Tài liệu sinh học phân tử

TÀI LIỆU SINH HỌC PHÂN TỬ Chương 1. Các đại phân tử sinh học Chương 2. Cấu trúc genome Chương 3. Cấu trúc và chức năng của gen Chương 4. Tái bản DNA Chương 5. Phiên mã

doc35 trang | Chia sẻ: aloso | Lượt xem: 2664 | Lượt tải: 7download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Tài liệu sinh học phân tử, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
óa một chuỗi polypeptide, bất kỳ đột biến nào xảy ra trong nội bộ gen sẽ tạo thành dạng mới hoặc alen mới của gen rồi có thể tạo ra protein mới. Những gen chứa những đột biến nhỏ muốn phát hiện phải dùng kỹ thuật đặc biệt gọi là (isoallele). Đột biến có thể trội hoặc lặn, ở cơ thể đơn bội như virus, vi khuẩn thì cả 2 dạng trội và lặn đều được biểu hiện ra kiểu hình, còn ở cơ thể nhị bội đột biến trội hoặc lặn chỉ được phát hiện ra qua phân tích quần thể đời sau hoặc chuyển được chúng về trạng thái đồng hợp tử, hầu hết đột biến lặn ở nhị bội không thể biểu hiện trừ một số đột biến nằm trên nhiễm sắc thể giới tính. Dạng đột biến dễ phân tích nhất là đột biến gây chết có điều kiện, chúng chết trong môi trường này nhưng tồn tại trong môi trường khác. Có 3 dạng đột biến này là: + Đột biến dinh dưỡng thụ động là đột biến xảy ra ở vi sinh vật làm cho nó chỉ sống được trong môi trường tối thiểu. + Đột biến mẫn cảm nhiệt độ là đột biến chỉ biểu hiện trong một phạm vi nhiệt độ nhất định, có sản phẩm gen nhưng không bền ở ngoài ngưỡng nhiệt độ trên. Cũng có thể đột biến ở điều kiện nhiệt độ này thì bình thường nhưng ở điều kiện khác thì biểu hiện đột biến. + Đột biến mẫn cảm ức chế là đột biến bù lại cho những đột biến khác dẫn đến trở thành bình thường hoặc gần bình thường khi cùng có thêm 1 đột biến nữa. Hầu hết các đột biến biểu hiện hiệu quả kiểu hình là do kết quả của hoạt tính sản phẩm gen bị giảm đi hoặc do không có hoạt tính sản phẩm của gen. Điều này do hiệu quả chọn lọc lâu đời tính thích ứng tối ưu của dạng dại (allele dại). Đột biến có thể xảy ra ở bất kỳ tế bào hoặc trạng thái nào trong chu kỳ tế bào, nếu xảy ra ở tế bào soma, tế bào này không sinh giao tử thì chỉ có ở mô đó, và có thể được truyền qua sinh sản vô tính như ví dụ đối với giống táo Delicious và giống cam navel. Nếu đột biến trội xảy ra trong tế bào phôi thì hiệu quả của đột biến có thể được biểu hiện ngay ở con cháu, tuy nhiên nếu là đột biến lặn thì vẫn không biểu hiện ra. Đột biến hemoglobin. Hemoglobin là một đại phân tử có mặt trong hồng cầu có nhiệm vụ vận chuyển oxy từ phổi đến tất cả các mô khác nhau của cơ thể. Có 2 kiểu hemoglobin ở người là dạng F khi trong trạng thái trẻ sơ sinh (new born) và dạng A khi người đã trưởng thành. Hemoglobin A gồm 2 chuỗi a giống nhau và 2 chuỗi b, còn dạng F gồm 2 chuỗi b và 2 chuỗi g . Mỗi chuỗi được mã hóa bởi 1 gen đặc trưng. Chuỗi a chứa 141 axit amin, chuỗi b và g chứa 146 axit amin, các chuỗi này khá giống nhau về trình tự chuỗi axit amin, cho nên người ta cho rằng chúng đều xuất phát từ 1 gen chung. Có nhiều biến dạng hemoglobin được phát hiện chủ yếu là từ Hemoglobin A. Một trong chúng là đột biến tế bào hồng cầu lưỡi liềm là Hemoglobin S (alen S, Hbsb/HBsb) là một dạng biến đổi của chuỗi b. Phân tử này kết tủa khi bị thiếu oxy, hình thành lên thể ác tính làm biến đổi hình thái tế bào hồng cầu tạo thành hình lưỡi liềm (h×nh 1.5). H×nh 1.5. §ét biÕn hång cÇu thµnh h×nh l­ìi liÒm 2. Cơ sở phân tử của đột biến Watson và Crick đã mô tả chuỗi xoắn kép DNA, đề xuất cơ chế sao chép DNA bán bảo toàn trên cơ sở ghép cặp đặc thù bazơ để giải thích quá trình truyền đạt trung thành thông tin di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Hai ông còn đề xuất một cơ chế giải thích đột biến tự nhiên và cấu trúc bazơ nitơ không bất biến. Nguyên tử hydro có thể rời từ ví trí NH2 hoặc chuyển đến ví trí 0 của 1 purine hoặc pyrimidine để tạo thành bazơ hiếm, thí dụ nguyên tử H từ nhóm amin trở thành NH hoặc H đến kết hợp với O thành OH trong vòng nitơ, quá trình này gọi là (tautomeric –shift, sự trôi dạt nguyên tử H (h×nh 2.5). Thí dụ Thymine và Guanine dạng bình thường là dạng keto khi chuyển thành trạng thái hiếm enol, chúng có thể lần lượt được kết hợp với dạng keto của Guanine và Thymine bằng 3 liên kết hydro. Có 3 dạng đột biến điểm: Tương tự adenine và cytosine bình thường ở dạng amino khi trở thành dạng hiếm imino chúng có thể lần lượt kết hợp với dạng amino của cytosine và adenine bằng 2 liên kết hydro (h×nh 3.5). Điều này trái với bình thường là T=A, GºC. Các trạng thái tautomeric thường tồn tại một thời gian ngắn, tuy nhiên nếu xuất hiện vào lúc tái bản, thì quá trình nhận nhầm và đột biến dễ xảy ra. Kết quả có thể tạo ra sự thay thế một bazơ purine hoặc pyrimidine dạng này bằng bazơ purine hoặc pyrimidine khác (đây gọi là quá trình transition, quá trình chuyển tiếp hay quá trình quá độ (hoán vị). Hình 2.5. Trạng thái tautomeric chuyển từ trạng thái bình thường keto, amino thành dạng hiếm enol và imino của 4 bazơ nitơ Quá trình thay thế cặp bazơ liên quan đến việc thay thế 1 purine bằng 1 pyrimidine và ngược lại gọi là quá trình transversion (sự chuyển qua). Thêm hoặc bớt một vài cặp bazơ gọi là đột biến thay đổi khung đọc mã (frame shift mutation) (h×nh 4.5). Hình 3.5. Hiện tượng ghép cặp đôi nhầm của các bazơ hiếm có thể sẽ dẫn đến ghép bất bình thường A = C và G º T. Hình 4.5. Sơ đồ do đột biến thêm 1 cặp bazơ làm thay đổi khung đọc mã và tạo ra chuỗi protein bị biến đổi - Cã thÓ tãm t¾t mét sè kh¶ n¨ng biÕn ®æi lµm thay thÕ c¸c nu trong ph©n tö DNA t¸i b¶n tr×nh bÇy ë h×nh 5.5. Hình 5.5. Sơ đồ các khả năng biến đổi bazơ xẩy ra, mũi tên đường liền là giữa bazơ Pu –Pu và giữa Py-Py, đường đứt giữa Pu - Py và ngược lại 3. HËu qu¶ cña ®ét biÕn DNA - HËu qu¶ cña ®ét biÕn tuú thuéc vµo n¬i xÈy ra ®ét biÕn vµ kiÓu ®ét biÕn xÈy ra. - §ét biÕn ®iÓm xÈy ra ë ®o¹n DNA phiªn m· sÏ: + Lµm biÕn ®æi thµnh codon kh¸c nh­ng m· ho¸ cïng mét acid amin so víi tr­íc gäi lµ ®ét biÕn c©m (Synonymous or silent mutation). + BiÕn ®æi thµnh codon kh¸c råi m· ho¸ mét acid amin kh¸c (missense mutation) + BiÕn ®æi codon tõ m· ho¸ cho mét acid amin thµnh mét codon dõng dÞch m· sÏ t¹o ra protein ng¾n l¹i (nonsense mutation). - §ét biÕn xÈy ra ë ®o¹n kh«ng phiªn m· gåm c¸c vïng mµ enzyme RNA polymerase vµ nh÷ng protein kh¸c bäc lÊy míi cho phÐp qu¸ tr×nh phiªn m· tiÕn hµnh sÏ ¶nh h­ëng ®Õn c­êng ®é phiªn m·, l­îng mRNA vµ protein sinh ra. D­íi gãc ®é RNA th× c¸c vïng