử trùng 20 phút, 10% dung dịch javel là điều kiện tối ưu cho tạo mẫu in vitro (41,29%), môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L BA và 0,1 mg/L IBA tạo được chồi tối ưu (4,67 chồi/mẫu) sau 4 tuần nuôi cấy, chồi in vitro phát triển thành cây tốt nhất ở môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/L IBA. Hai chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogen 11325 và 15834 được sử dụng trong công thức chuyển gen tạo rễ tơ, kết quả bước đầu đã chọn lọc 5 dòng rễ được cho là thể chuyển gen. Từ khóa: Agrobacterium rhizogen, Plumbago zeylanica, in vitro, nuôi cấy. MỞ ĐẦU Cây bạch hoa xà, có tên khoa học là Plumbago zeylanica L., thuộc họ Plumbaginaceae, là một cây dược liệu có nguồn gốc từ vùng Tây Bắc châu Á [2], được phân bố ở một số vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Úc, châu Á và châu Phi [19]. Theo y học cổ truyền, cây Bạch hoa xà được sử dụng điều trị một số bệnh về da như bị vết thương, chàm, bệnh ghẻ, bệnh phong [1]. Nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều bộ phận như rễ, lá và cành của cây được sử dụng như nguồn dược liệu. Rễ cây chứa một acrid crystalline gọi là plumbagin, một naphtoquinone màu vàng được sử dụng như dược chất ở Ấn Độ từ khoảng 750 năm trước công nguyên dùng kháng ký sinh, bổ tim, bảo vệ gan và bảo vệ thần kinh. Ngoài ra, nhiều hoạt chất khác nhau được ghi nhận trong rễ cây này, bao gồm phenolic acids, tannins, anthocyanin... có hoạt tính kháng khuẩn [13]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, plumbagin được chiết tách từ cây có khả năng kháng ung thư [12], kháng khuẩn [4, 5], kháng sốt rét [8], ức chế hoạt động phân chia tế bào [3], kháng đột biến, kháng côn trùng [8] và làm giảm cholesterol tổng số [12]. Cây bạch hoa xà sinh trưởng chậm trong điều kiện tự nhiên, các rễ của cây dùng để thu nhận plumbagin cần nhiều năm mới cho hàm lượng hoạt chất cao [7]. Ở Việt Nam, do chưa có qui hoạch tổng thể vùng trồng thu nguyên liệu, vì vậy, việc khai thác rễ tự nhiên dùng làm nguồn dược liệu chế biến sản phẩm tiêu tốn nhiều thời gian, làm cạn kiệt lượng cây phân bố ngoài tự nhiên. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu tạo nguyên liệu cây in vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes trên cơ sở dùng mô nguyên liệu in vitro đã tạo được hướng mục đích dài hạn là nuôi nhân quy mô lớn sinh khối rễ tơ bằng phương pháp công nghệ sinh học, góp phần đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng chế biến sản phẩm sử sụng trong lĩnh vực y dược. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica) sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên ở tỉnh Phú Yên được lấy mẫu đọan thân để khử trùng; sử dụng 2 chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC (American Type Culture Collection) 15934 và ATCC 11325 [dạng hoang dại (wild type), đều chứa plasmid pRi mang các gen rol (root loci) như rolB và rolC trên vùng T-DNA] được cung cấp bởi Phòng Công nghệ gen, Viện Sinh học nhiệt đới. Phương pháp Khử trùng mẫu cấy Bui Dinh Thach et al. 162 Đoạn thân (dài khoảng 1,5 cm) chứa chồi ngủ được rửa dưới vòi nước máy trong 10-15 phút, sau đó tiến hành rửa sạch bề mặt bằng nước xà phòng loãng và rửa lại bằng nước cất vô trùng. Tiếp