So sánh trình tự gen gmexp1 liên quan đến sự kéo dài rễ phân lập từ MRNA của hai mẫu đậu tương địa phương Bắc Kạn và Vĩnh Phúc - Nguyễn Vũ Thanh Thanh

Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 118(04): 129 - 134 129 SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ KÉO DÀI RỄ PHÂN LẬP TỪ mRNA CỦA HAI MẪU ĐẬU TƢƠNG ĐỊA PHƢƠNG BẮC KẠN VÀ VĨNH PHÖC Nguyễn Vũ Thanh Thanh1, Bùi Thị Doan1, Lò Thanh Sơn2, Chu Hoàng Mậu3 1Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên; 2Trường Đại học Tây Bắc; 3Trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Expansin là một họ protein có chức năng làm giãn thành tế bào ở thực vật và đƣợc coi là loại protein chủ yếu có vai trò quan trọng trong pha giãn thành tế bào ở miền sinh trƣởng của hệ rễ cây đậu tƣơng. Hai vùng chức năng DPBB (Double Psi Beta Barrel) và Pollen allerg xác định cho protein expansin có khả năng tác động phá vỡ liên kết phi hoá trị giữa polysaccharide với vi sợi cellulose giúp thành tế bào dễ dàng giãn nở theo cả chiều ngang và chiều dọc dƣới tác động của sức trƣơng nƣớc. GmEXP1 là gen expansin đầu tiên đƣợc xác định ở rễ cây đậu tƣơng, hoạt động của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ cây đậu tƣơng, giúp tăng cƣờng khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập, tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen GmEXP1 từ mRNA của hai giống đậu tƣơng địa phƣơng Bắc Kạn (BK) và Vĩnh Phúc (VP). Gen GmEXP1 phân lập đƣợc có kích thƣớc 768 bp, mã hoá 255 amino acid. Trình tự amino acid suy diễn của protein expansin ở 2 mẫu nghiên cứu có độ tƣơng đồng là 99,2% so với trình tự amino acid của expansin có mã số AF516879 trên GenBank. Gen GmEXP1 đã phân lập có thể sử dụng để thiết kế vector chuyển gen nhằm kéo dài rễ giúp cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng. Từ khoá: Expansin, Glycine max,GmEXP1, kéo dài rễ, giãn thành tế bào. MỞ ĐẦU* Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng cạn ngắn ngày có vai trò quan trọng đối với con ngƣời trong nhiều lĩnh vực nhƣ: cung cấp dinh dƣỡng, làm thực phẩm cho con ngƣời, làm thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu, là cây cải tạo đất tốt. Cây đậu tƣơng mang giá trị kinh tế rất cao và phù hợp với nhiều địa phƣơng, đặc biệt là các tỉnh miền núi phía Bắc [2]. Theo số liệu thống kê của các tỉnh miền Bắc cho thấy, diện tích trồng cây đậu tƣơng đang giảm dần theo từng năm. Một trong những nguyên nhân chính là do năng suất cây đậu tƣơng thấp hơn nhiều so với các loại cây trồng khác khiến ngƣời dân không muốn trồng loại cây này. Bên cạnh những yếu tố kỹ thuật canh tác chƣa cao, ảnh hƣởng của sâu bệnh thì yếu tố hạn hán, không chủ động đƣợc nguồn nƣớc trong quá trình canh tác đậu tƣơng là một trong những nguyên nhân chính làm cho năng suất và sản lƣợng đậu tƣơng của nƣớc ta còn thấp. * Tel:0912664126; Email:thanhthanhdhkhtn@gmail.com Hạn hán đang là một trong những vấn đề ảnh hƣởng nghiêm trọng đến tình hình sản xuất đậu tƣơng không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Chính vì vậy, nghiên cứu tạo giống đậu tƣơng chất lƣợng, có gen chịu hạn tốt, có khả năng sống trong điều kiện bất lợi về nƣớc là yêu cầu của thực tiễn đã và đang là hƣớng nghiên cứu rất đƣợc quan tâm của các nhà chọn giống [7]. Hai cơ chế chủ yếu liên quan đến khả năng chịu hạn của thực vật là sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu và sự phát triển mạnh của bộ rễ. Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nƣớc cung cấp cho hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Ở cây đậu tƣơng sự thích nghi với các điều kiện hạn hán chủ yếu thông qua việc phát triển rễ trụ để có thể tìm kiếm các nguồn nƣớc từ các lớp đất sâu. Theo Lee và đồng tác giả (2011), cơ chế chịu hạn liên quan mật thiết với sự phát triển của bộ rễ [5]. Cơ thể thực vật thích ứng với hạn bằng cách phát triển rễ cọc theo chiều dài vƣơn tới các lớp đất sâu hơn để Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 118(04): 129 - 134 130 hút nƣớc dễ dàng hơn, đồng thời hệ thống rễ con phát triển mở rộng theo bề ngang có thể thích ứng tốt với việc tìm kiếm dinh dƣỡng khoáng và nƣớc trong lòng đất [3]. Hạn chế về nƣớc ở cây đậu tƣơng thƣờng làm tăng sinh khối của rễ, từ đó làm tăng tỉ lệ rễ/thân. Kasper và đồng tác giả (1984) khi đánh giá 105 giống đậu tƣơng khác nhau trong điều kiện khô hạn cho thấy tỉ lệ kéo dài rễ trụ khác nhau giữa các giống vào khoảng 1,3 cm/ngày [4]. Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy đậu tƣơng không đƣợc tƣới nƣớc thì bộ rễ có chiều dài hơn hẳn ở cây đậu tƣơng đƣợc tƣới nƣớc, ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy mối tƣơng quan chặt chẽ đối với nhiều tính trạng rễ nhƣ trọng lƣợng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lƣợng rễ con ở các giống chịu hạn. Các tính trạng này thƣờng đƣợc dùng nhƣ các chỉ tiêu quan trọng để đánh giá và nhận dạng các giống đậu tƣơng có tính chịu hạn [4]. Nhƣ vậy, để tránh mất nƣớc những cây đậu tƣơng chịu hạn thƣờng có bộ rễ khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu sẽ hút đƣợc nƣớc ở những nơi sâu trong đất. Thực vậ ậu tƣơng nói riêng khi ở giai đoạn cây non thƣờng chịu tác động mạnh của hạn vì bộ rễ chƣa phát triển đầy đủ và còn yếu. Expansin là một họ protein tác động trong việc kéo giãn của thành tế bào thực vật và đƣợc coi là một protein chủ yếu ảnh hƣởng đến sự mở rộng của tế bào thực vật. Expansin đƣợc chia thành ba phân họ α, β và γ-expansin dựa trên mối quan hệ nguồn gốc của chúng [6]. Lee và đồng tác giả (2003) đã nghiên cứu phân lập gen expansin (GmEXP1) từ mRNA của cây đậu tƣơng với kích thƣớc 1089 bp liên quan đến việc kéo dài rễ của cây đậu tƣơng. Khi phân tích RNA bằng Northern blot cho thấy rằng gen GmEXP1 đƣợc biểu hiện mạnh ở rễ, đặc biệt khi quá trình hình thành các rễ chính và rễ phụ, mức độ biểu hiện của gen GmEXP1 rất mạnh trong khoảng thời gian hạt nảy mầm từ 1 ngày đến 5 ngày tuổi và giai đoạn kéo dài của rễ [5]. Biểu hiện của gen GmEXP1 làm tăng sự phát triển cả rễ chính, cả rễ bên. Các kết quả nghiên cứu cho thấy gen GmEXP1 đóng một vai trò quan trọng trong việc phát triển rễ của nhiều thực vật nhƣ đậu tƣơng, cà chua, Arabidopsis, ... [1]. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nhân bản, tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen GmEXP1 (cDNA) nhằm thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 phục vụ mục đích cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Nguyên liệu Sử dụng hai mẫu đậu tƣơng địa phƣơng thu thập ở tỉnh Bắc Kạn (BK) và tỉnh Vĩnh Phúc (VP). Trình tự nucleotide cặp mồi đặc hiệ GmEXP1 đƣợc trình bày trong Bảng 1. Phƣơng pháp RNA tổng số đƣợc tách chiết bằng Trizol Reagent KIT; cDNA đƣợc tổng hợp theo quy trình Maxima® First Strand cDNA Synthesis KIT; gen GmEXP1 đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo chu kỳ nhiệt: 940C/4 phút - (940C/45 giây - 560C/30 giây - 72 0 C/60 giây) 30 - 72 0 C/10 phút. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%; tinh sạch sản phẩm PCR theo GeneJET PCR Purification KIT và gắn vào vector tách dòng p ến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng sốc nhiệt (42 0 C trong 1 phút 30 giây). Vi khuẩn mang vector tái tổ hợp đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng LB đặc bổ sung X-gal, IPTG, kháng sinh carbenicilin. Plasmid tái tổ hợp đƣợc thu nhận bằng cách tách chiết theo phƣơng pháp tách dòng phân tử và cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI. Trình tự gen đƣợc xác định bằ ải trình tự gen tự động ABI Prism 3130 - USA/Japan. Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm BioEdit, DNAStar. Bảng 1. Trình tự cặp mồi đặc hiệu nhân gen GmEXP1 Ký hiệu Trình tự mồi (5’ - 3’) Nhiệt độ gắn mồi SoyExpF CATGCCATGGATGGGCAAAATCATGCTTGT 56 0 C SoyExpR ATTTGCGGCCGCTTAGAACTGAACTGGGCTAGA 56 0 C Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 118(04): 129 - 134 131 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập gen GmEXP1 Dựa trên kết quả nghiên cứu của Lee và đồng tác giả (2011) cho rằng mRNA của gen GmEXP1 có mặt nhiều trong rễ mầm 3 - 5 ngày tuổi [5] chúng tôi đã tiến hành tách chiết RNA tổng số từ vùng sinh trƣởng của rễ đậu tƣơng. RNA tổng số sau khi tách đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng phiên mã ngƣợc tạo cDNA với mồi ngẫu nhiên (random hexamer primer). Phản ứng PCR nhân bản gen GmEXP1 đƣợc thực hiện bằng cặp mồi SoyExpF/SoyExpR, kiểm tra sản phẩ ện di trên gel agarose (Hình 1). Kết quả thu đƣợc ở hình 1 cho thấy cả 2 mẫu BK và VP đều cho sản phẩm PCR với kích thƣớc khoảng 770 bp, kích thƣớc này phù hợ tính toán lý thuyết và tƣơng ứng với kích thƣớc của gen GmEXP1 ở giống đậu tƣơng mang mã số AF516879 công bố trong Ngân hàng gen NCBI. Để đảm bảo cho phản ứng ghép nối gen vào vector tạo dòng đƣợc chính xác và đạt hiệu quả cao, chúng tôi tiếp tục tinh sạch sản phẩm RT-PCR rồi gắn vào vector tách dòng pBT. Sản phẩm vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α khả biến. Sau khi tách plasmid tái tổ hợp từ sinh khối vi khuẩn, chúng tôi thực hiện kiểm tra sự có mặt của gen GmEXP1 bằng enzyme giới hạn BamHI. Kết quả điện di kiểm tra đƣợc thể hiện ở hình 2. Theo tính toán lý thuyết, vector pBT có kích thƣớc 2700 bp, sản phẩm PCR gen đích khoảng 770 bp thì plasmid tái tổ hợp có kích thƣớc khoảng 3500 bp. Kết quả điện di kiể 2 cho thấy, các dòng khuẩn lạc trắng dƣơng tính với colony-PCR đều mang plasmid tái tổ hợp (pBT-GmEXP1). Các plasmid tái tổ hợp đƣợc sử dụng để xác định trình tự nucleotide. Phân tích trình tự gen GmEXP1 Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen GmEXP1 phân lập từ 2 mẫu giống đậu tƣơng nghiên cứ 3 cho thấy 2 trình tự gen thu đƣợc đều có độ tƣơng đồng cao, đều có kích thƣớc 768 bp và chỉ có 1 vị trí nucleotide sai khác, tại vị trí 634 của giống BK là guanine, còn của giống VP là thymine (Bảng 2). . Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen GmEXP1 của hai mẫu đậu tương nghiên cứu (M. marker 1kb; 1 – BK, 2 – VP) Hình 2. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng BamHI (M - DNA maker 1kb, 1 - BK, 2 - VP) Bảng 2. Kết quả so sánh trình tự gen GmEXP1 của 2 mẫu đậu tương nghiên cứu và AF516879 Vị trí BK VP AF516879 93 T T C 634 G T T 722 C C T 1 kb 770 bp 0,75 kb M 1 2 1000 bp 770 bp M 1 2 Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 118(04): 129 - 134 132 Hình 3. Kết quả so sánh trình tự gen GmEXP1 của các hai mẫu đậu tương nghiên cứu và AF516879 trên GenBank Khi so sánh trình tự gen của 2 mẫu nghiên cứu với trình tự GmEXP1 công bố trên GenBank có mã số AF516879 cho thấy có 3 vị trí sai khác (93, 634 và 722) thể hiện ở bảng 2. Ở vị trí 93, 2 mẫu nghiên cứu đều là Thymine, mẫu trên Ngân hàng gen AF516879 là Cytosine. Ở vị trí 634, mẫu VP và AF516879 đều là Thymine còn mẫu BK là Guanine. Còn ở vị trí 722, hai mẫu nghiên cứu đều là Cytosine, còn mẫu trên Ngân hàng gen AF516879 lại là Thymine. Vì vậy, mức độ tƣơng đồng của 3 mẫu có sự khác biệt. Mẫu BK tƣơng đồng với mẫu VP là 99,8%, mẫu BK tƣơng đồng với mẫu AF516879 là 99,6%, còn mẫu VP tƣơng đồng với AF516879 là 99,7%. Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 118(04): 129 - 134 133 ự amino ễ 4. Hình 4. Trình tự amino acid suy diễn của protein expansin ở hai mẫu nghiên cứu và AF516879 trên GenBank Kết quả so sánh amino acid suy diễn của 2 mẫu nghiên cứu và mẫ 4) cho thấy, trình tự chuỗi polypeptide đều dài 255 amino acid và có sự ị trí amino acid 212 và 241. Ở vị trí 212, mẫu nghiên cứu BK là Alanine, còn mẫu trên Ngân hàng gen AF516879 và mẫu nghiên cứu VP là Serine. Ở vị trí 241, mẫu nghiên cứu BK là Valanine còn mẫu trên ngân hàng gen AF516879 và mẫu nghiên cứu VP là Alanine (Bảng 3). Trình tự amino acid suy diễn của protein expansin ở 2 mẫu nghiên cứu có độ tƣơng đồng là 99,6% và tƣơng đồng 99,2% so với trình