Tách dòng gen ZmNAC1 từ mẫu ngô địa phương Vị Xuyên – Hà Giang, Việt Nam

Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 63 - 68 63 TÁCH DÒNG GEN ZmNAC1 TỪ MẪU NGÔ ĐỊA PHƯƠNG VỊ XUYÊN –HÀ GIANG, VIỆT NAM Nguyễn Vũ Thanh Thanh1*, Nguyễn Văn Tường1, Phạm Thanh Tùng2, Lê Văn Sơn2, Chu Hoàng Mậu3 1 Trường Đại học Khoa học- ĐH Thái Nguyên; 2Viện Công nghệ sinh học 3 Trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Nhân tố phiên mã NAC (bắt nguồn từ ba chữ NAM-no apical meristem, ATAF-Arabidopsis transcription activation factor, CUC-cup-shaped cotyledon) là một họ protein có chức năng rất đa dạng, giữ vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, điều chỉnh nội tiết tố và phản ứng với những áp lực khác nhau, quá trình lão hóa, phát triển hình thái, con đường truyền tín hiệu và có thể đóng vai trò quan trọng trong con đường kháng các yếu tố sinh học và phi sinh học. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã thiết kế cặp mồi NACZm-F/NACZm-R, khuếch đại, tách dòng thành công và xác định trình tự nucleotide của gen ZmNAC1 từ DNA hệ gen mẫu ngô địa phương VX (Hà Giang). Gen ZmNAC1 có kích thước là 1035 bp, vùng mã hoá gồm 939 bp mã hoá 312 amino acid. Gen ZmNAC1 có 2 exon và 1 intron; exon 1 có kích thước 471 bp, exon 2 - 468 bp, intron có 96 bp. Gen ZmNAC1 của mẫu ngô VX xuất hiện 6 vị trí nucleotide thiếu hụt ở vùng intron (487, 556, 557, 558, 559, 560) và protein suy diễn có vị trí amino acid 181 sai khác so với protein NAC1 trên GenBank (mã số ACF33136). Trình tự gen ZmNAC1 thu được là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu đặc điểm của gen ZmNAC1 và mối liên quan giữa sự thay đổi trong cấu trúc gen ZmNAC1 với đặc tính chịu hạn ở cây ngô. Từ khoá: chịu hạn, gen NAC1, ngô địa phương, nhân tố phiên mã, tách dòng. MỞ ĐẦU* Stress phi sinh học như hạn hán và độ mặn cao ảnh hưởng xấu đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của thực vật. Trong những năm gần đây, nhiều tiến bộ đã được thực hiện theo hướng xác định tiềm năng các gen liên quan đến khả năng tăng sức chịu đựng của thực vật đối với các stress phi sinh học từ môi trường. Nhân tố phiên mã NAC là một họ protein có chức năng rất đa dạng, giữ vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, quá trình lão hóa, phát triển hình thái, con đường truyền tín hiệu, điều chỉnh nội tiết tố và phản ứng với những tác động khác nhau từ ngoại cảnh [2], [4], [5]. Nhân tố phiên mã NAC có một loạt các chức năng quan trọng không chỉ trong sự phát triển thực vật mà còn trong phản ứng với các stress phi sinh học. Gen NAC đã được chứng minh có liên quan đến tính chống chịu stress phi sinh học [6]. Kết quả nghiên cứu của Liu và đtg (2009) cũng chi ra rằng gen * Tel: 0912664126 NAC1 có vai trò quan trọng trong phản ứng với các stress từ ngoại cảnh, tăng cường khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi sinh học và phi sinh học [4]. Nghiên cứu của Lu và đtg (2012) cho kết quả gen ZmNAC được cảm ứng mạnh mẽ bởi nhiệt độ thấp, độ mặn cao, khô hạn, và axit abscisic (ABA) [5]. Các nghiên cứu vai trò của gen NAC còn xem xét ở khía cạnh nhận và truyền tín hiệu các yếu tố môi trường để thực hiện chức năng hoạt hóa quá trình phiên mã [1]. Những kết quả nghiên cứu của các tác giả cũng đã chỉ ra rằng protein NAC1 có chức năng hoạt hoá quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn trong môi trường thiếu nước cực đoan và có thể ứng dụng nhằm cải thiện tính chịu hạn của thực vật và cây ngô bằng kỹ thuật chuyển gen [5], [6]. Các thảo