theo, mẫu được khử trùng bằng dung dịch javel thương mại nồng độ 10% (v/v) trong thời gian 20 phút. Mẫu được rửa lại bằng nước khử ion vô trùng, loại bỏ phần mô chết trắng và cấy mẫu lên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) [10] đặc. Khảo sát sự tăng sinh chồi nách Các đoạn thân mang chồi nách 4 tuần tuổi (chồi cao khoảng 0,5 cm) được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA 1,0-2,5 mg/L và IBA 0,1-0,5 mg/L. pH môi trường được điều chỉnh về 5,8 trước khi hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1atm trong thời gian 30 phút. Các mẫu được nuôi trong điều kiện chiếu sáng 10 h/ngày ở nhiệt độ 22 ± 2oC. Khảo sát phát triển cây Mẫu cấy dùng cho thí nghiệm là những chồi in vitro có chiều cao khoảng 1,5 cm, được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung IBA nồng độ 0,1-0,35 mg/L, pH 5,8; điều kiện khử trùng môi trường và điều kiện nuôi như trên. Khảo sát sự tạo rễ bất định Nghiên cứu này nhằm mục đích tạo nguồn nguyên liệu rễ bất định dùng nuôi cấy so sánh với rễ tơ. Đoạn thân (dài khoảng 1,5 cm) và lá cây in vitro (có cuống) được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA (0,1-1,5 mg/L) và IBA (0,1-1,5 mg/L). pH 5,8; điều kiện khử trùng môi trường và điều kiện nuôi như trên. Khảo sát khả năng tạo rễ tơ Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 và ATCC 11325 bảo quản ở -80oC được hoạt hoá bởi quá trình nuôi trải trên môi trường LB (đặc) trong 2 ngày ở 25oC và điều kiện tối. Vi khuẩn, qua cấy chuyển vào môi trường lỏng LB và nuôi lắc 280 vòng/phút ở 25oC trong 24 giờ, được dùng để xử lý chuyển gen tạo rễ tơ. Mẫu lá (có cuống) của cây in vitro được gây nhiễm (infection) trong 15 phút với từng chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nói trên (hai lô thí nghiệm khác nhau). Thấm khô nhẹ dịch vi khuẩn thừa ở mẫu lá và nuôi chung (co- cultivation) mô với vi khuẩn trong 3 ngày. Sau nuôi chung, tiến hành rửa loại bỏ vi khuẩn bằng kháng sinh cefotaxime (500 g/ml). Mẫu sau khi rửa được nuôi trên môi trường MS đặc có bổ sung cefotaxime (nồng độ như trên). Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 2-4 tuần nuôi ở 25oC và điều kiện tối, ghi nhận hình thái mẫu rễ tơ và tách dòng nuôi cấy rễ tơ trong môi trường MS lỏng không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng sau khi rễ phát triển đạt chiều dài khoảng 1 cm. Xử lý thống kê Các thí nghiệm được thiết kế theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, số liệu được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV theo phương pháp Duncan multiple Range Test (Duncan, 1995) ở mức ý nghĩa 5%. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát sự tăng sinh chồi nách Cytokinin là nhóm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, có một trong các hoạt tính sinh lý là kích thích sự phát triển chồi nách. Đặc biệt, khi tương tác với auxin ở nồng độ thích hợp, cytokinin sẽ thúc đẩy phân chia tế bào ở mô phân sinh đỉnh, nâng cao tỷ lệ tạo chồi, tạo số lượng chồi hình thành nhiều hơn so với không bổ sung hai nhóm chất này. Khi không bổ sung/bổ sung ít cytokinin, chồi tăng trưởng chủ yếu theo chiều cao, không được kích thích tạo nhiều chồi bên. Không phải nồng độ cytokinin và auxin cao quyết định sự tạo