bÞ ¶nh h­ëng bao gåm: + vÞ trÝ bäc ribosome cña mRNA vi khuÈn. + vÞ trÝ c¾t 5’ vµ 3’ ®Ó kÕt nèi c¸c exon cña mRNA sinh vËt nh©n chuÈn. + nh÷ng vÞ trÝ ®iÒu hoµ qu¸ tr×nh dÞch m· vµ ®Þnh vÞ mRNA trong tÕ bµo. C¸c d¹ng ®ét biÕn nµy rÊt khã ph¸t hiÖn so víi nh÷ng ®ét biÕn xÈy ra ë vïng m· ho¸ vµ ¶nh h­ëng kh«ng nhiÒu ®Õn biÓu hiÖn kiÓu h×nh sinh vËt. 4. Ung th­ lµ hËu qu¶ cña ®ét biÕn U ¸c tÝnh hay u ung th­ lµ tËp hîp c¸c tÕ bµo ®­îc sinh ra tõ mét tÕ bµo gèc bÊt b×nh th­êng. TÕ bµo ung th­ kh¸c víi tÕ bµo b×nh th­êng bëi nhiÒu ®Æc tÝnh nh­: tèc ®é ph©n chia nhanh h¬n, x©m lÊn l·nh ®Þa cña nh÷ng tÕ bµo míi kh¸c, cã tèc ®é trao ®æi chÊt cao h¬n vµ cã h×nh d¹ng bÊt th­êng. Nguyªn nh©n lµ do mét sè yÕu tè ®iÒu khiÓn sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo b×nh th­êng trong tÕ bµo ung th­ bÞ biÕn ®æi. RÊt nhiÒu lo¹i tÕ bµo cã kh¶ n¨ng trë thµnh tÕ bµo ung th­. Mét sè ®­îc truyÒn tõ cha mÑ qua dßng tÕ bµo ph«i, nh­ng hÇu hÕt lµ do ®ét biÕn tÕ bµo soma g©y lªn. Cã nhiÒu t¸c nh©n g©y ra tÕ bµo ung th­ vµ cã 2 lo¹i ®ét biÕn g©y ung th­ lµ ®ét biÕn nh÷ng gen trùc tiÕp sinh ra ung th­ vµ ®ét biÕn nh÷ng gen øc chÕ ®Æc tÝnh g©y ung th­. Lo¹i ®Çu cã 2 ®Æc ®iÓm lµ th­êng gen ®ét biÕn ung th­ sinh ra protein ung th­ trong tÕ bµo khèi u vµ chØ cÇn mét alen ®ét biÕn còng g©y lªn khèi u. Cßn ®ét biÕn gen mÊt chøc n¨ng øc chÕ ung th­ lµ ®ét biÕn lÆn, t¹o ra protein lµm mÊt mét phÇn hoÆc mÊt hÕt kh¶ n¨ng øc chÕ ung th­. §ång thêi ®Ó ph¸t triÓn thµnh ung th­ th× cÇn ph¶i cã c¶ 2 alen cña locus gen cïng bÞ ®ét biÕn Lo¹i ®ét biÕn tiÒn ung th­ (proto-oncogene) chia ra lµm 2 lo¹i: lo¹i 1 chØ g©y ung th­ nÕu s¶n phÈm protein cña nã ®­îc ho¹t ho¸ khi cã mÆt cña mét tÝn hiÖu ®iÒu hoµ phï hîp nh­ chÊt nhËn yÕu tè sinh tr­ëng, protein truyÒn tÝn hiÖu vµ chÊt ®iÒu hoµ phiªn m·. Lo¹i 2 s¶n phÈm gen ®ét biÕn ho¹t ®éng øc chÕ kh¶ n¨ng ph¸ huû nh÷ng tÕ bµo bÞ sai hong, kÕt qu¶ lµ g©y tÕ bµo ung th­. B×nh th­êng cã mét sè gen cã chøc n¨ng ®iÒu khiÓn chu kú ph©n chia tÕ bµo b×nh th­êng, nh÷ng gen nµy bÞ ®ét biÕn dÉn ®Õn tÕ bµo ph©n chia bÊt th­êng vµ g©y ra ung th­. 5. Tác nhân lí hóa gây đột biến a. Tác nhân vật lý Tia phóng xạ, tia X quang, tia g, tia vũ trụ, tia cực tím, phóng xạ ion như X quang, có bước sóng 0.1-1nm, có năng lượng cao dùng trong chẩn đoán y học vì chúng có khả năng xuyên qua mô. Trong quá trình xuyên, chúng va đập vào các nguyên tử, giải phóng ra electron tạo ra các ion tích điện dương, những ion này đập vào phân tử khác lại giải phóng ra electron (điện tử). Tia cực tím (UV) có năng lượng thấp được hấp thụ bởi các bazơ purine và pyrimidine biến nó thành dạng hoạt hóa và kích động. Vì năng lượng của tia này thấp nên khả năng đâm xuyên vào mô chậm chạp thường chỉ xuyên được vào lớp bề mặt tế bào của sinh vật đa bào, nên nó thướng có tác dụng gây đột biến đối với sinh vật đơn bào. DNA hấp phụ tối đa tia UV ở bước sóng 254 nm và tại bước sóng này gây tần số đột biến cao. Cơ chế hấp phụ UV và gây tạo chất dễ hoạt hóa (h×nh 6.5), khi cytosine + UV + H2O sẽ tạo thành cytosine hydrat, khi có 2 thymine nằm gần cạnh nhau + UV sẽ tạo thành thymine C5= C5 Thymine (thymine dimer), dạng này gây lên quá trình ghép nhầm hoặc làm chấm dứt quá trình tái bản. Hình 6.5. Tác động của tia UV làm biến đổi bazơ pyrimidine thành dạng hiếm b. Tác nhân hóa học chia làm 5 nhóm Hơi độc hoặc hơi sulfur (mustard gas hoặc sulfur mustard) (b¶ng 1.5), có tác dụng alkyl hoá bazơ. Bảng 1.5. Hơi độc có tác dụng gây biến đổi các bazơ cua DNA Bazơ tương đồng như: 5 BU (5 Bromouracil) và 2AP (2 aminopurine), tác dụng làm tăng tần số ghép cặp nhầm, 5 BU là bazơ tương đồng với thymine, còn Br ở vị trí C5 tương tự như nhóm –CH3 ở C5 trong thymine. Sự có mặt Br làm thay đổi phân bố điện tích, làm tăng khả năng chuyển vị nguyên tử hydro. Ở trạng thái keto bền, 5 BU ghép cặp với Adenine, sau khi có chuyển vị hydro thành dạng enol thì 5BU lại ghép cặp với Guanine (Hình 3.5). Hiệu quả gây đột biến của 5BU tương tự như quá trình tautomeric shift (h×nh 7.5). Hình 7.5. Cơ chế tạo đột biến điểm do hiện tượng trôi dạt tautomeric tạo bazơ hiếm gây quá trình ghép cặp đôi nhầm. Nếu 5BU tồn tại ở trạng thái hiếm enol như một Nu 3 phosphate tại thời điểm nó gắn nhập vào mạch DNA, nó sẽ gắn vào guanine mạch gốc và gây ra hiện tượng transition (hoán vị) từ GCà AT (h×nh 8.5). Nếu 5BU kết gắn với Adenine dạng keto, sau khi tautomeric shift sẽ biến thành dạng enol, quá trình sao chép sau đó sẽ tạo ra hoán vị từ A-T thành GC (hình 11.26b). Do vậy 5BU gây ra quá trình hoán vị theo 2 hướng AT« GC, nên có thể tạo ra cả 2 hướng đột biến trên. Hình 8.5. Sơ đồ tác động của dạng enol 5BU kèm theo quá trình tái bản DNA gây nên đột biến HNO2 tác động vào DNA trong cả lúc tái bản và không tái bản, bằng cách oxy hóa khử gốc amin của các bazơ, A, G, và C (h×nh 9.5). Thí dụ làm adenine biến thành hypoxanthine, chất này sẽ ghép cặp với cytosine hơn là với thymine, còn cytosin đảo thành uracine sẽ ghép cặp với adenine thay vì bình thường ghép với guanine. Quá trình khử amin của Guanine sẽ biến thành xanthine, chất này ghép cặp với cytosine giống như Guanine. Do vậy khử amin của Guanine không tạo được đột biến giống như đối với adenine và cytosine. HNO2 gây đột biến hoán vị theo 2 hướng AT«GC. Thuốc nhuộm acridine là proflavin và hàng loạt các hợp chất có tên gọi là ICR-170, ICR-191 là những chất có tác dụng gây đột biến rất mạnh, có thể tạo ra các đột biến thêm mất cặp bazơ. ICR có chứa phần acridine gồm những chuỗi có kích thước khác nhau, các chất này thường là tác nhân alkyl hóa. Acridine tích điện dương tự xen vào giữa cặp bazơ xếp chồng nhau (h×nh 10.5), làm tăng độ cứng chắc và thay đổi tính ổn định của chuỗi xoắn kép, tạo ra những thắt nút nhẹ trong phân tử DNA. Khi phân tử DNA có chứa acridine xen vào mà tái bản sẽ xẩy ra tăng thêm hoặc mất đi cặp bazơ kết quả sẽ tạo ra đột biến. Hình 9.5. Cơ chế gây đột biến do tác động của HNO2: a) biến đổi adenine thành hypoxanthine làm cặp AT biến thành GC; b) biến đổi cytosine thành uracine làm cặp GC biến thành AT; biến đổi guanine thành xanthine dẫn đến là AT biến thành GC và ngược lại. Hình 10.5. Quá trình chèn xen của acridine proflavin vào chuỗi xoắn kép DNA tại đó cặp bazơ có thể được tăng thêm hoặc mất đi dẫn đến đột biến. Tác nhân alkyl hóa và hydroxyl hóa như: MMS, EMS (methyl và ethyl methane sulfonate, nitroguanidine (NTG), chúng có tác dụng gây đột biến mạnh bằng