luận về vai trò và mục tiêu sử dụng các protein NAC trong chiến lược cải tiến giống cây trồng thông qua sự can thiệp của công nghệ sinh học đang là vấn đề mang tính thời sự [8], [10]. Có hai xu hướng tìm kiếm gen liên quan đến tính chống chịu của cây trồng đối với các yếu tố ngoại cảnh bất lợi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 63 - 68 64 phi sinh học (1) gen liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn, chịu nhiệt, chịu mặn và (2) gen tổng hợp sản phẩm protein có vai trò điều khiển quá trình phiên mã. Gen NAC là họ gen trong nhóm gen điều hoà hoạt động phiên mã của nhóm gen chống chịu. Trong nghiên cứu này chúng tôi trình bày kết quả tách dòng và phân tích trình tự gen ZmNAC1 phân lập từ mẫu ngô địa phương Vị Xuyên - Hà Giang, Việt Nam. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Mẫu ngô địa phương Vị Xuyên, Hà Giang (VX) do nhóm nghiên cứu sưu tập tại Vị Xuyên - Hà Giang, có hạt trắng ngà, hạt dẹt và dài, khối lượng 100 hạt là 29,56 ± 0,26 (g), hàm lượng protein 10,05 ± 0,045 (%), hàm lượng lipid là 4,39 ± 0,062 (%). Phương pháp Tách chiết DNA tổng số từ lá ngô trong đệm 2% CTAB, 100mM Tris HCl, 1,4M NaCl, 20mM EDTA, 2% PVP, 0,01% 2- mercaptoethanol. Gen ZmNAC1 được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi NACZm- F/NACZm-R được thiết kế dựa trên trình tự gen được công bố trên GenBank có mã số EU810024 [3]. Cặp mồi nhân gen ZmNAC1 có trình từ nucleotide là: NACZm-F: 5’GGGATCCATGGGTCTGCCGATGAGGA3’ NACZm-R: 5’GAGCTCTCAGAACTGTCCCAACCCG3’ Thành phần phản ứng PCR nhân gen ZmNAC1 trong thể tích 25µl, gồm: 12,5µl GoTaq® Green Master Mix 2X; 1,0µl NACZm-F (10pM/µl), 1,0 NACZm-R (10pM/µl); 1,0µl DNA tổng số; 9,5µl H2O. Tách dòng gen được thực hiện theo phương pháp của Sambrook và Russell (2001) [9]. Trình tự gen ZmNAC1 được xác định trên thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem) tại Viện công nghệ sinh học. Kết quả đọc trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách dòng gen ZmNAC1 từ DNA hệ gen cây ngô Lá ngô non được sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Kiểm tra chất lượng tách chiết DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% và xác định hàm lượng DNA trên máy quang phổ ở bước sóng 260nm. Kết quả cho thấy DNA tổng số tách chiết được có hàm lượng và độ tinh sạch đảm bảo và có thể sử dụng cho các thí nghiệm phân tích DNA tiếp theo. Sử dụng DNA tổng số để nhân gen ZmNAC1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NACZm-F/NACZm-R, kết quả thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 1100bp (Hình 1A). A B Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen ZmNAC1 (A) và sản phẩm colony-PCR chọn dòng vi khuẩn tái tổ hợp M: Thang DNA 1kb; VX: Đoạn DNA nhân bản từ DNA hệ gen của mẫu ngô VX; 1, 2, 3, 4, 5, 6: Các dòng khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp M 1 2 3 4 5 6 1300bp 1000bp 500bp ∼ 1100bp VX M Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 63 - 68 65 Hình 2. So sánh trình tự gen ZmNAC1 (EU810024: Trình tự gen ZmNAC1 trên GenBank mã số EU810024; VX: Trình tự gen ZmNAC1 phân lập từ DNA hệ gen mẫu ngô địa phương Vị Xuyên-Hà Giang) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 63 - 68 66 Hình 3. Trình tự protein NAC1 (ACF33136: Trình tự amino acid của protein NAC1 trên GenBank mã số ACF33136; NAC1-VX: Trình tự amino acid của protein NAC1 suy diễn từ gen ZmNAC1 phân lập mẫu ngô địa phương Vị Xuyên-Hà Giang) Sản phẩm PCR được làm sạch bằng kỹ thuật thôi gel (theo KIT GeneJET Gel Extraction