Tách tế bào bằng Trypsin

Đặt vấn đề Để nuôi cấy sơ cấp hay thứ cấp tế bào động vật thì việc đầu tiên phải làm là tách rời các tế bào ra khỏi mô và giữa các tế bào với nhau. Nuôi cấy sơ cấp là phương pháp sử dụng các tế bào được tách từ các mảnh mô và trước lần cấy truyền đầu tiên. Quy trình được tiến hành bắt đầu từ việc thu nhận các mảnh mô. Sau đó các mảnh mô được xử lý để loại bỏ vi khuẩn, nấm và các thành phần không mong muốn khác. Tiếp theo chúng được huyền phù tế bào đơn trước khi nuôi cấy. Nuôi cấy thứ cấp được tiến hành sau khi tế bào được tạo dòng từ nuôi cấy sơ cấp. Các tế bào động vật trong khối mô liên kết chặt chẽ với nhau và với ECM nhờ các cầu nối protein hình thành giữa các tế bào với nhau. Để tách rời các tế bào trong khối mô, người ta thường dùng các enzyme protease như trypsin. Mô là tập hợp tế bào được tổ chức tinh vi và đặc trưng, chúng liên kết thành một khối thống nhất, thông qua các cầu nối gian bào. Tách các tế bào ra khỏi mô cần phải phá bỏ những cầu nối này, nhưng không gây tổn thương cho tế bào. Người ta có thể dùng cơ học hay enzyme cắt. Trong bài báo cáo này, tôi kết hợp cả hai để tăng hiệu quả tách. Vì theo tôi nếu dùng cơ học thì hiệu quả thấp hơn enzyme, nhưng nếu dùng enzyme thì tác dụng của enzyme lên tế bào là rất lớn. Vì vậy, việc kết hợp này để giảm thời gian xử lý bằng enzyme kết hợp với cơ học tăng khả năng tách tế bào. Tổng quan Trong bài báo cáo này, tôi dùng trypsin để tách tế bào từ mô lách chuột. Mô được cắt nhỏ và khuấy từ ở 37oC trong 30 phút với trypsin. Pha loãng và đem nhuộm với trypan blue, quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Dựa trên kết quả trong buồng đếm hồng cầu thì tỉ lệ tế bào sống không cao. Nhưng đây cũng là kết quả bước đầu đạt được, tế bào đơn được tách còn sống và có khả năng nuôi cấy sơ cấp và thao tác được cách nhuộm tế bào sống. Phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. Vật liệu và phương pháp Vật liệu Chuột nhắt trắng Cồn 70o Dung dịch PBS Trypsin-EDTA 0,25% Erlen 250ml, erlen 50ml Becher 50ml Kẹp cong, kẹp thẳng Kéo thẳng, kéo cong. Đĩa Petri đường kính 9-10cm Cá khuấy từ Ống ly tâm loại 10ml Buồng đếm hồng cầu, Lamelle Đầu tip 1ml, đầu tip 0,1ml. Pipetteman. Bình Flask 25 cm2. Khay rác. Kim tiêm 1ml. Phương pháp: Giết chuột và mổ chuột: Đặt chuột lên giá, giết chuột bằng cách kéo giãn đốt sống cổ ( tay phải cầm đuôi chuột, ngón cái và ngón trỏ bàn tay trái kẹp chặt gáy chuột, tay phải kéo 1 lực mạnh về phía sau tới khi nghe tiếng rắc ). Đặt chuột nằm ngửa trên khay sạch ( lưng tiếp xúc với khay). Sát trùng vùng da bụng chuột bằng cồn 70o. Cắt ngang bụng chuột một đường ngắn chừng 1-2 cm, tiến hành kéo hai vùng da hai bên vết cắt về phía hai đầu và đuôi chuột, tiếp tục kéo mạnh để tuột hết lớp da bao phủ hai chân chuột đến gót chân. Thu nhận mô lách: Vị trí lách trong cơ thể: là một cơ quan nằm ở phần trên bên trái trong ổ bụng, tiếp giáp với cơ hoành, tụy, dạ dày và thận trái, được hệ thống dây chằng gắn vào màng bụng. Thu nhận mô lách: mổ mở ổ bụng chuột ra, khi các cơ quan của phần bụng lộ ra, tiến hành cắt bỏ gan, bao tử ta sẽ thu được lách, tiếp đó là loại mỡ và rửa bằng PBS. Cắt thành những khối nhỏ trong PBS. 2.3 Quy trình thu nhận tế bào lách từ mô lách. Chuyển mô vào đĩa Petri có chứa PBS vô trùng và rửa. Chuyển