cách chuyển gốc methyl và ethyl vào bazơ làm quá trình ghép cặp bình thường bị đảo lộn dẫn đến đột biến thay thế bazơ của purine hoặc pyrimidine bằng bazơ khác cùng nhóm. Thí dụ: Ethyl hóa tại vị trí 7N vào 6-O do chất EMS tạo thành 7 ethyl guanine sẽ ghép cặp với thymine(h×nh 11.5 vµ 12.5). Hình 11.5. Giả thuyết gây đột biến do EMS (a) làm Guanine ghép nhầm với Thymine; (b)do NH2OH làm Adenine ghép nhầm với Cytosine Sản phẩm alkyl hóa các bazơ khác có tác dụng hoạt hóa quá trình sửa chữa giống như tạo thành 2 thymine. Những sai sót hiếm hoi này xảy ra trong quá trình sửa chữa sẽ tạo thành đột biến kiểu transverion và frameshift. Một số hợp chất có 2 nhóm alkyl hoạt hóa gây bắt chéo (cross-link) sợi đơn DNA hoặc phân tử ADN làm nhiễm sắc thể bị gẫy, tạo ra đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể. Alkyl hóa ít gây đột biến đặc thù như chất tương đồng và HNO2 hoặc acridine. Nó có thể tạo ra tất cả các kiểu đột biến với tần xuất rất khác nhau, phụ thuộc vào hóa chất và nồng độ. Nitrosoguanidine (NTG) gây lên hàng loạt các đột biến liên kết gần nhau trong 1 mẩu nhiễm sắc thể đang tái bản trong khi bị xử lý, nên ít được sử dụng trong nghiên cứu di truyền. Hydroxylamine NH2OH, ngược với nhóm alkyl có tác dụng gây đột biến đặc thù, tuy nhiên cơ chế chính xác vẫn chưa rõ, nó hydroxyl hóa nhóm amin của cytosine (h×nh 11.5 b) tạo thành hydroxylaminocytosine, chất này ghép cặp với adenine tạo thành đột biến hóan vị GCà AT. Những đột biến do HNO2 và bazơ tương đồng gây lên đột biến kiểu transition, có thể chia ra làm 2 loại: loại 1 là những thể có cặp AT ở tại nơi bị đột biến, sẽ không bị đột biến đảo ngược bởi hydroxylamine, loại thứ 2 có cặp GC tại điểm đột biến sẽ bị đảo ngược bởi hydroxylamine. Bởi vậy hydroxylamine được dùng để xác định tính đặc thù của đột biến xảy ra từ ATà GC hoặc GCà AT hoán vị. Hình 12.5. Cơ chế tác động gây đột biến của một số tác nhân alkyl hoá. a) Tác động của EMS (ethyl methanesulfonate) biến guanine thành 7-ethylguanine sẽ ghép cặp bất thường với thymine; b) Tác động của NH2OH (hydroxylamine) biến cytosine thành hydroxylaminocytosine sẽ ghép nhầm với adenine. II. Các nguyên nhân gây biến đổi DNA ë vi sinh vËt Tái tổ hợp ở E.coli tạo biến đổi DNA Thông tin di truyền của vi khuẩn được tàng trữ trong 1 nhiễm sắc thể chính, trung bình dài khoảng 5 Mb, chứa vài nghìn gen và có thể có hoặc không cã thể di truyền ngoài nhiễm sắc gọi là episome hoặc plasmid. Plasmid biến động theo kích thước dài từ 1 – 200 kb, có tu 3 gen đến hàng trăm gen. Có tế bào vi khuẩn chứa đến 11 loại plasmid khác nhau. Episome là nhân tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể của vi khuẩn như thùc khuÈn thÓ lamda (phage lambda) hoặc yếu tố giới tính F. Episome có thể tái bản độc lập với nhiễm sắc thể ký chủ hoặc là mét đơn vị thành phần gắn vào nhiễm sắc thể ký chủ. Nhiễm sắc thể cña vi khuẩn khác với nhiễm sắc thể sinh vật nhân thật ở chỗ nó chỉ gồm các nucleoid. Nucleoid là vùng chứa DNA, thường chứa hơn 2 bản nhiễm sắc thể vi khuẩn giống hệt nhau. Tái tổ hợp DNA ở vi khuẩn xảy ra qua 3 quá trình: a. Biến nạp ở vi khuẩn (transformation) Là quá trình những gen, dưới dạng một đoạn DNA hòa tan, được chuyển từ dòng tế bào vi khuẩn này sang dòng tế bào vi khuẩn khác, các đoạn DNA này có thể từ tế bào sống hoặc đã chết. Các đoạn DNA này được hòa tan trong môi trường ngoài có thể thâm nhập vào tế bào chỉ khi tế bào vi khuẩn nhận có vùng tiếp nhận trên bề mặt màng (competent cell). Khi vào bên trong, các đoạn này thường thay thế bằng cách tái tổ hợp với vùng DNA ngắn tương đồng của tế bào chủ. Quá trình biến nạp được chia thành các bước (h×nh 13.5) nh­ sau: + Gắn sợi DNA kép nạp vào bề mặt vị trí tế bào tiếp nhận. + Hấp thụ DNA cho, lúc này DNA cho có khả năng chống lại DNase. + Biến đổi sợi DNA kép cho, thành sợi đơn DNA nhờ enzym phân rã exonuclease. + Gắn (cộng hóa trị) toàn bộ hoặc một phần sợi đơn DNA cho vào thay thế đoạn tương ứng trong nhiễm sắc thể nhận, tạo sợi DNA lai có 2 sợi đơn cơ bản có trình tự tương đồng nhau trừ trình tự gen a/a+, ở chỗ này gọi là DNA dị hợp kép (heteroduplex) là trạng thái trung gian quan trọng trong quá trình đột biến, tái tổ hợp và sửa chữa DNA, chúng phân ly trong quá trình tái bản. Phân ly và biểu hiện kiểu hình của những gen cho gắn vào hoặc những gen tái tổ hợp. Ở các thế hệ tế bào sau sẽ tạo ra một số biến đổi DNA hoặc thể biến nạp. Hình 13.5. Sơ đồ biểu diễn hai bước chính hấp thụ và kết gắn đoạn gen ngoại trong quá trình chuyển nạp gen ở vi khuẩn Pneumococus. a) Hấp thụ DNA trên bề mặt màng tại đây nhờ enzyme exonuclease liên kết màng hoặc DNA translocase kéo một sợi đơn DNA ngoại vào trong tế bào sử dụng năng lượng tạo ra nhờ quá trình phân rã sợi đơn DNA còn lại. Đoạn DNA ngoại mang chỉ thị di truyền a+; Nhiễm sắc thể tế bào chủ chỉ chứa một đoạn DNA mang chỉ thị alen a. b) Sợi đơn DNA ngoại gắn xen vào nhiễm sắc thể và đẩy một sợi đơn DNA của nhiễm sắc chủ ra ngoài. Sợi đơn ngoại ghép cặp bazơ bổ sung với hầu hết các bazơ của đoạn sợi đơn chủ tiếp nhận trừ vị trí a. Sự ghép lỗi xảy ra tại vị trí a+/a tại đây sợi đơn DNA ngoại mang alen a+ còn sợi đơn DNA của chủ mang alen a. Lúc này phân tử DNA được gọi là phân tử dị hợp kép, làm trung gian trong quá trình đột biến tái tổ hợp và sửa chữa DNA. Khi tái bản lần sau sẽ phân ly tạo nên thể vi khuẩn biến nạp. - b. Chuyển nạp (transduction) Là quá trình chuyển vật chất di truyền từ một vi khuẩn này sang một vi khuẩn khác thông qua phage vector. Trong trường hợp chuyển nạp có giới hạn hay chuyên tính thì chỉ có một số gen của vi khuẩn là được chuyển nạp vì phage có một vị trí đặc hiệu có khả năng xâm nhập được vào nhiễm sắc thể của ttes bào ký chủ và chỉ những gen của vi khuẩn nằm ở gần vùng đó sẽ được chuyển nạp. Bacteriophage lambda là vector chuyển nạp chuyên tính mang gen gal và bio của vi khuẩn. Do vậy vector loại này luôn chứa 2 phần (một phần của thùc khuÈn thÓ và một phần là của vi khuẩn ký chủ E.coli). • Chuyển nạp rộng (generalized transduction) Trường hợp chuyển nạp rộng thì thùc khuÈn thÓ có thể gắn vào hầu hết và bất cứ nơi nào trên nhiễm sắc thể ký chủ, do đó mà hầu hết các gen của tế bào ký chủ đều có thể được chuyển nạp cùng với virus sang tế bào vi khuẩn khác. Các thùc khuÈn thÓ chuyển nạp thường thiếu một hoặc một số chức năng của phage bình thường nên có thể không tái bản được trong tế bào ký chủ mới trừ khi có sự trợ giúp của mét thùc khuÈn thÓ trî gióp (phage helper) bình thường khác. Trường hợp chuyển nạp rộng, th× thùc khuÈn thÓ được chia thành 2 loại dựa trên cơ sở phản ứng của chúng với tế bào vi khuẩn. Thùc khuÈn thÓ gây độc (virulent phage) thường xuyên nhân lên và phân rã tế bào sau lây nhiễm. Thùc khuÈn thÓ ôn hòa (temperate phage) tồn tại giữa 2 trạng thái sống sau lây nhiễm (hình 14.5). Hình 14.5. Hai hướng gây nhiễm của thực khuẩn thể ôn hoà E.coli phage l. Quá trình gây nhiễm của thực khuẩn thể vào tế bào vi khuẩn có thể xẩy ra như sau: - Cách thứ nhất ph©n r· (lytic pathway): Sau khi chui được vào tế bào vi khuẩn chúng tiến hành sinh sản và phân rã tế bào ký chủ giống như trường hơp cña thùc khuÈn thÓ gây độc. - Cách thứ 2 g¾n xen (lysogenic pathway): Sau khi xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, nhiễm sắc thể của thùc khuÈn thÓ kết gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn ký chủ và tái bản giống như bất kỳ những đoạn DNA nào khác của nhiễm sắc thể ký chủ. Chuyển nạp rộng được thông qua bởi một số thùc khuÈn thÓ độc tính và thùc khuÈn thÓ ôn hòa nào đó mà nhiễm sắc thể của nó không kết gắn vào tại những vùng đặc thù trên nhiễm sắc thể ký chủ. Không phải tất cả các thùc khuÈn thÓ gây nhiễm đều có thể làm trung gian cho quá trình chuyển nạp. Ví dụ: Các thùc khuÈn thÓ T (T2, T4, T6) phân giải DNA chủ và sử dụng lại các nucleotide đơn này để tổng hợp lên DNA của thùc khuÈn thÓ, cho nên DNA của ký chủ không tồn tại để lắp ghép khôi phục lại ở thế hệ sau. Loại thùc khuÈn thÓ khác có thể không phân giải được DNA của ký chủ,vì nhiễm sắc thể của ký chủ quá lớn cho quá trình lắp ghép toàn bộ, chúng sẽ không có thể hình thành lên những thể chuyển nạp. Sau khi thùc khuÈn thÓ chuyển đẩy (tiêm) ®o¹n DNA ký chủ vào tế bào nhận, đoạn DNA đó có thể kết gắn vào nhiễm sắc thể tế bào nhận tương tự như quá trình biến nạp chỉ khác là đoạn DNA gắn vào đó là sợi kép, hoặc tồn tại tự do ở trong tế bào chất và khi đó đoạn đó không tái bản được nên chỉ truyền cho một thế hệ tế bào. Khi đó các gen nằm trong đoạn được chuyển nạp có thể biểu hiện. Tế bào mang đoạn này được gọi là những thể chuyển nạp không thành (thui) lúc này chúng có một số phần là nhị bội có thể được sử dụng để tiến hành thử nghiệm đối xứng đề nghiên cứu những đột biến khác nhau có thể xảy ra trên một gen hay nhiều gen khác nhau. • Chuyển nạp đặc thù vị trí (specilized transduction) Thông qua thực khuẩn ôn hòa mà nhiễm sắc thể của nó có khả năng gắn tại một hoặc một vài vị trí đính đặc thù trên nhiễm sắc thể ký chủ. Nhiễm sắc thể của phage ôn hòa thuộc kiểu này có cả 2 khả năng: - Tự tái bản độc lập cùng với nhiễm sắc thể cña tế bào ký chủ. - Tái bản đoạn được kết gắn vào nhiễm sắc thể tế bào ký chủ và tái bản cùng với nhiễm sắc thể ký chủ. Do vậy người ta gọi những thùc khuÈn thÓ thuộc kiểu này là episome hoặc yếu tố F trong vi khuẩn, khi đó tế bào vi khuẩn có chức năng này như giới tính đực (cho). F là một phân tử DNA vòng có chứa khoảng 94.000 cặp basse, bằng khoảng 2,5% tổng lượng DNA của nhiễm sắc thể ký chủ E.coli, khoảng 1/3 số gen trong F liên quan đến việc chuyển vật liệu di truyền đực sang cho cái (tế bào vi khuẩn không có yếu tố F). Hình 15.5. Sơ đồ quá trình kết gắn và cắt của nhiễm sắc thể thực khuẩn thể lambda. Khi nhiễm sắc thể lambda bắt đầu xâm nhiễm, thì nó là một phân tử DNA mạch thẳng chứa trình tự các gen từ A đến R. Sau khi lây nhiễm chúng chuyển thành sợi vòng. Khi lamda đi theo hướng ôn hoà chúng tiến hành trao đổi và kết gắn DNA của mình vào DNA nhiễm sắc thể tế bào chủ tại vị trí đặc thù giữa pp’ trên nhiễm sắc thể của phage và vị trí kết gắn lambda bb’ của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Quá trình kết gắn nhờ sản phẩm của gen int biến vi khuẩn trở thành trạng thái prophage và trình tự của gen lambda sẽ là p’-CIII R-A-J-p. - Cơ chế kết gắn tái tổ hợp DNA cña thùc khuÈn thÓ vào DNA nhiễm sắc thể E.coli(h×nh 15.5) tạo thành nhiễm sắc thể vi khuẩn tái tổ hợp prophage. Trong prophage, những gen có liên quan đến quá trình tái bản của virut, làm tan rã tế bào vi khuẩn thì sẽ bị ức chế hoặc ngừng hoạt động. Vi khuẩn nào mang prophage được gọi là vi khuẩn lysogenic. Vi khuẩn lysogenic sẽ miễn dịch với quá trình xâm nhiễm lần sau của cùng 1 virut. - Khi thùc khuÈn thÓ ôn hòa trải qua trạng thái phân chia tế bào hiếm với tần suất khoảng 1/105 th× từ trạng thái prophage cã thÓ chuyển sang trạng thái thùc khuÈn thÓ ®éc lËp và nhiễm sắc thể ký chủ riêng biệt (trạng thái lytic state). Quá trình trên có thể được kích thích bởi tia UV, như vậy thùc khuÈn thÓ phải cắt ra khỏi nhiễm sắc thể tế bào ký chủ nhưng theo những vị trí đặc thù, thường là chính xác. Đôi khi quá trình cắt xảy ra không phải ở chỗ gắn ban đầu mà ở một nơi khác sẽ xảy ra trường hợp một phần DNA của thùc khuÈn thÓ còn lại trên nhiễm sắc thể vi khuẩn, ngược lại một phần DNA của vi khuẩn bị cắt theo thùc khuÈn thÓ (h×nh 16.5). Hình 16.5. Sơ đồ biểu diễn quá trình hình thành thể chuyển nạp đặc thù chứa gen ldg. Quá trình xảy ra giống như hình 15.5 trừ trường hợp tái tổ hợp không xảy ra tại vị trí tương đồng giữa bp’ và pb’ thay vào đó tái tổ hợp xảy ra giữa một vị trí trong vùng gen gal của nhiễm sắc thể ký chủ và một vị trí ở trong vùng chứa từ gen F đến gen J trên nhiễm sắc thể lambda. Kết quả nhiễm sắc thể lambda được ngắt ra sẽ gồm một đoạn DNA chủ chứa vùng gen gal và phần gen J của lambda nằm lại ở nhiễm sắc thể ký chủ. - Chỉ những gen nằm gần vị trí thùc khuÈn thÓ kết gắn mới có thể bị cắt ra cùng với thùc khuÈn thÓ, một đoạn ngắn ở cả 2 phía. Ví dụ thùc khuÈn thÓ l gắn vào vùng giữa gen gal cần cho việc sử dụng đường lactose làm năng lượng và gen bio cần cho việc tổng hợp biotin của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Lamda như thế thường chỉ chuyển nạp chỉ thị gal và bio. Còn thùc khuÈn thÓ chuyển nạp chuyên tính f80 thì lại kết gắn vào vùng gần những gen trp của vi khuẩn (cần để tổng hợp a.amin triptophan) thì lại chuyển nạp chỉ thị trp. Hình 17.5. a) Sơ đồ mô tả quá trình kết gắn nhiễm sắc thể l dg mang gen gal+ vào nhiễm sắc thể ký chủ mang gen gal- để hình thành nên thể biến nạp nhị bội gal+/gal-. b) Nhờ sự kết gắn nhiễm sắc thể l+ trợ giúp để hình thành nên nhiễm sắc thể ký chủ lai chứa thể vi khuẩn l+/ldg kép. Thể vi khuẩn này dưới tác động của tia UV sẽ tạo ra một Hft chứa 50% gen của ldg và 50% của l+. Nếu như tế bào chủ lúc này được nhiễm