của hãng Thermo) và được gắn vào vector tách dòng pBT tạo vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp mang gen ZmNAC1 được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α và để khẳng định chắc chắn đoạn gen ZmNAC1 có mặt trong các dòng khuẩn lạc màu trắng thu được, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) với cặp mồi M13. Sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc được điện di trên gel agarose 0,8%, kết quả cho thấy cả 6 dòng khuẩn lạc đều cho kết quả dương tính với phản ứng PCR và kích thước nhân lên theo đúng tính toán lý thuyết đoạn gen dài khoảng 1300bp (Hình 1B). Các dòng khuẩn lạc sau khi được chọn lọc bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc, được nuôi trong môi tường LB lỏng để tách chiết plasmid phục vụ giải trình tự gen. Xác định trình tự nucleotide của gen ZmNAC1 Sau khi xác định trình tự nucleotide của gen ZmNAC1, dữ liệu gen được xử lí bằng phần mềm BioEdit và so sánh với trình tự gen NAC1 công bố trên GenBank có mã số EU810024, kết quả dược trình bày ở Hình 2. Kết quả giải trình tự gen ZmNAC1 và so sánh với trình tự gen ZmNAC1 có mã số trên GenBank EU810024 ở Hình 2 cho thấy gen ZmNAC1 phân lập từ mẫu ngô VX có kích thước 1035bp. Gen ZmNAC1 phân lập từ mẫu ngô VX có 2 exon và 1 intron, exon 1 dài 471 bp và exon 2 dài 468 bp; intron dài 96 bp (từ vị trí 472 đến 567). So với trình tự gen NAC1 có mã số trên GenBank EU810024 từ vị trí mã mở đầu đến mã kết thúc, thì gen ZmNAC1 của mẫu VX thiếu hụt 6 bp ở vị trí 487 và từ 556
560. Tuy nhiên sự thiếu hụt 6 nucleotide này đều thuộc vùng intron nên không ảnh hưởng đến trình tự amino acid. Các vị trí nucleotide có sự thay đổi là: T
C (vị trí 342), C
T (vị trí 479 ), A
G (vị trí 480), C
A (vị trí 502), G
C (vị trí 505), A
G (vị trí 552), C
T (vị trí 606), A
G (vị trí 643). Vùng mã hóa của gen có kích thước 939 bp mã hoá cho 312 amino acid và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 63 - 68 67 kết quả so sánh amino acid suy diễn của gen ZmNAC1 được thể hiện ở Hình 3. Hình 3 cho thấy trình tự amino acid của protein NAC1 suy diễn từ gen ZmNAC1 phân lập mẫu ngô địa phương Vị Xuyên-Hà Giang có độ tương đồng cao so với protein NAC1 có mã số ACF33136 trên GenBank (chỉ khác một amino acid ở vị trí 181) với độ tương đồng của 2 mẫu so sánh là 99,68%. KẾT LUẬN Đã thiết kế cặp mồi NACZm-F/NACZm-R, khuếch đại, tách dòng thành công và xác định trình tự nucleotide của gen ZmNAC1 từ DNA hệ gen mẫu ngô địa phương VX (Hà Giang). Gen ZmNAC1 phân lập được có kích thước là 1035bp, vùng mã hoá có kích thước 939bp mã hoá cho 312 amino acid. Gen ZmNAC1 phân lập từ mẫu ngô VX có 2 exon và 1 intron, exon 1 dài 471 bp và exon 2 dài 468 bp; intron dài 96 bp. Gen ZmNAC1 của mẫu VX có 6 vị trí nucleotide thiếu hụt ở vùng intron (487, 556, 557, 558, 559, 560) và protein suy diễn có sự sai khác ở một vị trí amino acid (vị trí 181) so với trình tự protein NAC1 có mã số ACF33136 trên GenBank. Trình tự gen ZmNAC1 là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu đặc điểm của gen ZmNAC1 và mối liên quan giữa sự thay đổi trong cấu trúc gen ZmNAC1 với đặc tính chịu hạn ở cây ngô. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Golldack D, Lüking I, Yang O (2011). Plant tolerance to drought and salinity: stress regulating transcription factors and their functional significance in the cellular transcriptional network. Plant Cell Rep., 30(8):1383-91. [2]. Hao YJ, Song QX, Chen HW, Zou HF, Wei W, Kang XS, Ma B, Zhang WK, Zhang JS, Chen SY (2010). Plant NAC-type transcription factor proteins contain a NARD domain for repression of transcriptional activation. Planta., 232(5):1033-1043. [3]. Kumar,M., Dalal,M., Zaidi,P.H., Chinnusamy,V. and Bansal,K.C. (2008). Cloning and functional validation of abiotic stress inducible NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor from maize inbred lines differing in drought resistance. [4]. Liu ZJ, Shao FX, Tang GY, Shan L, Bi YP (2009). Cloning and characterization of a transcription factor ZmNAC1 in maize (Zea mays)]. Yi Chuan., 31(2):199-205. [5]. Lu M, Ying S, Zhang DF, Shi YS, Song YC, Wang TY, Li Y (2012). A maize stress-responsive NAC transcription factor, ZmSNAC1, confers enhanced tolerance to dehydration in transgenic Arabidopsis. Plant Cell Rep. 31(9):1701-1711. [6]. Nakashima K, Takasaki H, Mizoi J, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2012). NAC transcription factors in plant abiotic stress responses. Biochim Biophys Acta., 1819(2):97-103. [7]. Olsen AN, Ernst HA, Leggio LL, Skriver K (2005). NAC transcription factors: structurally distinct, functionally diverse. Trends Plant Sci., 10(2):79-87. [8]. Puranik S, Sahu PP, Srivastava PS, Prasad M (2012). NAC proteins: regulation and role in stress tolerance. Trends Plant Sci., 17(6):369-81. [9]. Sambrook J. và Russell D.W., (2001). Molecular Cloning. A Laboratory Manual 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. [10]. Tran LS, Nishiyama R, Yamaguchi- Shinozaki K, Shinozaki K (2010). Potential utilization of NAC transcription factors to enhance abiotic stress tolerance in plants by biotechnological approach. GM Crops., 1(1):32-9. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 107(07): 63 - 68 68 SUMMARY CLONING OF ZmNAC1 ISOLATED LOCAL CORN CULTIVAR IN VI XUYEN, HA GIANG, VIETNAM Nguyen Vu Thanh Thanh1*, Nguyen Van Tuong1, Pham Thanh Tung2, Le Van Son2, Chu Hoang Mau3 1 College of Sciences – TNU, 2Institute of Biotechnology 3 College of Education - TNU NAC transcription factors are a family of functionally diverse proteins. They are unique to plants and play an important role in regulation of plant growth and development, hormone regulation and responses to various stresses, the aging process, morphological development, signal transduction pathways and may play important roles in biotic and abiotic resistance pathways. In this study we have amplified, cloned successfully and identified nucleotide sequencing of ZmNAC1 gene from DNA genome of local VX corn cultivar (Ha Giang). Sequence analysis showed that ZmNAC1 gene is 1,035bp long, coding region of ZmNAC1 gene is 939bp size, encoding for 312 amino acids. ZmNAC1 gene have 2 exons and 1 intron; exon 1 is 471 bp size, exon 2 - 468 bp and intron is 96bp size. Comparison with NAC1 gene on GenBank (code number: EU810024), ZmNAC1 gene of cultivar VX appeared 6 different nucleotide positions at intron (487, 556, 557, 558, 559, 560) and position 181 of deductive amino acid sequence. ZmNAC1 sequencing is the basis for continue to study on characteristics of ZmNAC1 gene and relation between changes in the structure of ZmNAC1 gene with drought tolerance of maize. Key words: drought tolerance, NAC1 gene, local corn, transcription factors, cloning Ngày nhận bài: 20/6/2013; Ngày phản biện:16/8/2013; Ngày duyệt đăng: 10/9/2013 Phản biện khoa học: TS. Hoàng Thị Thu Yến - Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên * Tel: 0912664126 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên