Sinh học - Chương 1: Các enzyme chủ yếu

Chương 1 Các enzyme chủ yếu Nguyễn Vũ Phong Enzyme cắt giới hạn • Loại I: Cắt một đoạn vài chục nu cách vị trí nhận biết từ 1000 - 5000 nu. • Loại II: nhận biết trình tự chuyên biệt và cắt tại vị trí nhận biết • Loại III: Nhận biết trình tự và cắt cách trình tự nhận biết đó khoảng 20 nu Enzyme cắt giới hạn • RE cắt DNA ở vị trí chuyên biệt, có trình tự xác định Trình tự nhận biết của 1 số enzym cắt hạn chế Enzyme cắt giới hạn Gắn các đoạn linker Enzyme terminal transferase Isochizomer • MboI và Sau3AI nhận biết cùng trình tự • Trình tự nhận biết của BamHI Methyl hóa (methylation) EcoRI không cắt được Methyl hóa (methylation) • dam (DNA adenine methylase) • dcm (DNA cytosine methylase) Phản ứng cắt bằng RE • Buffer (dung dịch đệm) – (H): dung dịch đệm hoạt độ ion cao – (M): hoạt độ ion trung bình – (L): hoạt độ ion thấp Thường được chuẩn bị ở dạng stock (X10), giữ ở 4 0C/ 1-2 tuần; -20 0C Phản ứng cắt bằng RE DNA polymerase • Tổng hợp chuỗi polymer từ các dNTP. • Gắn nucleotide vào đầu 3’-OH của primer có sẵn. • Không thể tổng hợp chuỗi polynucleotide ngay từ đầu mút của chuỗi (de novo) • Hầu hết các polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc từ các virus kí sinh vi khuẩn (thực khuẩn thể). • Vi khuẩn: Pol I, Pol II, Pol III. – Tổng hợp polynucleotide theo 5’  3’. – Hoạt tính 3’  5’ exonuclease ứng dụng trong sửa sai (proofeading) – Pol I: sửa chữa DNA – Pol II: – Pol III: enzyme chính điều khiển quá trình tái bản. DNA polymerase ở Prokaryote DNA polymerase I (từ E.coli) DNA Pol I còn có hoạt tính 5’  3’ exonuclease • T4 DNA polymerase ở thực khuẩn thể cần khuôn và primer để hoạt động. 5’  3’ polymerase khi có dNTPs 3’ 5’ exonuclease khi không có dNTPs Không có hoạt tính 5’-3’ exonuclease Có thể sử dụng T4 DNA polymerase trong kỹ thuật nick translation hay gắn nhãn đầu 3’ của DNA sợi đôi. DNA polymerase ở Prokaryote • DNA polymerase T7 của thực khuẩn thể là công cụ lí tưởng cho việc giải trình tự DNA. Dạng chỉnh sửa của enzyme này có tốc độ polymer hoá trên 300 nucleotide/giây. DNA polymerase ở Prokaryote • Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) xúc tác việc bổ sung homopolymer vào đầu 3’-OH của DNA và không cần khuôn mẫu. TdT được sử dụng trong dán nhãn DNA với các nucleotide đã biến đổi (ddNTP, DIG-dUTP), kéo dài primer hoặc giải trình tự DNA. DNA polymerase ở Prokaryote DNA polymerase bền nhiệt • Bst : DNA Pol I, Bacillus stearothermophilus . • Bst Pol I hoạt động tốt nhất ở 65oC, bị bất hoạt ở 75oC/15’. • Hoạt tính 5’  3’ exonuclease đạt mức cao nhất khi có Mg2+ nồng độ cao. • Bst Pol I gồm 2 phân đoạn protein. Phân đoạn lớn bền nhiệt và rất hữu dụng trong các phản ứng giải trình tự ở 65 oC. DNA polymerase bền nhiệt Taq polymerase: Thermophilus aquaticus. Vi khuẩn sống ở 70 oC và có thể sống sót ở 80 oC. Taq polymerase có hoạt tính tối đa đạt được ở 80 oC và cần Mg2+ Thiếu hoạt tính 3’  5’ exonuclease (hoạt tính sửa sai, proofreading), là enzyme có độ chính xác thấp. DNA polymerase bền nhiệt Tth polymerase: Thermus thermophilus, 94 kDa, thiếu hoạt tính 3’  5’ exonuclease. - Xúc tác sao chép DNA: từ khuôn DNA với Mg2+, từ khuôn RNA (phiên mã ngược) với Mn2+ DNA polymerase bền nhiệt có hoạt tính sửa sai Hoạt tính 3’  5’ exonuclease (hoạt tính sửa sai) giúp tăng độ chính xác. • Pfu từ Pyrococcus furiosus có tỉ lệ sai sót là 1,6 x 10-6 • Pow polymerase (từ Pyrococcus woesei) có chu kì bán phân hủy trên 2 giờ ở 100 oC và tỉ lệ sai sót rất thấp 7,4 x 10-7; chỉ hiệu quả đối với khuôn mẫu có kích thước dưới 3,5 kb. Reverse transcriptase • Tổng hợp DNA từ khuôn mẫu RNA • Có nguồn gốc từ retrovirus – Tổng hợp DNA từ khuôn mẫu RNA hay DNA (sợi đơn hoặc sợi đôi). – Hoạt tính RNaseH: exoribonuclease 5’ 3’ và 3’  5’ phân hủy DNA và RNA trong tổ hợp lai • RT thiếu hoạt tính 3’  5’ exonuclease nên có độ chính xác thấp hơn DNA polymerase. • Hoạt tính RT cần primer và khuôn mẫu. Reverse