sang đĩa Petri thứ 2, cắt bỏ những phần mô không cần như mô mỡ. Sau khi rửa sạch mẫu, dùng kẹp chuyển mô vào erlen 50ml đã chứa sẵn Trypsin 0,25%, dùng kéo cắt vụn mẫu mô thành những khối 3 mm3. Dùng kẹp bỏ cá từ vào khuấy từ : 200 vòng /phút trong 30 phút, ở 37oC. Thu phần dịch nổi và đem ly tâm với tốc tộ khoảng 1000v/ph trong 10 phút. Sau đó bỏ phần dịch trong bên trên hòa cặn với 1ml PBS. Chuẩn bị giếng để nhuộm trypan blue: hút 50μl Trypan blue vào giếng, sau đó hút 10μl từ giếng 50μl cho vào giếng khác. Hút 40μl dịch tế bào huyền phù cho vào giếng nhuộm 10μl trypan blue. Huyền phù sau đó hút 5μl dịch nhuộm cho vào buồng đếm hồng cầu. Đếm số lượng tế bào sống và số lượng tế bào chết trong 25 ô. Tế bào sống là tế bào sau khi nhuộm nhìn dưới kính hiển vi chiết quang không màu, còn tế bào chết là những tế bào ăn màu xanh đen đậm. Thao tác cho mẫu vào buồng đếm hồng cầu: Buồng đếm được làm sạch và sấy khô. Đậy lamelle lên 2 khu vực có kẻ ô đếm. Đưa buồng đếm lên kính hiển vi, dùng thị kính 10 và vật kính 10 điều chỉnh để tìm ô đếm. Đặt buồng đếm lên mặt phẳng, dùng pipet man hút 5μl cho vào buồng đếm, dung dịch sẽ theo mao dẫn lan khắp ô đếm. Để yên buồng đếm 1 phút để tế bào lắng xuống nhưng không nên để mẫu bị khô, sau đó đưa lên khí hiển vi đếm với vật kính 40. Trên buồng đếm Neubauer: Đúng ra phải đếm 5 ô trung bình( 4 ô ở 4 góc và 1 ô ở giữa). Trong mỗi ô trung bình đếm cả 16 ô nhỏ.Trong mỗi ô nhỏ , đếm tất cả những tế bào nằm gọn trong ô, cạnh trên và cạnh trái. Như vậy, biết được số tế bào trong 80 ô nhỏ(mỗi ô là 1/400mm2 ) Công thức tính là: A là tổng số tế bào đếm được trong 80 ô nhỏ thì số tế bào trong buồng đếm là A*4000*100 Số tb trong 1mm3=---------------------------=A*5000 5*16 4000=400*10(1/400mm2:diện tích một ô nhỏ; 1/10mm:chiều cao từu mặt buồng đếm đến lamelle) 100:độ pha loãng. Nhưng ở tế bào lách của tôi quá ít nên tôi đếm 25 ô thay vì 5 ô trung bình vậy công thức của tôi là A*4000*100 Số tb trong 1mm3=---------------------------=A*1000 25*16 A là tổng số tế bào đếm được trong 400 ô nhỏ thì số tế bào trong buồng đếm. 3.Kết quả: -Số tế bào Sống A=25 A*4000*100 Số tb sống trong 1mm3=---------------------------=A*1000=25.000 25*16 -Số tb chết A=22 A*4000*100 Số tb chết trong 1mm3=---------------------------=A*1000=22.000 25*16 4.Kết Luận Số lượng tế bào sống quá ít không đủ để nuôi cấy(<106tb), có thể giải thích như sau: +Do yếu tố khác quan: do máy li tâm không đúng nên tế bào không lắng xuống hết,vì vậy khi loại bỏ dịch nổi là bỏ luôn tế bào, nồng độ trypsin không phù hợp, do quá trình làm phải chờ đợi dụng cụ, máy khuấy cá từ phải dùng một lúc nhiều mẫu nên quay không đều, nhiều lần đổi máy khuấy cá từ.Do đó khi loại bỏ cặn thu dịch nổi thì đã loại bỏ luôn tế bào vì hiệu quả phân cắt của trypsin không cao. Quá trình chờ pipet man nên khô mẫu. +Do yếu tố chủ quan: Lúc rửa mô để nô quá khô, sau khi li tâm tách cặn chậm dẫn một phần cặn tái hòa tan, có khả năng lấy nhầm thuốc nhuộm đã pha loãng mẫu, quá trình đếm 25 ô không tránh khỏi thiếu sót. Mặt dù vậy, nhưng bước đầu nhóm chúng tôi đã tách được những tế bào đơn từ mô lách, có khả năng thực hiện độc lập quy trình trupsin ấm cũng như tính toán dđược kết quả số lượng tế bào thu được qua buồng đếm hồng cầu và nhuộm tế bào sống bằng thuốc nhuộm trypan blue.