với đơn thể ldg sẽ thu được tỷ lệ tế bào nhiễm phage thấp, còn nếu như tế bào ký chủ được lây nhiễm cả hai ldg và l+ sẽ thu được tỷ lệ tế bào nhiễm phage cao và tất cả các tế bào nhiễm đều mang cả hai phage ldg và l+. Nếu tỷ lệ phage/ vi khuẩn đủ lớn thì vi khuẩn nhận cũng bị nhiễm cả l kiểu dại, genome của l dại sẽ gắn xen vào vị trí đính của l bình thường tạo ra thể chuyển nạp mang một l+ prophage và một ldg (hình 8.6b). Lúc này thể chuyển nạp sẽ trở thành thể lưỡng bội từng phần gal+/gal- gọi là thể dị hợp (gal+/gal- heterogenote) và chứa gal+ (exogenote, đoạn DNA cho) và gal- (endogenote, nhiễm sắc thể nhận). Thể lưỡng bội từng phần gal+/gal- này thường kém bền vững, chúng phân li thành những tế bào gal- với tần số khoảng 1/1000 tế bào phân chia do bị cắt bỏ nhiễm sắc thể ldg. Vì l dg không thể tái bản khi không có mặt của phage trợ giúp, vì thế l dg thường bị đào thải. Tái tổ hợp có thể xảy ra giữa gal+ exogenote và gal- endogenote nhằm chuyển gal+ cho gal- endogenote để tạo thành thể chuyển nạp gal+ bền vững. Vì sự có mặt của những gen l kiểm tra khả năng miễn dịch của những nhiễm sắc thể vi khuẩn chứa l dg cho nên thể chuyển nạp lưỡng bội từng phần sẽ miễn dịch đối với sự xâm nhiễm của l này. Nếu thể chuyển nạp chứa l dg và l+ kép (hình 8.6b) bị kích hoạt bởi tia uv chúng sẽ sinh ra 50% thể chứa ldg và 50% thể chứa l+; cả hai prophage này sẽ bị cắt rời và sẽ tái bản sử dụng sản phẩm gen mã hoá bởi genome l+. Những tế bào này gọi là tế bào Hft. Tế bào Hft có thể tạo thành từ dị hợp gal+/gal-(heterogenote) bằng cách nhiễm chúng với l kiểu dại từ sau đó kích hoạt bằng tia uv. - Hợp phần nhiễm sắc thể chuyển nạp được tạo ra bằng hình thức chuyển nạp chuyên tính khác nhiều so với hợp phần nhiễm sắc thể chuyển nạp được tạo ra do hình thức chuyển nạp rộng hoặc biến nạp. Ở trường hợp sau, tái tổ hợp hình thành do sự thay thế đoạn nhiễm sắc thể vi khuẩn nhận bằng đoạn nhiễm sắc thể của vi khuẩn cho. Đối với trường hợp chuyển nạp chuyên tính thì đoạn DNA của vi khuẩn cho và nhiễm sắc thể của thùc khuÈn thÓ cùng nhập vào nhau và gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn nhận (h×nh 17.5 a) tạo ra thể chuyển nạp lưỡng bội từng phần (gal+/gal-). Thể chuyển nạp lưỡng bội từng phần có một số hệ quả quan trọng. Thùc khuÈn thÓ chuyển nạp được tạo ra gọi là l dg ( l thiếu gal), vì l này không còn chứa gen gal cần thiết cho sinh trưởng và trưởng thành, thay vào đó là đoạn DNA của vi khuẩn. l dg chỉ được sinh ra khi có mặt của thùc khuÈn thÓ l trợ giúp (l phage helper) dạng dại. Chữ g chứng tỏ rằng có tồn tại những gen của vi khuẩn đó là gen gal chứ không phải là gen bio. Những l chứa gen gal khi bị kích thích bởi tia UV sẽ sinh ra một số ít l dg, là thưc khuẩn có chứa gen gal từ vi khuẩn cho. Khi l dg xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn nhận không chứa gen gal, thì l dg sẽ nhập vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn nhận bằng cách trao đổi chéo trong nội vùng gen gal tại vị trí l đính vào. Bởi thế vi khuẩn không có gen gal không có khả năng sử dụng đường galactose. c. Tiếp hợp (conjugation) Phát hiện đầu tiên bởi J.Lederberg (1946 và E.L.Tatum (1958) cả 2 cùng được nhận chung giải thưởng Nobel sinh học. Trong quá trình tiếp hợp DNA sẽ được chuyển từ tế bào cho (male) sang tế bào nhận (female)(h×nh 18.5). Khi 2 tế bào tiếp xúc với nhau ống tiếp hợp giữa chúng hình thành, xẩy ra hình thức chuyển DNA một chiều. Tế bào nào có khả năng cho khi tiếp hợp sẽ bị phân hóa do sự có mặt yếu tố F pili (yếu tố giới tính). Yếu tố F là vi khuẩn đực, F là một phân tử vòng plasmid dài khoảng 94.000 bp = 2,5% tổng DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn E.coli vµ bằng 1/3 số gen của vi khuẩn. Yếu tố F liên quan đến việc chuyển vật chất di truyền đực sang cái và tạo cả ra ống nối cho DNA truyền qua. Hình 18.5. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử quá trình hình thành ống tiếp hợp và nhận nhân tố giới tính F+ của tế bào F- từ tế bào Hft. F factor có thể tồn tại ở 2 trạng thái khác nhau: Trạng thái độc lập (autonomous) khi đó chúng tái bản độc lập với nhiễm sắc thể ký chủ và trạng thái kết gắn vào nhiễm sắc thể ký chủ, trở thành một bộ phận của nhiễm sắc thể tế bào ký chủ và cùng tái bản với tế bào ký chủ (h×nh 19.5). Hình 19.5. Ba trạng thái khác nhau của tế bào E.coli. I, không chứa yếu tố F; II, Tế bào F+ chứa yếu tố F độc lập; III, tế bào Hft chứa yếu tố F kết gắn vào nhiÔm s¾c thÓ ký chủ. Tiếp hợp xẩy ra giữa F+ với F- thì chỉ có yếu tố F được truyền sang F- còn Tiếp hợp giữa Hft với F- thì xẩy ra quá trình cắt dời F khỏi nhiÔm s¾c thÓ rồi mới chuyển sang F-. Hình 20.5. Quá trình chuyển từ tế bào F+ thành tế bào Hfr thông qua kết gắn yếu tố F tự do vào nhiễm sắc thể ký chủ theo cơ chế cắt đảo ngược như yếu tố IS, thứ tự gen a, b, c và d trên yếu tố F khi nhập vào nhiÔm s¾c thÓ vi khuẩn sẽ thay đổi đọc như chiều mũi tên. Tế bào nào chứa yếu tố F độc lập gọi là tế bào F+. Khi tế bào F+ tiếp xúc với tế bào vi khuẩn không chứa F+ là tế bào vi khuẩn nhận gọi là tế bào F- thì chỉ nhân tố F được truyền từ tế bào F+ sang tế bào F- và tế bào này trở thành tế bào F+. Bởi vậy nếu trộn lẫn hai tế bào này với nhau thì thế hệ sau sẽ cho hầu hết các tế bào đều là F+. Yếu tố F có thể kết gắn vào một trong nhiều vị trí bằng cơ chế trao đổi tương đồng (h×nh 20.5). Việc kết gắn của yếu tố F vào nhiễm sắc thể của tế bào ký chủ do những đoạn DNA ngắn gọi là những nhân tố IS. Tế bào vi khuẩn chứa nhân tố F kết gắn vào gọi là tế bào Hfr (High frequency recombination). Ở trạng thái kết gắn Hfr, yếu tố F có thể làm vật trung gian cho việc chuyển một phần nhiễm sắc thể của tế bào Hfr sang cho tế bào nhận F-, thường thì chỉ một phần của nhiễm sắc thể Hfr được chuyển sang. Cơ chế chuyển DNA từ tế bào cho sang tế bào nhận trong quá trình tiếp hợp bắt đầu bằng việc cắt một mạch ở một điểm đặc thù của yếu tố F. Đầu 5’ của sợi đơn bị cắt sau đó được chuyển qua ống tiếp hợp rồi vào tế bào nhận (h×nh 21.5) Vì điểm bắt đầu chuyển nằm trong phạm vi của yếu tố F nên lần lượt các phần của F được chuyển từ tế bào Hfr cho tế bào F-, khi chuyển sẽ theo lần lượt các gen nằm trên nhiễm sắc thể Hfr. Phần còn lại của F cuối cùng cũng có thể được chuyển theo. Hình 21.5. Cơ chế truyền DNA trong quá trình tiếp hợp. a) Tế bào cho chứa F+ hoặc Hfr. b) Khi tiếp hợp với F- enzyme endonuclease cắt sợi đơn DNA của yếu tố F tại điểm duy