tự amino acid của expansin có mã số AF516879 trên GenBank (Bảng 4). Trình tự gen GmEXP1 đã phân lập có thể đƣợc sử dụng để thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 nhằm kéo dài rễ để góp phần cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng. Bảng 4. Mức độ tương đồ acid của 2 mẫu nghiên cứu và AF516879 (%) AF516879 BK VP AF579168 100 99,2 99,6 BK 100 99,6 VP 100 KẾT LUẬN Gen GmEXP1 phân lập từ mRNA của hai mẫu giống đậu tƣơng địa phƣơng Bắc Kạn (BK) và Vĩnh Phúc (VP) có kích thƣớc là 768 bp, xác định chuỗi polypeptide dài 255 amino acid. Trình tự amino acid của protein expansin ở mẫu giống đậu tƣơng VP có độ tƣơng đồng 99,6% so giống đậu tƣơng BK, và tƣơng đồng 99,2% so với trình tự có mã số AF516879 trên GenBank. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cosgrove DJ (2000) Loosening of plant cell walls by expansins. Nature 407: 321 - 326. 2. Trần Văn Điền (2007) Giáo trình cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp, 6 – 13. 3. Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cƣờng, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2008). Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen P5CS của một giống đậu tƣơng. Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(4), tr: 459 - 466. 4. Kaspar TC, Taylor HM and Shibles RM (1984) Taproot elongation rates of Soybean cultivars in the glasshouse and their relation to field rooting depth. Crop Sci 24: 916-920. 5. Lee DK, Ahn JH, Song SK, Choi YD, Lee JS (2003) Expression of an Expansin gene is Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 118(04): 129 - 134 134 correlated with root elongation in soybean. Plant Physiol 131: 985 - 977. 6.Li Y, Darley CP, Ongaro V, Fleming A, Schippe r O, Baldauf SL,McQueen-Mason SJ (2002) Plant expansins are a complex multigene family with an ancient evolutionary origin, Plant Physiol, 128: 854–864. 7. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2011) Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. SUMMARY COMPARISION OF GENE ENCODING EXPANSIN RELATED TO ELONGATION OF ROOTS ISOLATED FROM mRNA OF LOCAL SOYBEAN CULTIVARS BAC KAN AND VINH PHUC Nguyen Vu Thanh Thanh 1* , Bui Thi Doan 1 , Lo Thanh Son 2 , Chu Hoang Mau 3 1 College of Science - TNU 2Tay Bac University; 3 College of Education - TNU Expansin is a family of proteins that function expansion cell walls plants and has been considered a major protein plays an important role in expansion of cell wall at growing domain in soybean roots. Two functional regions (DPBB and Pollen allerg) of expansin having capable of breaking effects associated with non-chemotherapy between polysaccharide and cellulose microfiber, helps to easily expanded cell wall (both horizontally and vertically) with impacts of water erection. GmEXP1 is the first genes identified in soybean roots, activity of GmEXP1 genes is related to expansion and prolongation of soybean roots, enhancing drought tolerance of soybean cultivars. In this paper, we present the results of amplification, cloning and determination of the GmEXP1 sequence from Bac Kan (BK), Vinh Phuc (VP) local soybean cultivars. The coding region of GmEXP1 gene isolated from these soybean cultivars is 768 nucleotides in length, encoding 255 amino acids. Comparative alignment of expansin amino acid sequence between four soybean cultivars of this study and that of expansin (GenBank: AF516879) showed that similarity coefficient is 99,2%. As results, cDNA sequences of GmEXP1 genes would be a genetic source used to design vector in transgenic technique to improve drought tolerance of soybean plants. Key words: Cell wall expansion, expansin, Glycine max, GmEXP1, elongation of roots. Ngày nhận bài:13/3/2014; Ngày phản biện:17/3/2014; Ngày duyệt đăng: 25/3/2014 Phản biện khoa học: TS. Nguyễn Thị Hải Yến – Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên * Tel:0912664126; Email:thanhthanhdhkhtn@gmail.com