chồi mà chính tỷ lệ thích hợp giữa cytokinin và auxin đã làm tăng khả năng tạo chồi (hình 1; bảng 1). Nồng độ BA 1,5 mg/L kết hợp IBA 0,1 mg/L là tổ hợp tạo chồi tốt nhất trong các nghiệm thức (4,76 chồi/mẫu) và kết quả nhận được ở nghiên cứu này của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Verma et al. (2002) [18], qua nghiên cứu khả năng tạo chồi trực tiếp từ chồi bên cây bạch hoa xà với số chồi trung bình là 3,5 trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L BA và 0,1 mg/L IBA. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169 163 A. Nghiệm thức đối chứng sau 4 tuần nuôi cấy B. MS+ 1,5 mg/L BA + 0,1mg/L IBA sau 4 tuần nuôi cấy C. MS +1,0 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA D. MS + 1,5 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA E. MS + 2,0 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA F. MS + 2,5 mg/L BA+ (0,1-0,5) mg/L IBA Hình 1. Tạo chồi bạch hoa xà từ chồi bên trên các môi trường khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy A. Đối chứng; B. Môi trường MS+ 1,5 mg/L BA + 0,1 mg/L IBA; C. Môi trường MS +1,0 mg/L BA + (0,1- 0,5) mg/L IBA; D. Môi trường MS + 1,5 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA; E. Môi trường MS + 2,0 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA; F. Môi trường MS + 2,5 mg/L BA+ (0,1-0,5) mg/L IBA. Các chữ cái a, b, c, d,... trên hình 1 tương ứng môi trường A1, A2, A3,... ở bảng 1. a b c d e f g h i j k l m n o r q p t s Bui Dinh Thach et al. 164 Bảng 1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng BA và IBA đến khả năng tạo chồi từ chồi bên in vitro của cây bạch hoa xà Môi trường Ký hiệu BA (mg/L) IBA (mg/L) Tỷ lệ tạo chồi (%) Số chồi trung bình/mẫu Chiều cao trung bình của chồi (cm) O 0 0 100 1,00 5,33 a A1 a 1,0 0,1 88,89 4,45 1,56 b A2 b 1,0 0,2 77,78 4,00 1,47 bc A3 c 1,0 0,3 83,33 2,67 1,59 b A4 d 1,0 0,4 77,78 3,56 1,31 bcd A5 e 1,0 0,5 55,56 3,78 1,12 bcde B1 f 1,5 0,1 100 4,67 1,40 bcd B2 g 1,5 0,2 88,89 4,33 1,45 bcd B3 h 1,5 0,3 88,89 1,89 0,69 de B4 i 1,5 0,4 100 2,44 0,73 cde B5 j 1,5 0,5 77,78 3,78 0,88 bcde C1 k 2,0 0,1 100 2,44 1,33 bcd C2 l 2,0 0,2 88,89 1,89 1,07 bcde C3 m 2,0 0,3 77,78 1,33 0,84 bcde C4 n 2,0 0,4 100 2,78 1,11 bcde C5 o 2,0 0,5 77,78 3,56 1,27 bcde D1 p 2,5 0,1 88,89 1,44 1,05 bcde D2 q 2,5 0,2 88,89 1,22 0,69 de D3 r 2,5 0,3 88,89 2,44 1,28 bcde D4 s 2,5 0,4 66,67 1,78 0,52 e D5 t 2,5 0,5 66,67 2,11 0,71 cde Các chữ cái khác nhau (a, b, c, ...) chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức thống kê, α = 0,05. Khảo sát sự phát triển cây Các chồi phát triển tốt được cắt ngang và cấy thẳng đứng trên môi trường MS có bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau (bảng 2) để đánh giá khả năng tạo rễ. Kết quả cho thấy, ở tất cả các chồi rễ đều phát triển trên môi trường MS có bổ sung IBA sau 2 tuần nuôi cấy. Môi trường E1 (0,1 mg/L IBA) là môi trường thích hợp cho sự phát triển cây với số rễ trung bình 11,33; chiều dài rễ trung bình 2,27 và số lá trung bình 6,67 (bảng 2). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Verma et al. (2002), Wei et al. (2006) [18, 20] qua nghiên cứu khả năng tạo rễ từ chồi cây Bạch hoa xà trên môi trường MS bổ sung 0,1 mg/L IBA - tốt nhất cho sự tạo rễ và tăng trưởng cây. Hình 2. Ảnh hưởng IBA lên sự phát triển cây sau 2 tuần nuôi cấy Các chữ cái a, b, c,... trên hình 2 tương ứng với các môi trường E0, E1, E3 ở bảng 2. a b c d f e g TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169 165 Bảng 2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA lên sự phát triển cây bạch hoa xà từ chồi in vitro sau 2 tuần nuôi cấy Môi trường Ký hiệu Nồng độ IBA(mg/L) Tỷ lệ tạo rễ (%) Số rễ trung bình/mẫu Chiều dài rễ (cm) Số lá trung bình/mẫu E0 a 0,00 100 4,33 d 2,93 a 4,00 E1 b 0,10 100 11,33 ab 2,27 a 6,67 E2 c 0,15 100 13,00 a(*) 1,30 b 6,33 E3 d 0,20 100 9,00 bc 1,13 b 5,33 E4 e 0,25 100 10,33 ab 1,07 b 5,00 E5 f 0,30 100 12,67 a 0,97 b 5,67 E6 g 0,35 100 5,67 cd 0,67 b 4,67 Các chữ cái khác nhau (a, b, c,...) chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05. Khảo sát sự tạo rễ bất định Kết quả nghiên cứu cảm ứng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân trên môi trường MS có bổ sung nồng độ khác nhau của các chất điều hòa sinh trưởng IBA và NAA được trình bày ở bảng 3. Bảng 3. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng IBA và NAA đến khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy Hàm lượng (mg/L) Trọng lượng rễ TB/nghiệm thức (g TLT) IBA NAA Lá Đoạn thân 0 0,0 1,210 j 0,4300i 0 0,1 2,610b 0,6800 h 0 0,5 2,500bc 0,8200 gh 0 1,0 1,810gh 1,130f 0 1,5 1,700hi 1,220ef 0,1 0,0 1,600i 1,25 ef 0,1 0,1 2,000ef 1,780a(*) 0,1 0,5 2,110de 1,550bc 0,1 1,0 2,190d 0,8500g 0,1 1,5 2,400c 1,670ab 0,5 0,0 1,720hi 1,450cd 0,5 0,1 3,020a(*) 1,230ef 0,5 0,5 1,710hi 0,7700gh 0,5 1,0 1,830gh 1,120f 0,5 1,5 1,830gh 1,250ef 1,0 0,0 1,830gh 0,8800g 1,0 0,1 2,120de 0,7700gh 1,0 0,5 2,200d 1,500c 1,0 1,0 2,400c 1,170ef 1,0 1,5 2,580b 0,8500g 1,5 0,0 1,870fg 0,7700gh 1,5 0,1 2,380c 1,300de 1,5 0,5 1,750gh 1,220ef 1,5 1,0 1,310j 1,120f 1,5 1,5 1,240j 1,180ef Các chữ cái khác nhau (a, b, c,...) chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05. Bui Dinh Thach et al. 166 Hình 3. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân Kết quả nghiên cứu cho thấy, tất cả các công thức đều kích thích tạo rễ bất định sau 4 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, tổ hợp nồng độ IBA 0,5 mg/L và NAA 0,1 mg/L có tác động tối ưu đến sự hình thành rễ bất định ở lá với trọng lượng tươi rễ trung bình đạt 3,02 g; IBA 0,1 mg/L phối hợp NAA 0,1 mg/L có tác động tối ưu cho sự tạo rễ từ đoạn thân với trọng lượng tươi rễ trung bình đạt 1,78 g (bảng 3 và hình 8). Như vậy, kết quả nhận được cho thấy sự hình thành rễ được kích thích mạnh khi có sự kết hợp của IBA và NAA trong môi trường nuôi cấy; kết quả này khá phù hợp với kết quả nghiên cứu của Sivanesan & Jeong (2009) [16] khi cho rằng rễ được tạo ra tốt nhất trong môi trường có bổ sung 1,0 mg/L IBA và 0,5 mg/L NAA. Lá là bộ phận cho kết quả tạo rễ bất định tốt hơn so với đoạn thân. Khảo sát tạo rễ tơ Hai tuần sau nuôi chung, chúng tôi nhận thấy có sự hình thành rễ tơ ở một số mẫu lá (hình 4). Tuy chưa thực hiện phản ứng PCR các gen rol để khẳng định là rễ chuyển gen nhưng dựa vào tần số tạo rễ cao (công bố ở bài báo khác), dựa vào quan sát hình thái rễ qua kính hiển vi (rễ có rất nhiều lông hút) và sự tăng sinh rất nhanh với tính ổn định cao của chúng trong môi trường MS lỏng không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng so với mẫu rễ đối chứng, chúng tôi cơ bản cho rằng 5 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169 167 dòng rễ tạo được là các dòng rễ tơ (2 dòng qua dùng chủng vi khuẩn ATCC 11325 và 3 dòng qua dùng chủng vi khuẩn ATCC 15834) (hình 5, 6, 7). Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Verma et al. (2002) [18] khi kết luận sinh khối tươi của rễ tơ/rễ chuyển gen cao gấp 2,5 lần so với rễ đối chứng. Hình 4. Sự hình thành rễ tơ từ mảnh lá a. Rễ tơ từ mảnh lá ở giai đoạn 14 ngày sau nuôi chung với Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 (vị trí mũi tên), b. Đối chứng (ĐC). Hình 5. Rễ tơ từ mảnh lá chụp dưới kính hiển vi (vị trí mũi tên) qua nuôi chung với Agrobacterium rhizogenes ATCC 11325 Hình 6. Đoạn rễ tơ (chụp qua kính hiển vi, do Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834) nuôi trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Hình 7. Rễ tơ (do Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834) nuôi trong môi trường MS lỏng lắc không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng sau 30 ngày KẾT LUẬN Trên đối tượng cây dược liệu bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.), qua thực hiện một số nghiên cứu về nuôi cấy mô in vitro bao gồm nuôi cấy đoạn thân mang chồi ngủ, nuôi cấy tăng sinh chồi, tăng trưởng cây và nuôi cấy tạo rễ bất định dùng môi trường khoáng cơ bản MS có bổ sung một số loại chất điều hòa sinh trưởng (BA, IBA, NAA) thích hợp với nồng độ thích hợp ở từng giai đoạn nuôi cấy khác nhau; nghiên cứu đã xây dựng được nguồn nguyên liệu cây in vitro có sinh trưởng tốt dùng cho nghiên cứu tạo rễ tơ nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ở giai đoạn tiếp theo. Đã tạo được 5 dòng rễ tơ qua xử lý gây nhiễm và nuôi chung mẫu lá với 2 chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 11325 và ATCC 15834. Các dòng rễ tơ này mang nhiều lông hút, có khả năng tăng sinh khối nhanh và ổn định khi được nuôi lắc (ở điều kiện tối) trong môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Lời cảm ơn: Các tác giả chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về công a b Bui Dinh Thach et al. 168 nghệ tế bào thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị để thực hiện nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abebe D., Ayehu A., 1993. Medicinal plants and enigmatic health practices of northern Ethiopia. BSPE, Addis Ababa. 2. Aditi G., Anjali G., Singh J., 1999. New naphtoquinones from Plumbago zeylanica. Pharm. Biol., 37: 321-323. 3. Bhargava S. K., 1994. Effects of plumbagin on reproductive function of male dog. Indian J. Exp. Biol., 22: 153-156. 4. Didery N., Dubrevil L., Pinkas M., 1994. Activity of anthraquinonic and naphtoquinonic compounds on oral bacteria. Die Pharm., 49: 681-683. 5. Duraga R., Sridhar P., Polasa H., 1990. Effect of plumbagin on antibiotic resistance in bacteria. Indian J. Med. Res., 91: 18-20. 6. Idayat T., Gbadamosi, Egunyomi A., 2010. Micropropagation of Plumbago zeylanica L. (Plumbaginaceae) in Ibadan, Southwestern, Nigeria. J. Med. Plant Res., 4(4): 293-297. 7. Kitanow G. M., Pashankov P. P., 1994. Quantitative investigation on the dynamics of plumbagin in Plumbago europea L. roots and herb by HPLC. Pharmazie, 49: 462. 8. Kubo I., Uchida M., Klocke J. K., 1983. An insect ecolysis inhibitor from the African medicinal plant, Plumbago capsensis (Plumbaginaceae). Agric. Biol. Chem., 47: 911-913. 9. Mohana K., Purushothoman K. K., 1980. Plumbagin: a study of its anticancer, antimicrobial and antifungal properties. Indian J. Exp. Biol., 18: 876-888. 10. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: 473-479. 11. Parimala R., Sachdanandam P., 1983. Effect of plumbagin on some glucose metabolizing. J. Ethnopharmacol., 37: 85-91. 12. Ram A., 1996. Effect of Plumbago Zeylanica in hyperlipidaemic rabbits and its modification by vitamin E. Indian J. Pharmacol., 28:161-166. 13. Rang D. D., Dung N. X., 1996. Chemical constituents of Plumbago zeylanica. J. of Chemicals (Vietnam), 34: 67-70. 14. Satheeshkumar K., Jose B., Soniya E. V. and Seeni S., 2009. Isolation of morphovariants through plant regeneration in Agrobacterium rhizogenes induced hairy root cultures of Plumbago rosea L. Indian J. Biotechnol., 8: 435-441. 15. Sivanesan I., Jeong B. R., 2009. Induction and establishment of adventitious and hairy root cultures of Plumbago zeylanica L. Afr. J. Biotechnol., 8(20): 5294-5300. 16. Sivanesan I., Jeong B. R., 2009. Micropropagation of Plumbago zeylanica L.. Afr J. Biotechnol., 8(16): 3761-3768. 17. Sivanesan, 2007. Shoot regeneration and somaclonal variation from leaf callus cultures of Plumbago zeylanica Linn. Asian J. Plant Sci., 6(1): 83-86. 18. Verma P. C., Singh D., Rahman L. U., Gupta M. M. and Banerjee S., 2002. In vitro-studies in Plumbago zeylanica: rapid micropropagation and establishment of higher plumbagin yielding hairy root cultures. J. Plant Physiol., 159: 547-552. 19. Vijver L. M, Looter A. P., 1971. The constituents of the roots of Plumbago auriculata and P. zeylanica responsible for antimicrobial activity. Plant Med., 20: 8-13. 20. Wei X., Gou X., Yuan T. and Russell S. D., 2006. A highly efficient in vitro plant regeneration system and Agrobacterium- mediated transformation in Plumbago zeylanica. Plant Cell Rep., 25: 513-521. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169 169 CREATION OF IN VITRO MATERIALS AND INITIAL STUDY OF CREATING HAIRY ROOT FROM Plumbago zeylanica L. Bui Dinh Thach, Nguyen Minh Hieu, Pham Thi Phuong Uyen, Ngo Ke Suong, Nguyen Huu Ho Institute of Tropical Biology, VAST SUMMARY Plumbago zeylanica L. is a medicinal plant that contains high levels of the active ingredient plumbgin. With the goal of creating raw materials in vitro, 20-minute disinfection time, 10% solution is the optimum level to create templates in vitro (41.29%), MS medium supplemented with 1.5 mg/L BA and 0.1 mg L IBA create optimal shoots (4.67 shoots/sample) after 4 weeks of culture. In vitro shoots developed into the best tree in each MS supplemented with 0.1 mg / L IBA. Two strains of Agrobacterium rhizogen ATCC-15834 and ATCC-11325 used for transgenic stimulation ofhairy roots from in vitro leaves. The initial results have been selected for hairy root 5 lines. Keywords: Agrobacterium rhizogen, Plumbago zeylanica, hairy root, in vitro. Ngày nhận bài: 21-6-2012