nhất. c) Đầu 5’ của sợi bị cắt trên yếu tố F của tế bào cho sẽ được tái bản để bù lại theo cơ chế vòng lăn, còn sợi đơn vừa được cắt ra sẽ chuyển sang tế bào F- qua ống tiếp hợp, và tổng hợp thành sợi kép theo từng đoạn Okazaki, sau đó gắn lại bằng ligase thành thể tế bào F+ mới. 2. Mô hình tái tổ hợp theo Holliday (Holliday model) Là mô hình mô tả hàng loạt các sự kiện đứt nối xảy ra trong quá trình trao đổi chéo giữa 2 nhiễm sắc thể tương đồng ở sinh vật nhân thật bậc cao. a. Để hiểu cơ chế này chúng ta cần nắm một số vấn đề sau: - Trao đổi chéo xẩy ra giữa 2 cặp nhiÔm s¾c thÓ tương đồng trong quá trình giảm phân (h×nh 22.5 vµ 23.5). Hình 22.5. Sơ đồ trao đổi chéo giữa 2 locus gen A, a và B, b. Trao đổi chéo chỉ xẩy ra trên 2 trong 4 nhiễm sắc thể chi em hình thành nên giao tử tái tổ hợp. Hình 23.5. Trao đổi chéo xẩy ra ở nấm Neurospora giữa 2 locus gen A,a và B,b. a) Trao đổi chéo xẩy ra trước khi nhân đôi nhiễm sắc thể qua phân bào giảm nhiễm sẽ tạo ra 100% giao tử tái tổ hợp. b) trao đổi chéo xẩy ra sau tái bản DNA, giai đoạn tứ tử thể sẽ thu được 50% giao tử tái tổ hợp giữa 2 gen. - Vị trí của 1 gen trên nhiễm sắc thể gọi là locus, chúng được xắp xếp thành chuỗi đường thẳng - 2 alen của 1 gen trong cơ thể dị hợp tử chiếm vị trí tương ứng trên 2 nhiễm sắc thể tương đồng, alen A nằm trên nhiễm sắc thể tương đồng 1 còn allele kia (a) nằm trên nhiễm sắc thể tương đồng 2. - Trao đổi chéo liên quan đến việc gãy một trong 2 nhiễm sắc thể tương đồng (thực tế là nhiễm sắc thể tử) rồi trao đổi các phần cho nhau. - Trao đổi chéo xảy ra ở giai đoạn sợi thô (pachytene) giai đoạn 2 nhiễm sắc thể tương đồng (tetrad) hoàn toàn tiếp hợp với nhau, mỗi bộ gồm 2 nhiễm sắc tử kép hay cặp lưỡng trị. Trao đổi chéo xảy ra giữa các nhiễm sắc tử có thể xảy ra giữa 2 nhiễm sắc tử của 1 nhiễm sắc thể tương đồng nhưng không phát hiện được vì chức năng của cả 2 đều giống nhau. - Trao đổi chéo tạo thành nhiễm sắc thể có tổ hợp mới các gen liên kết gọi là trao đổi chéo ở vùng giữa 2 locus gen. - Tần số trao đổi chéo giữa 2 locus tăng dần theo khoảng cách giữa 2 gen. b. Cơ chế trao đổi chéo đơn theo Holliday (h×nh 24.5) - 2 phân tử DNA kép của 2 nhiễm sắc tử không chị em xếp thẳng hàng cân xứng với nhau, để khi trao đỏi không làm mất đi hoặc nhân lên bất kỳ một thông tin di truyền nào (a). - 2 sợi đơn của cùng một đối cực bị khía đứt ở vị trí tương ứng nhờ enzyme endonulease, làm gẫy ra (b). - Mỗi chuỗi gẫy rời khỏi mạch cũ nhờ enzyme bọc DNA (DNA binding) hoặc protein tháo xoắn DNA (DNA unwinding protein) và ghép cặp với mạch đơn không gãy ở chuỗi kép đối diện nhờ protein RecA (c). - Enzyme ligase gắn liền những sợi gãy lại để tạo thành điểm nhánh trong (d và c), nhánh này tự do quay vặn sang phải hoặc trái (f), do đó nó có thể thay đổi vị trí chuyển động được gọi là hiện tượng dịch chuyển nhánh (branch migration). Thí dụ: Nhánh chéo được rời sang phải lúc này phân tử DNA được vẽ có 2 vai bị kéo đứt chuyển đến hình (g), đoạn ab bị quay 1800 so với đoạn AB, kết quả tạo lên hình X, ở hình này chúng ta có thể thấy rõ 4 phần (sector) sợi DNA đơn của vùng nhánh. - Để tách cấu trúc này thành 2 sợi kép thì quá trình cắt sợi đơn do enzyme endonuclease tại vùng nhánh chéo được xảy ra. Chiều cắt có thể xảy ra theo hướng thẳng đứng sẽ tạo ra hình (h) hoặc cắt ngang sẽ trở lại như ban đầu. ở chiều cắt thẳng đứng sợi kép được tách ra có dạng như hình (i), sau đó vết khía sẽ được kết dính lại nhờ enzym DNA ligase thì sợi kép mỗi một mạch sẽ chứa một mảnh như hình (j). Trong trường hợp nhiễm sắc tử trao đổi chéo đơn (Ab và aB) người ta đã phát hiện thấy những cấu trúc tương tự của phân tử vẽ ở hình (g) được quan sát dưới kính hiển vi điện tử có tên là Holliday intermediate (1964) hay cấu trúc khi (c). Quá trình tái tổ hợp xảy ra được cần có 2 điều kiện: - 2 vùng DNA tái tổ hợp phải có trình tự tương đồng. - Và một trong 2 trình tự đó phải có điểm đứt trên một mạch. Điều khiển quá trình tái tổ hợp do các protein RecB và RecC (là sản phẩm của gen RecB và RecC của hệ thống SOS), có tác dụng tháo xoắn và cắt đứt một trong 2 mạch DNA. Sự cắt đứt này do phức hợp RecBC nhận một trình tự gọi là trình tự c và cắt cách đó vài bazơ, sau đó protein RecA gắn lên mạch DNA bị đứt sẽ tạo thuận lợi cho việc nhận biết trình tự tương đồng ở mạch kia và hình thành lên phân tử lai và cắt sửa lại nhờ enzym exonulease và DNA polymerase. ©m men cã thÓ tån t¹i æn ®Þnh á Hình 24.5. Sơ đồ các đường hướng gãy nối lại các sợi nhiễm sắc thể tương đồng với sự tham gia của một số enzyme theo Holliday, 1964 và bổ xung bởi H. Potter và D. Dressler, 1976. c. Trao đổi chéo kép(h×nh 25.5) Là mô hình gãy mạch kép tái tổ hợp. (a) nhiễm sắc tử tương đồng 1 chứa 2 gen A & B dưới tác động của enzym endonuclease và exonuclease sẽ tạo thành lỗ hổng (gap)(b), tiếp tục do xúc tác bởi 2 enzym này làm sợi DNA của nhiễm sắc tử tương đồng 1 bị gẫy rời (c). Đầu mạch đơn tự do ở chỗ cắt bị xen gắn bởi phân tử DNA của nhiễm sắc thể tương đồng 2 (d), quá trình này được xúc tác bởi protein kiểu RecA, tạo thành 2 bắt chéo. Sau đó 2 bắt chéo bị đứt và được lấp đầy bởi các enzym polymerase và ligase. Quá trình kết gắn sẽ làm 2 sợi kép dính vào nhau tại 2 vị trí bắt chéo tạo thành 2 phân tử DNA tái tổ hợp (f). Hình 25.5. Mô hình trao đổi chéo kép giữa 2 gen A,a và B,b. d. Trao đổi chéo kết hợp với chuyển đổi gen hoặc sửa chữa đoạn gen hỏng (gen conversion)(h×nh 26.5). Khi xảy ra ghép nhầm tại m giữa 2 nhiễm sắc tử trong tứ trị (tetrad), nhờ cơ chế tổng hợp sửa chữa (repair synthesis) chỉnh lại chỗ nhầm, chuyển m thành m+ đồng thời vừa xảy ra trao đổi chéo đơn dẫn đến tạo ra các nhiễm sắc tử có 3m+ và 1m chứ không như bình thường là 2 m+ và 2m (m là dạng đột biến). Nếu số lượng bản sao và các gen hoạt động là tiêu chuẩn chọn lọc, thì gen không hoạt động sẽ bị đào thải sau nhiều lần tái tổ hợp. Hình 26.5. Mô hình trao đổi chéo kép Holliday kết hợp với loại bỏ phần sai hỏng tạo ra các loại giao tử khác nhau e. Quá trình tái tổ hợp gen lặp lại Trong genome có nhiều gen lặp lại, nếu có trao đổi chéo xẩy ra giữa các đoạn gen tương đồng sẽ sinh ra hiện tượng mất, tăng hoặc đảo đoạn dẫn đến đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể. Quá trình tái tổ hợp cũng có thể làm tăng hoặc giảm số lượng các bản sao của gen lặp lại. Nếu các gen lặp lại nhiều lần trên một nhiễm sắc thể, thì sự bắt cặp có thể xảy ra ở bất kỳ bản sao nào (vị trí bắt