Sinh học - Chương II: Các kỹ thuật nền cảu công nghệ sinh học hiện đại

 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen  Phương pháp PCR  Các phương pháp lai phân tử (lai Southern, Northern, Western)  Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Kỹ thuật tạo thư viện hệ gen và cDNA 2 Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN •Xác định trình tự ADN là việc xác định trình tự sắp xếp các nucleotides trong một đoạn DNA. Khái niệm C¸c mèc gi¶i m· hÖ gen cña c¸c sinh vËt kh¸c nhau Maxam-Gilbert method (1977) Sanger method (1977) Các phương pháp xác định trình tự Automated sequencing Next generation sequencing Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 6 Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 7 Nguyên tắc: Nếu chúng ta biết khoảng cách của mỗi loại base từ một nguồn gốc đã biêt, thì có thể suy ra trình tự của DNA Thí dụ nếu ta biết: A ở vị trí 2, 3, 11, 13 ... G ở vị trí 1, 12, ... C ở vị trí 6, 7, 8, 10, 15... T ở vị trí 4, 5, 9, 14.... Thì có thể suy ra trình tự đoạn DNA ban đầu là: GAATTCCCTCAGTC Để có đuợc các thông tin này, có thể tạo ra một vị trí kết thúc của một đoạn DNA đang kéo dài tại một base đã biêt (A, T, C hoặc G) và ở một vị trí đã biết trên DNA Maxam-Gilbert Method • Là phương pháp phân giải hóa học •Sử dụng hóa chất để phân hủy ADN ở các vị trí base đặc hiệu tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhau  Dimethyl sulfat methyl hóa G.  Axit formic pH=2 gây biến đổi và loại A + G.  Hydrazin gây biến đổi tại C và T.  Hydrazin + NaCl nồng độ cao gây biến đổi tại C.  Piperidine được dùng để loại bỏ các base sau khi bị biến đổi và cắt mạch. Các loại hóa chất sử dụng Base specificity Chemical used for base alteration Chemical used for altered base removal Chemical used for strand cleavage G Dimethylsulphate Piperidine Piperidine A+G Acid Acid Piperidine C+T Hydrazine Piperidine Piperidine C Hydrazine + alkali Piperidine Piperidine A>C Alkali Piperidine Piperidine G ATCTC G ATCTC GG CH3 TCTCG A TCTCG A DNA labeled at one end with 32P Base modification Release or displace- ment of reacted bases Strand scission Maxam and Gilbert chemical method J2 nucleic acid sequencing Các bước tiến hành  Chuỗi ADN kép được đánh dấu phóng xạ với phosphorus (32P) ở đầu 5'. Sử dụng Polynucleotide kinase enzyme và 32P- dATP.  Dùng dimethyl sulphoxide và đun nóng đến 90oC, 2 mạch của ADN tách nhau ra và được tinh chế lại (e.g. dùng điện di trên gel và dựa trên nguyên tắc 1 mạch của ADN chắc chắn sẽ nặng hơn mạch kia bởi có chứa nhiều purine nucleotides (A and G) hơn than pyrimidines (C and T) vốn nhẹ hơn).  Các sợi đơn được chia thành các mẫu riêng rẽ và được sử lý với các hóa chất đặc hiệu, chỉ gây biến đổi 1 trong 4 base,Xö lý tiÕp c¸c mÉu nµy víi piperidin ®Ó bÎ gÉy ADN t¹i vÞ trÝ baz¬ nit¬ ®· bÞ thay đổi t¹o ra c¸c ®o¹n oligonucleotid cã chiÒu dµi h¬n kÐm nhau mét nucleotid  ĐiÖn di riªng rÏ 4 mÉu trªn cïng 1 gel ®iÖn di, lµm phim phãng x¹ tù ghi và ®äc vÞ trÝ cña c¸c nucleotit lÇn l-ît trªn 4 mÉu tõ cùc d-¬ng cña gel lªn cùc ©m theo nguyªn t¾c: ®o¹n ADN cµng ng¾n cµng dÞch chuyÓn xa so víi ®iÓm xuÊt ph¸t ban ®Çu trªn b¶n ®iÖn di ®å. §¸nh dÊu phóng x¹ Sîi kÐp ADN Sîi ®¬n ADN T¹o tËp hîp chØ 1 sîi ®¬n cÇn ®oc tr×nh tù, chia vµo 4 èng Ph¸ huû ®Æc hiÖu chØ 1 lo¹i baz¬ t¹o nªn c¸c ®o¹n bÞ g·y ë n¬i ph¸ huû Tr×nh tù cña sîi bæ sung T¸ch c¸c ®o¹n b»ng ®iÖn di ®ång thêi s¶n phÈm ë 4 èng ph¶n øng. HIÖn h×nh qua phim X-ray Dµi h¬n Ng¾n h¬n Tr×nh tù C¸c b¨ng xuÊt hiÖn trªn phim t-¬ng øng víi c¸c ®o¹n bÞ gÉy ë c¸c baz¬ bÞ ph¸ huû Tr×nh tù cña sîi ®-îc gi¶i m·  Đoạn mạch đơn ADN đánh dấu đầu 5‘ ở nucleotid A có trình tự: 5’-P32 ATAGTCGCAGT3‘  C¸c chÊt ho¸ häc dïng ®Ó c¾t m¹ch ®¬n kh«ng hoµn toµn ®Æc tr-ng cho tõng phản øng riªng biÖt, phản øng phô sÏ diÔn ra ảnh h-ëng ®Õn kÕt quả cña sản phÈm c¾t.  đ©y lµ ph-¬ng ph¸p x¸c ®Þnh trình tù trùc tiÕp cña ADN, do ®ã sè l-îng ADN mÉu cÇn dïng lµ rÊt lín, nÕu l-îng mÉu ban ®Çu Ýt thì c¸c băng ®iÖn di kÕt quả b»ng phãng x¹ tù ghi bÞ mê, kh«ng râ rµng, khã ®äc chÝnh x¸c.  Phản øng ®ßi hái ADN mÉu hoµn toµn lµ m¹ch ®¬n, do vËy phải ph©n t¸ch ADN thµnh c¸c sîi ®¬n tr-íc khi tiÕn hµnh x¸c ®Þnh trình tù.  ChØ ¸p dông x¸c ®Þnh trình tù ®o¹n gen t-¬ng ®èi ng¾n, khoảng 250 bp Hạn chế của phương pháp Maxam- Gilbert Phương pháp Sanger (chain termination or dideoxy method) •Phương pháp enzyme •Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi DNA đơn được xác định dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp sợi DNA bổ xung. Các sợi DNA được tổng hợp mới này được kết thúc tại các vị trí đặc hiệu. •DNA polymerase xúc tác gắn các Nu vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid không có nhóm 3'OH, phản ứng tổng hợp bị dừng lại • Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các dideoxynucleotide (phương pháp dideoxynucleotid)  Các bản sao của DNA khuôn ở dạng sợi đơn  Một mồi thích hợp (bắt cặp với DNA khuôn)  DNA polymerase  4 loại nucleotides  Một lượng nhỏ dideoxynucleotides được đánh dấu (Phóng xạ hoặc chất nhuộm huỳnh quang)  Chuẩn bị DNA khuôn ở dạng sợi đơn  (thu hồi sợi đơn bằng biến tính nhiệt, hoặc xử lý với alkali)  Clone DNA trong plasmid vector.  Clone DNA trong bacteriophage M13 vector.  Clone DNA trong phagemid.  PCR có thể dùng để nhân sợi DNA đơn.  Bæ xung vµo èng phản øng ®o¹n måi ng¾n (tæng hîp hãa häc, cã thÓ ®-îc ®¸nh dÊu).  Bæ xung DNA polymerase  4 nucleotides: d-ATP, d-CTP, d-GTP vµ d-TTP  Mét l-îng nhá c¸c dideoxynucleotides (ddNTP) (cho vµo 4 èng phản øng riªng rÏ )  C¸c ph©n tö nµy (ddNTP) cã thÓ kÕt hîp vµo chuçi ADN ®ang tæng hîp mét c¸ch bình th-êng qua nhãm 5 triphosphat nh-ng l¹i kh«ng tiÕp tôc kÕt hîp ®-îc víi ph©n tö desoxynucleotit triphosphat tiÕp theo (dNTP).  KÕt quả sÏ cho mét lo¹t c¸c ®o¹n ADN ®-îc kÕt thóc mét c¸ch ®Æc hiÖu bëi gèc didesoxy nucleotit.  TiÕn hµnh thí nghiệm t-¬ng tù cho 4 phản øng tæng hîp ADN t¸ch rêi, mçi phản øng cã bæ sung mét lo¹i didesoxy nucleotit kh¸c nhau ta sÏ thu ®-îc c¸c ®o¹n ADN cã kÕt thóc b»ng c¸c didesoxy nucleotit kh¸c nhau vµ h¬n kÐm nhau 1 nucleotit.  Ch¹y ®iÖn di c¸c ®o¹n nµy råi hiÖn hình chóng, ta cã thÓ x¸c ®Þnh ®-îc trình tù chuçi ADN.  TÝnh æn ®Þnh cao, cã thÓ tiÕn hµnh víi quy m« lín.  Phản øng kh«ng phô thuéc vµo tÝnh ®Æc tr-ng ho¸ cña c¸c chÊt ho¸ häc, kh«ng cã phản øng phô.  NÕu kÕt hîp dïng víi phản øng PCR thì chØ cÇn l-îng ADN mÉu nhá, ®ång thêi cã thÓ giảm ®-îc ảnh h-ëng cña ADN cÊu tróc bËc 2.  