Sinh học phân tử Southern blot

LOGOwww.themegallery.com Southern blot Sinh học phân tử Thực hiện:  Đỗ Đức Anh ­ Ng.Thị Điểm ­ Ng.Phan Thị Hoàng Kim ­ Hồng Vĩnh Thành ­ Mai Hoàng Yến www.themegall ery.com LOGO N i dung seminarộ I II 3 Giới thiệu về phương pháp  Southern Blot Lai phân tử III Southern blot 2 1 3 2 1 Khái niệm Các kiểu lai phân tử Các yếu tố ảnh hưởng Nguyên lí và điều kiện Mẫu dò Qui trình Ứng dụngIV www.themegall ery.com LOGO I. Gi i thi u chung v ph ng pháp Southern blot.ớ ệ ề ươ - Đây là ph ng pháp cho phép xác đ nh đ c s có m t c a ươ ị ượ ự ặ ủ nh ng trình t nucleotide trên m t đo n ADN nào đó, trong ữ ự ộ ạ h n h p các đo n ADN khác nhau ỗ ợ ạ - Do E.M.Southern đ xu t vào năm 1975, t i đ i h c ề ấ ạ ạ ọ Edingburd. - Đ c tri n khai nh 1 s kĩ thu t n n t ng c a công ngh ượ ể ờ ố ậ ề ả ủ ệ sinh h c phân t nh :ọ ử ư • Tách chi t gen.ế • PCR • Th m tích các phân t acid nucleotide lên màng lai ẩ ử (blot). • Lai phân t ( lai v i m u dò đ c hi u)ử ớ ẫ ặ ệ • … Southern blot www.themegall ery.com LOGO II. Lai phân tử 1. Khái ni mệ  Là hi n t ng 2 m ch DNA sau khi đã tách r i, s ệ ượ ạ ờ ẽ k t h p l i v i nhau đi u ki n nhi t đ đ c làm ế ợ ạ ớ ở ề ệ ệ ộ ượ gi m t t , k t h p v i đi u ki n thí nghi m thích ả ừ ừ ế ợ ớ ề ệ ệ h p.ợ  Đ c đi m:ặ ể – Đ c hi u tuy t đ i: s b t c p ch x y ra ặ ệ ệ ố ự ắ ặ ỉ ả gi a 2 trình t hoàn toàn b sung cho nhau.ữ ự ổ – Các trình t b sung có th là DNA hay RNA ự ổ ể  pt DNA-DNA, RNA-RNA, các phân t lai ử ử DNA-RNA www.themegall ery.com LOGO Các kiểu lai  phân tử Lai trên  pha rắn Lai trong  pha lỏngLai tại chỗ Southern blot www.themegall ery.com LOGO Sự lai phân tử  xảy ra do: ­Chuyển động  nhiệt. ­ Nhiệt độ môi  trường thấp hơn  Tm ít nhất vài độ -1 trình tự bổ  sung. ­1 trình tự cần  biết được gắn  trên gía thể Nguyên tắc LAI TRÊN PHA RẮN www.themegall ery.com LOGO Màng Nitrocellulose:  được sử dụng đầu tiên,  nay ít dùng, do: ­ Độ bền cơ học  kémkhó thao tác. ­ Không thể tách rời  các phân tử lai trên  màng để lai trở lai  với một mẫu dò  khác. àng Nitrocellulose:  được sử dụng đầu tiên,  nay ít dùng, do: ­ Độ bền cơ học  ké khó thao tác. ­ Không thể tách rời  các phân tử lai trên  àng để lai trở lai  với  ột  ẫu dò  khác. Màng nylon được sử dụng  phổ biến: ­ Có thể tiếp nhận  500µg/cm2. ­ giữ DNA chắc hơn. ­Ít đứt gãy ­Cho phép lai nhiều  lần với mẫu dò khác  nhau CÁC YẾU TỐ KĨ THUẬT TRONG LAI TRÊN PHA RẮN www.themegall ery.com LOGO Diagram Khó khăn: ­ Định lượng  phân tử kém  chính xác  ­ Hiệu quả lai  thấp (vận tốc  lai chậm đi 10  lần so với vận  tốc lai trên pha  lỏng). Thuận lợi: ­ Dễ dàng trong  thao tác.  ­ Dễ dàng tách  trình tự không lai  ra khỏi phân tử lai.  ­ Ngăn cản sự tái  bắt cặp giữa 2  mạch đơn của  cùng một phân tử. Lai trên màng  rắn Southern blot www.themegall ery.com LOGO Diagram - dựa trên nguyên  tắc biến tính và  hồi tính của  phân  tử DNA - Dựa vào nguyên tắc  bổ sung giữa các cặp  mucleotide: A­T, G­C  (các đoạn  polynucleotide mạch  đơn có trình tự bổ  sung)  Nguyên lí Nguyên lí III. PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT www.themegall ery.com LOGO Nguyên tắcguyên tắc ­ Phản ứng lai cần nhiệt độ cao  hoặc hóa chất gây biến tính  DNA (NaOH, Formaldehyt). Đòi hỏi một đoạn DNA (RNA)  đã biết được sử dụng làm mồi  “Probe” được đánh dấu ­ Các vật liệu, trang thiết bị máy  móc chính xác: màng lai, máy  Blotting, buồng lai, máy PCR  Southern blot www.themegall ery.com LOGO Diagram Tạo mẫu dò nhờ Plasmid ­Cắt Plasmid và ADN đã tách  chiết từ tế bào bởi cùng một  loại Enzym. ­Gắn ADN vào Plasmid trong  điều kiện môi trường phù hợp. ­Thực hiện biến nạp vào trong  tế bào vi khuẩn. ­Nhân các tế bào vi khuẩn và  chọn lọc. ­Tách plasmid từ các tế bào  chọn lọc. ­Tách mẫu dò (đoạn ADN). ­Đánh dấu mẫu dò Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR ­Thiết lập mồi và đánh dấu  phóng xạ vào các mồi. ­Biến tính mẫu ADN thành các  sợi đơn. ­Gắn mồi vào các sợi đơn. ­Tổng hợp các sợi ADN mới. ­Biến tính để tách chuỗi mới vừa  tổng hợp thành các sợi đơn. ­Tiếp tục quay về gắn mồi vào  các sợi đơn.  TẠO MẪU DÒ www.themegall ery.com LOGO Đánh dấu  probe  đồng vị phóng xạ (P32) Phát quang sinh  học Phương pháp hóa học Enzyme polynucleotide  kinase Kéo dài mồi … Southern blot www.themegall ery.com LOGO ­ DNA dùng để tạo mẫu dò ­ Tạo ra các vết khía sau đó bổ xung các  nucleotide tự do trong đó có các nucleotide,  đã được đánh dấu phóng xạ. ­ DNA polymerase I được cho vào ống và   bám vào các vết cắt. ­ Polymerase bắt đầu sửa chữa DNA theo  chiều 5' ­ 3'.  ­ DNA này sau đó được bằng nhiệt độ  làm biến tính sợi kép thành hai sợi đơn. ĐÁNH DẤU ĐỒNG VỊ PHÓNG  XẠ www.themegall ery.com LOGO - M u dò đ c đánh d u b ng enzyme ẫ ượ ấ ằ peroxidase. - Sau khi cho màng lai ti p xúc v i m u dò (đ c ế ớ ẫ ượ đánh d u phát quang sinh h c), c ch t c a ấ ọ ơ ấ ủ perpxidase b bi n đ i, ánh sáng phát ra s ị ế ổ ẽ đ c in trên phim ượ  thu nh n đ c k t quậ ượ ế ả ĐÁNH DẤU BẰNG PHÁT QUANG SINH HỌC www.themegall ery.com LOGO Giai đoạn 3 Giai đoạn 1 Tách chiết và  làm biến tính  DNA thành  các sợi đơn Chuyển DNA  từ agarose gel  lên màng lai Lai với probe  và kiểm tra  bằng kỹ thuật  phóng xạ tự  ghi Giai đoạn 2 QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT www.themegall ery.com LOGO www.themegall ery.com LOGO www.themegall ery.com LOGO Giai đo n 1ạ Tách chiết DNA cần nghiên cứu Cắt DNA nghiên cứu bằng enzyme cắt giới hạn Tiến hành điện di hỗn hợp DNA vừa được cắt, trên gel agarose Làm biến tính các dải băng DNA trên  gel agarpose dd NAOH 0,4M  thành các sợi  đơn www.themegall ery.com LOGO www.themegall ery.com LOGO - Màng đ c s d ng là màng nitocellulose ho c ượ ử ụ ặ màng nylon. - Nguyên t c: ắ d a vào nguyên t c mao d nự ắ ẫ • Đ m t phía d i đ c th m m t cách t nhiên lên ệ ừ ướ ượ ấ ộ ự trên chuy n các m nh DNA t gel lên màng và bám ể ả ừ ch t vào màng ( th i gian chuy n d a vào các ph ng ặ ờ ể ự ươ pháp chuy n khác nhau).