chéo nào) của mỗi nhiễm sắc thể tương đồng. Tái tổ hợp có thể xẩy ra không đều giữa các cặp nhiễm sắc thể tương đồng dẫn đến tạo ra nhiễm sắc thể này có nhiều bản sao còn nhiễm sắc thể kia thì ít bản sao hơn. Tái tổ hợp còn là cơ sở cho sự điều hòa biểu hiện của gen. Nhiều gen ở điều kiện bình thường thì bất hoạt do thiếu trình tự khởi động, khi tái tổ hợp nếu trình tự khởi động được chuyển đến sẽ trở lên hoạt động. III. Các gen nhảy hay yÕu tố di động (transposable element) Đầu tiên được phát hiện bởi Barbara McClintock thông qua phân tích tính biến động di truyền ở ngô, nhờ vậy mà năm 1983 bà được nhận giải thưởng Nobel. YÕu tố nhảy là một trình tự DNA có khả năng gắn xen vào hay rời ra khỏi DNA của nhiễm sắc thể, trên trình tự này có chứa các gen dẫn đến làm biến đổi hoạt động di truyền của các gen. Ở E.coli cũng có yÕu tố nhẩy là trình tự IS (insert sequence) hay là trình tự gắn xen. Sau đó người ta phát hiện ở cả động vật và thực vật cũng có những yÕu tố tương tự nhưng có cấu trúc phức tạp hơn gọi chung là transposon. 1. Trình tự IS Phát hiện đầu tiên ở E.coli do tác động ức chế của chúng lên hoạt động của các gen, khi có IS xen vào trong gen tương ứng thì vi khuẩn mất khả năng lên men galactose, khi yÕu tố này dời khỏi gen thì quá trình lên men galactose lại được tiến hành. IS có chiều dài khoảng 1 kb, loại nhỏ nhất chỉ dài từ 10-40 bp gồm 1 đoạn trung tâm đặc trưng cho từng IS, 2 đầu là 2 đoạn ngắn (khoảng 15-25 bp) giống nhau nhưng ngược chiều nhau. Vì các trình tự IS không mã hóa ra protein do vậy chỉ phát hiện được thông qua tác hại của chúng. Hai đầu cña IS là nơi nhận biết của enzyme transporase, IS còn chứa gen mã hóa enzyme transporase, xúc tác cho quá trình gắn xen (h×nh 27.5). Hình 27.5. Sơ đồ cấu trúc nhân tố IS50 và 2 bản sao 2 đầu của IS50, tính từ giữa ra gồm 2 bản sao dài 9 bp, giống nhau nhưng ngược chiều nhau (terminal inverted repeats) tiếp đến là 2 đoạn tái bản đích dài 9 bp giống nhau và cùng chiều nhau (target site duplication). YÕu tố IS 50 khi gắn xen vào nhiễm sắc thể vi khuẩn hoặc thể plasmid sẽ tạo ra 2 bản sao duplication tại vị trí gắn xen, bản sao này dài từ 3-12 cặp nu, gọi là bản sao vị trí đích, được coi là tác nhân gây nên sự gẫy so le sợi DNA mạch kép (h×nh 28.5). Ở vi khuẩn E.coli, IS hỗ trợ cho việc gắn xen episome vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Hình 28.5. Sơ đồ tạo ví trí tái bản đích do quá trình gắn xen nhân tố IS. Nhân tố này gây nên sự gẫy cắt tại vị trí DNA đích sau đó gắn xen IS vào, phần sợi đơn trống được lấp đầy lại đã tạo nên 2 đoạn lặp lại 2 bên giống nhau nhưng ngược chiều. 2. Transposon Là một dạng trình tự nhảy, phát hiện ở cả sinh vật tiền nhân và sinh vật nhân thật, nó được chặn 2 bên bằng một đoạn lặp lại có chiều ngược nhau, tiếp đến lại được kẹp bởi đoạn lặp lại trực triếp (hình 27.5). Transposon có kích thước lớn hơn IS, bên trong cũng mang các gen mã hóa cho enzyme transporase và resolvase, đây là các enzyme xúc tác cho quá trình tái tổ hợp đặc thù vị trí. Giữa 2 transposon có một trình tự lặp lại trực tiếp có cấu trúc đồng kết gắn (cointergrate structure), đó là quá trình kết gắn giữa 2 phân tử DNA vòng, một trong chúng có chứa transposon vòng, còn DNA kia thì không. 3. Transposon tổng hợp (composite transposon) - Được tạo thành sau khi 2 IS khác nhau cùng gắn xen vào một vị trí gần nhau. Đoạn DNA giữa chúng sau đó có thể được di rời bởi hoạt tính đồng kết gắn của những nhân tố kề bên cạnh. 3 thí dụ về các dạng transposon này được trình bày ở (h×nh 29.5, 30.5 vµ 31.5. Hình 29.5. Cấu trúc của các trasposon tổng hợp, chiều và số np. a) Cấu tạo Tn9 gồm 2 IS1 dài 768 np kẹp biên gen cam chống lại chloramphenol. b) Tn5 gồm 2 yếu tố IS50 dài 1533 np kẹp biên gene kháng kanamycin. c) Tn10 gồm 2 yếu tố IS10 kẹp biên gen kháng lại tetracycline. Hình 9.6 trang 234 ngld Hình 30.5. Tác dụng điều khiển của Tn5 vào : a) quá trình lây nhiễm của thực khuẩn thể mang Tn5 vào vi khuẩn E.coli . Tế bào nào chứa Tn5 sẽ hạn chế quá trình chuyển nạp. Cơ sở di truyền của gen điều khiển Tn5 như sau : b) Yếu tố IS50R tạo ra 2 protein, một protein chính là men transposase, xúc tác cho quá trình chuyển vị còn một protein khác chính là repressor lại ức chế quá trình chuyển vị. Protein ức chế thường nhiều hơn transposase cho nên hiệu quả ức chế của nó thường vượt trội hơn. Hình 31.5. Cấu tạo gen của Tn3 gồm 3 gen và protein chúng tạo ra và chiều dài các gen 4. Các cơ chế hoán chuyển gen ở vi khuẩn Trước hết dưíi tác động của enzyme transporase, đoạn DNA nơi sẽ nhận đoạn gắn xen sẽ bị cắt đứt ở cả 2 mạch, hình thành lên 2 đầu so le (cohensive end). Sau đó việc hoán vị gen được thực hiện nhờ enzyme resolvase. Enzyme resolvase có vai trò xúc tác cho quá trình tái tổ hợp đặc thù vị trí giữa 2 transposon tồn tại như là những đoạn lặp lại trực tiếp trong cấu trúc đồng kết gắn. Quá trình này có thể xảy ra 2 khả năng: 1/ Transposon được tái bản, bản cũ ở lại vị trí ban đầu, bản sao kia chuyển đến vị trí mới. 2/ Transposon bị cắt rời và chuyển sang vị trí mới như vậy vị trí cũ bị mất transposon (h×nh 32.5). Hình 32.5. Quá trình hoán chuyển Tn3. Plasmid cho chứa 1 copy Tn3 còn plasmid nhận không chứa Tn3 gặp nhau nhờ men transposase do gen tnpA của Tn3 sinh ra sẽ xúc tác việc hình thành nên đồng kết gắn làm 2 plasmid kết gắn lại với nhau. Trong quá trình xẩy ra Tn3 nhân đôi tạo thành 2 Tn3 ở 2 đầu gắn. Enzyme resolvase do gen tmpR tạo ra, xúc tiến quá trình nội trao đổi chéo, sẽ tạo thành 2 plasmid mới đều cùng chứa Tn3. Ví dụ về quá trình chuyển vị của Tn3. Khi plasmid cho, chứa 1 copy Tn3 còn plasmid nhận không chứa Tn3 được trộn lẫn với nhau. Enzyme transporase được sinh ra nhờ gen tnpA của Tn3 sẽ xúc tác cho quá trình đồng kết gắn 2 plasmid này lại, kết quả sẽ tạo thành 1 plasmid lai tái tổ hợp, cũng trong quá trình này Tn3 cũng được tái bản nên có thêm 1 copy nữa ở đầu nối đối diện của plasmid lai. Enzyme resolvase được tạo ra nhờ gen TnpA của Tn3 sẽ xúc tiến quá trình nội tái tổ hợp giữa 2 Tn3. Kết quả quá trình tái tổ hợp này sẽ làm 2 plasmid tách nhau ra và mỗi thể có thêm một Tn3. 