X¸c ®Þnh ®-îc trình tù ®o¹n gen t-¬ng ®èi dµi, khoảng 300 ~ 400 bp. •Animation of the Sanger method Ưu điểm của phương pháp Sanger  Đươc thiết kế trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do F. Sanger et als phát minh  Trong quá trình tổng hợp ADNN có sử dụng mồi và dNTP đánh dấu huỳnh quang (fluoresecent dye) thay cho phóng xạ, mỗi dNTP được đánh dấu huỳnh quang khác nhau, biểu thị ra mầu sắc khác nhau  Tổng hợp sợi AND trên cả hai mạch khuôn, xử lý kết quả bằng phần mềm máy tính nên hạn chế các sai sót, có độ chính xác cao  Chuẩn bị AND khuôn  Nhân AND bằng PCR  Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự sequencer, chạy máy  Phân tích kết kết quả từ các dữ liệu do máy cung cấp, so sánh kết quả đọc trên hai mạch và đồ thị.  Sau khi diễn ra phản ứng, sản phẩm của cả 4 ống được trộn lẫn và cho điện di trong cùng một “giếng” trên gel (sẽ cho các băng cùng dẫy)  Gần phần đỉnh của gel là một máy phân tích, nó sẽ kích thích sự phát huỳnh quang của các oligo nucleotid bởi tia laser khi di chuyển qua. Màu của ánh sáng huỳnh quang của từng Oligo nucleotid sẽ được phát hiện qua các thiết bị điện tử.  Thông tin này được kết nối với máy tính đã có phần mềm chương trình hoá biến đổi thông tin về màu thành trình tự base. Thí dụ xanh da trời là màu của chuỗi oligonucleotid thu được từ phản ứng dideoxy C, như vậy kết thúc sẽ là base ddC, xanh lá cây là A, da cam là G và đỏ là T.  Máy tính sẽ in ra sơ đồ xác định trình tự vừa nêu và lưu giữ các thông số. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 36 Pyrosequencing là một phương pháp xác định trình tự DNA dựa trên nguyên lý đọc trình tự qua "tổng hợp“ dựa vào khả năng phát hiện sự giải phóng pyrophosphate mỗi khi một nucleotide được gắn vào mạch. -Nguyên tắc: Pyrosequencing là dựa trên khả năng phát hiện hoạt tính của DNA polymerase với một enzym phát quang (chemiluminescent.) - Về bản chất, phương pháp cho phép đọc trình tự của một sợi đơn của DNA bằng cách tổng hợp sợi bổ sung dọc theo nó, và phát hiện những bazơ đã thực sự được gắn vào ở mỗi bước. Các mẫu DNA được cố định, và các dung dịch của A, C, G, và T nucleotide được thêm vào và bỏ đi sau mỗi phản ứng một cách tuần tự. Pyrosequencing Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 37  việc thêm một nucleotid vào đầu cuối của sợi là có thể nhận biết bởi nó được kèm theo sự giải phóng một phân tử pyrophosphate, là phân tử sau đó được chuyển hóa thành tín hiệu phát sáng nhờ enzyme sulfurylase. Ánh sáng sản xuất bởi phản ứng xúc tác luciferase-được phát hiện bởi một máy ảnh và phân tích trong một chương trình  mỗi dNTP được thêm vào riêng rẽ một cách tuần tự. nucleotidase enzyme (apyrase ) cũng có trong thành phần phản ứng nên những dNTP không được gắn vào mạch sẽ được phân hủy trước khi các dNTP tiếp theo được bổ sung. 38 Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 39 Hiện nay, một hạn chế của phương pháp là độ dài của mỗi lần đọc chỉ xung quanh 300-500 nucleotide, Điều này có thể làm cho quá trình lắp ráp bộ gen khó khăn hơn, đặc biệt là cho các hệ gen có chứa một lượng lớn ADN lặp đi lặp lại. Đến năm 2007, pyrosequencing là phổ biến nhất là sử dụng cho resequencing hoặc đọc trình tự của bộ gen mà hệ gen của loài họ hàng gần gũi đã hoàn tất. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 40