ể - Cách ti n hành:ế • Đ t gel lên giá chuy n máy Blotting đ chuy n ặ ể ể ể nguyên v n các s i ADN bi n tính.ẹ ợ ế • dung d ch d n chuy n là NaOH 0,4M.ị ẫ ể • màng lai s gi c đ nh các đo n ADN đ c chuy n ẽ ữ ố ị ạ ượ ể lên t gel đi n diừ ệ GIAI ĐOẠN II www.themegall ery.com LOGO Máy bloting www.themegall ery.com LOGO www.themegall ery.com LOGO DNA có định trên màng lai kết hợp với probe(đã được  đánh dấu) theo nguyen tắc bổ sung Rửa và loại bỏ mẫu không tham gia phản ứng lai  trên màng lai Phát hiện vị trí lai nhờ phóng xạ tự ghi Đặt phim lên tấm lọc Tráng phim để thu các vạch đen tại nơi phát xạ GIAI ĐOẠN III www.themegall ery.com LOGO LAI VỚI MẪU DÒ  KẾT QUẢ www.themegall ery.com LOGO www.themegall ery.com LOGO LAI TRÊN MÀNG ĐẶT PHIM LÊN TẤM LỌC TRÁNG PHIM www.themegall ery.com LOGO ứng dụng southern blot   s t r   l t KĨ THUẬT RFLP ­ Nghiên cứu mối quan hệ họ hàng của nhiều nhóm loài thực vật,  động vật.  ­ Phát hiện sự có mặt của gen cần tìm trong hệ genome sinh vật  nghiên cứu ­ Phát hiện sự đa dạng DNA qua các cá thể khác nhau của 1 loài ­ Phát hiện các thể đột biến gen.  www.themegall ery.com LOGO ­là kĩ thuật phân tích sự đa hình VỀ CHIỀU DÀI, của các  mảnh DNA bị cắt đoạn. Nguyên lí: ­ Dựa trên sự sai khác của phổ băng điện di và độ dài  của các phân đoạn bị cắt bởi RE.  ­ Số lượng đoạn cắt khác nhau được phân biệt bằng điện  di đồ nên còn được gọi là dấu vân tay (finger printing)  đặc trưng cho từng phân tử DNA. Kĩ thuật RFLP www.themegall ery.com LOGO Kỹ thuật RFLP Các b c ti n hành:ướ ế Tách chiết và tinh sạch DNA. Cắt các mẫu DNA bằng một cặp RE Điện di sản phẩm DNA sau khi đã xử lí Làm biến tính DNA bằng nhiệt độ cao. Chuyển lên màng lai nitrocellulose, hoặc màng  nilon Ủ màng lai với mẫu dò đã đánh dấu bằng P32. Rửa màng lai  Hiển thị bằng phim phóng xạ tự ghi. www.themegall ery.com LOGO www.themegall ery.com LOGO www.themegall ery.com LOGO DNA FINGERPRINTING www.themegall ery.com LOGO SO SÁNH 2 MẪU  TÌM RA THỦ PHẠM www.themegall ery.com LOGO Tài liệu tham khảo - Tr nh Đình Đ t. Công ngh sinh h c. T p 4. ị ạ ệ ọ ậ NXB Giáo d c .ụ - H Huỳnh Thuỳ D ng. Sinh h c phân t . NXB ồ ươ ọ ử Giáo d c.ụ - Ph m Thành H . 2005. Nh p môn CNSH. NXB ạ ổ ậ Giáo d c.ụ - Di n dàn nhà sinh h c tr : nhasinhhoctre.comễ ọ ẻ - youtube.com - báck khoa toàn th m : vi.wikipedia.orgư ở LOGOwww.themegallery.com Click to edit subtitle style