5. Các transposon ở Eukaryote Nếu transposon ở vi khuẩn có nguồn gốc từ DNA thì phần lớn các transposon của Eukaryote đều bắt nguồn từ RNA. Các RNA được gắn xen vào bộ gen theo cơ chế gièng nh­ các retroviut sử dụng, chính vì thế mà chúng còn được gọi là các retroposon. Thí dụ như cơ chế xâm nhiễm của virut HIV vào cơ thể (h×nh 33.5). Virut HIV (human immunodefiency virus) là một retrovirut hay Retroposon , thuéc nhãm virus sao chÐp ng­îc . Retroposon có 2 loại, loại 1 từ RNA của tế bào, loại 2 từ RNA của virut. Hình 33.5. Vòng đời của virút HIV-1. Bªn ngoµi thÓ virut lµ vá glycoprotein (gp) 120, nhê vËy mµ chóng cã thÓ b¸m ®­îc vµo bề mặt cña tế bào thụ cảm T CD4, tế bào hấp thụ virút, RNA cña virut được chuyển thành DNA nhờ enzyme reverse transcriptase. Sau đó DNA cña virut nhập gắn vào DNA của tế bào ký chủ chở thành HIV provirut. HIV provirus. ViÖc ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh phiên mã sinh RNA phụ thuộc vào sản phẩm của gen tat và rev. Giai đoạn đầu, khi chưa có sản phẩm Rev thì chỉ một phần RNA được cắt rời ra của virut HIV, sẽ chuyển ra tế bào chất rồi dịch mã, tạo thành protein Tat, Rev và Nef. Protein Tat quay lại kích thÝch sự phiên mã để sinh ra nhiều RNA. Khi lượng protein Rev đạt đến một mức độ nhất định thì toàn chuỗi RNA của virút sÏ rời khỏi nhân, ra tế bào chất để dÞch m· sinh ra các protein của virút. Thành phần gồm: các protein cấu trúc, enzyme reverse transcriptase, protein vỏ virút như env, gag và pol… . Các protein này lắp ghép lại để bọc lấy RNA của virut để tạo thành một thể virút mới, ra ngoài tế bào đi lây nhiễm sang tế bào khác. - Virus nµy g©y nªn héi chøng suy gi¶m miÔn dÞch m¾c ph¶i AIDS (acquaired immune deficiency syndrome), khi x©m nhËp vµo c¬ thÓ ng­êi th­êng ®­îc tÕ bµo ®¹i thùc bµo T CD4 hç trî hÊp thô vµ sèng ký sinh ë ®©y, sau nµy cã thÓ sèng trong c¶ tÕ bµo n·o. - Khi bÞ nhiÔm lóc ®Çu cã thÓ næi h¹ch b¹ch huyÕt, mÖt mái, ®au m×nh, sèt l¹nh lïng. Sè l­îng tÕ bµo T CD4 bÞ gi¶m nh­ng kh¸ng thÓ vÉn ®­îc tiÕt ra ®Ó chèng l¹i virus, v× thÕ l­îng kh¸ng thÓ cã trong m¸u lµ mét chØ tiªu chÈn ®o¸n nhiÔm HIV. Nh­ng kh¸ng thÓ kh«ng cã t¸c dông tiªu diÖt virus v× chóng ký sinh bªn trong tÕ bµo hoÆc n»m trong nhiÔm s¾c thÓ. - Giai ®o¹n sau cña nhiÔm virus HIV cã biÓu hiÖn sè tÕ bµo T CD4 bÞ gi¶m m¹nh xuèng d­íi 250 tÕ bµo/1mm3 (ng­êi kháe cã 800 tÕ bµo T CD4), h¹ch b¹ch huyÕt næi ë cæ, ë n¸ch vµ bÑn bÞ s­ng. §Õn giai ®o¹n AIDS (giai ®o¹n 3) bÖnh nh©n th­êng m¾c ph¶i c¸c bÖnh nh­ lao phæi, viªm phæi hoÆc ®èi víi phô n÷ lµ ung th­ d¹ con di c¨n - Nguy hiÓm cña HIV kh«ng nh÷ng ph¸ hñy tÕ bµo miÔn dÞch T CD4 mµ RNA phiªn m· ng­îc thµnh DNA vµ g¾n nhËp vµo DNA cña tÕ bµo T CD4. - HIV chÕt ë nhiÖt ®é cao (135 F trong 10 phót), bëi c¸c hãa chÊt tÈy röa, diÖt trïng. - HIV l©y qua m¸u, tinh dÞch, tinh ©m ®¹o hoÆc s÷a mÑ. HIV cã thÓ x©m nhËp qua vÕt r¸ch ë líp mµng nhÇy lãt c¬ quan sinh dôc, trùc trµng vµ miÖng, tiªm chÝch ma tóy, truyÒn qua thai nhi, qua m¸u khi sinh ®Î hoÆc qua s÷a khi cho con bó. a. Ở nấm Saccharomyces cerevisiae NÊm nµy có 35 copy của 1 yếu tố nhẩy gọi là TY trong bộ genome đơn bội của mình. Các transposon này dài 5900 cặp nucleotit, bị chặn biên 2 bên bởi 1 trình tự DNA gọi là trình tự d dài khoảng 340 bp (h×nh 34.5) cả 2 đều có trình tự theo một chiều như chúng ta đã gọi là trình tự lặp lại tận cùng dài trực tiếp (long terminal repeats, LTRs). =5900np TyB d 340np TyA d 340np Hình 34.5. Cấu tạo gen yếu tố Ty nấm men và chiều dài gen, trình tự lặp lại 2 đầu d dài 340 np, mçi Ty chứa 2 gen lµ TyA và TyB. Đôi khi có một LTR từ một TY bị tách ra khỏi TY đó rồi ngắn vào một TY khác tạo lên solo d, quá trình này là kết quả của quá trình tái tổ hợp giữa những LTR của một nhân tố TY hoàn chỉnh (h×nh 35.5). Số phận của phân tử vòng được hình thành qua quá trình tái tổ hợp sau đó như thế nào vẫn chưa rõ, nhưng người ta đã tách được những phân tử này từ tế bào nấm men. Yếu tố TY được chặn biên bởi trình tự lặp lại trực tiếp gồm 5 bp, trình tự này được tạo thành bằng cách nhân đôi DNA tại vị trí TY xen vào. Tái bản tại vị trí đính này không có trình tự cố định, nhưng phần lớn có chứa cặp AT. Điều này chứng tá yếu tố TY thường hay xen vào những vùng giàu A-T của genome. Hình 35.5. Quá trình hình thành trình tự solo d bằng cách cắt yếu tố Ty. Quá trình cắt có liên quan đến tái tổ hợp tương đồng giữa những trình tự solo d tại các đầu của yếu tố TY. b. Transposon ở ngô - Nhân tố Ac và Ds ở ngô + Ac là yÕu tố chức năng ở nhiễm sắc thể thường chứa 4563 bp chặn 2 bên bằng 2 đoạn lặp lại dài 8 nu (h×nh 36.5). Trình tự trong 8 nu này được hình thành khi Ac được gắn xen vào vị trí của nhiễm sắc thể. Hai đầu của đoạn Ac có 2 đoạn lặp lại ngược chiều nhau dài 11 nu, đoạn này đóng vai trò quan trọng trong quá trình di chuyển. Tất cả các Ac của ngô đều có cấu trúc tương tự nhưng không giống nhau. + Khác với Ac, Ds cấu trúc rất khác nhau, có một nhóm Ds sinh ra từ những Ac do mất một trình tự ở giữa . Một nhóm Ds khác lại chứa trình tự lặp lại ở đầu cuối của Ac ngược nhau, cũng như một số trình tự ở gần cuối, nhưng phần DNA còn lại thì khác nhau (hình 36.5c). Những thành viên trong gia đình Ac/Ds này được gọi là nhân tố Ds dị thường (aberrant Ds). Nhóm thứ 3 của Ds có đặc điểm sắp xếp cõng đặc thù (pecular piggybacking arragement) (hình 36.5d). Khi 1 Ds gắn xen vào 1 Ds khác nhưng theo hướng ngược chiÒu nhau, thì Ds kép này sẽ có vai trò làm gãy nhiễm sắc thể. Hình 36.5. (a) Cấu tạo nhân tố Ac;(b) yếu tố Ds không độc lập có nguồn gốc từ Ac bằng cách mất đoạn gags ở giũa, (c) một Ds dị thường chứa trình tự tận cùng và bán tận cùng có nguồn gốc từ Ac chặn biên đoạn DNA khác không thuộc Ac và (d) yếu tố Dc kép là yếu tố Dc do 2 Dc lồng ghép vào nhau. Alu: là những đoạn DNA lặp lại rải rác trong genome người, dài khoảng 300bp, có c¶ thÈy 500000 bản copy này, chiếm tổng chiều dài khoảng 5% lượng DNA của người. Mỗi đoạn được cấu tạo bởi 2 đoạn dài 140bp DNA, gắn ở 2 đầu là đoạn dài 31bp. Đoạn này có khả năng di động, khi đó nó bị cắt bởi enzyme giới hạn endonuclease Alu 1. Tóm lại: Mặc dù các transposon và retroposon không đóng vai trò gì trong sinh học, nhưng lại có tác động đến hoạt hóa của gen trong sinh vật mang chúng, nên nó có ý nghĩa trong quá trình tiến hoá của sinh giới.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docChương V.doc
  • docbia.doc
  • docCHƯƠNG I.doc
  • docCHƯƠNG II.doc
  • docCHƯƠNG III.doc
  • docCHƯƠNG IV.doc
  • docCHƯƠNG IX.doc
  • docCHƯƠNG VI.doc
  • docChương VII.doc
  • docCHƯƠNG VIII.doc
  • docCHƯƠNG X.doc
  • docChương XI.doc
  • docChương XII.doc
  • docChương XIII.doc
  • docChương XIV.doc
  • docChương XV.doc
  • docGiai thich thuat ngu+Muc luc.doc
  • docLOI NOI DAU.doc