transcriptase • Tổng hợp DNA mạch đơn (c-DNA, complementary DNA) từ một sợi mRNA hoặc từ polyribonucleotide tổng hợp RNA polymerase • Tổng hợp RNA từ khuôn DNA theo chiều 5’3’. • SP6 RNA pol : 96 kDa , từ Salmonella typhimurium LT2 bị xâm nhiễm bởi thực khuẩn thể SP6. • T7 RNA pol : 98 kDa sản xuất bởi thực khuẩn thể T7. • RNA pol được sử dụng tổng hợp antisense RNA in vitro, tạo probe RNA có gắn nhãn. • SP6 và T7 RNA pol cần Mg2+ và khuôn DNA sợi đôi. • Mỗi loại SP6 và T7 RNA pol cần promoter đặc hiệu trong phiên mã DNA DNA ligase • Tạo liên kết phosphodiester giữa nhóm 5’ phosphate và 3’-OH ở vị trí hở sợi đơn của DNA sợi đôi. • Nối các đoạn DNA đầu bằng hoặc đầu dính, thêm linker/adaptor hay sửa các vị trí hở (nick) • Không bền nhiệt gồm DNA ligase từ Chlorella virus và thực khuẩn thể T7 (34 kDa, 41 kDa), thực khuẩn thể T4 (68 kDa). • DNA ligase bền nhiệt được phân lập từ nguồn vi khuẩn chịu nhiệt, hoạt động ở nhiệt độ từ 45 – 80 oC DNA ligase • E coli DNA ligase: nối đầu so le • T4 DNA ligase được sử dụng nhiều nhất trong SHPT, là một đơn phân có khối lượng 68 kDa cần Mg2+ và ATP để hoạt động. • T4 DNA ligase có thể nối đầu bằng hoặc đầu so le hay sửa những vị trí hở (nick) sợi đơn trên sợi đôi DNA, RNA hoặc tổ hợp lai DNA/RNA. RNA ligase • RNA ligase xúc tác hình thành nối phosphodiester giữa đầu 5’ phosphate và 3’-OH của RNA sợi đơn hay phân tử DNA. • T4 RNA ligase Loại nhóm phosphate • Alkaline phosphatase (AP) – Tinh sạch từ E. coli hoặc các sinh vật bậc cao, – Sử dụng để loại nhóm 5’-phosphate khỏi nucleic acid nhằm ngăn chặn sự đóng vòng của DNA vector trong các thí nghiệm tạo dòng. • AP bị bất hoạt bởi các tác nhân tạo phức (chelating agents) như EGTA, nồng độ thấp của phosphate vô cơ. Chuyển nhóm phosphate • T4 polynucleotide kinase xúc tác phản ứng chuyển một nhóm phosphate từ phân tử ATP đến đầu 5’-OH của một nucleic acid. • Hay phosphoryl hoá đầu 3’ của các mononucleotide. Nuclease • Phân cắt liên kết phosphodiester trong chuỗi nucleic acid. – Exonuclease cắt ở hai đầu phân tử nucleic acid. – Endonuclease phân cắt vùng bên trong của phân tử. • Deoxyribonuclease phân cắt DNA và tạo các khe hở (nicks). • Ribonuclease cắt RNA. Nuclease DNase I (deoxyribonuclease I): endonuclease phân cắt sợi đôi/đơn DNA khi có mặt các ion hóa trị 2 tại vị trí nằm ngay sau 1 base pyrimidine (T, C). - Có Mg2+ : enzyme tạo nick trong sợi đôi DNA - Có Mn2+ : enzyme cắt cả hai sợi DNA. • Nick translation • Cắt ngẫu nhiên đoạn DNA • Tinh sạch RNA từ tế bào hay hỗn hợp phiên mã. Nuclease DNase I (deoxyribonuclease I) • Glycoprotein, 31 kDa , thường ở dạng hỗn hợp gồm 4 isoenzyme (A, B, C, D). • Bị bất hoạt ở 75 oC trong 5’ với EGTA 5 mM. • Ưu tiên xúc tác phản ứng cắt ở vị trí 3’ của pyrimidine (C/T). Nuclease Exonuclease III (exodeoxyribonuclease III) 3’-exonuclease, xúc tác loại bỏ từng nucleotide khỏi đầu 3’-OH của sợi đôi DNA. Phosphatase, loại bỏ gốc phosphate của chuỗi DNA kết thúc với nhóm 3’-phosphate. Rnase H, phân giải sợi RNA trong tổ hợp lai DNA/RNA. Endonuclease, phân cắt các base lỗi (apurinic, apyrimidic) khỏi khung đường phosphate của DNA. Nuclease Rnase T1 : 11 kDa , Aspergillus oryzae, có hoạt tính endonuclease phân cắt đặc hiệu RNA sợi đơn ở base G. Rnase T2 : 36kDa, Aspergillus oryzae, cắt tất cả các liên kết phosphodiester trong RNA. S1 nuclease: 31 kDa, phân cắt RNA hoặc DNA sợi đơn thành các 5’ mononucleotide. Dùng xác định các dạng lai nucleic acid, đánh dấu vùng DNA sợi đôi, loại vùng sợi đơn của DNA dạng so le. Nuclease Exonuclease VII: 88 kDa. Phân giải đặc hiệu DNA sợi đơn (từ 2 đầu của phân tử). Dùng để tạo DNA đầu bằng; Đặc biệt được dùng loại bỏ primer khỏi phản ứng PCR. Ribonuclease Ribonuclease tuỵ (RNAse A) Cắt sợi đơn RNA ở nucleoside 3’-phosphate và 3’- phospho-oligonucleotide kết thúc với Cp/Up Giảm nhiễm RNA trong ly trích plasmid DNA Lập bản đồ đột biến trong DNA/RNA bằng cách phân cắt ở những vị trí không tương đồng RNAse A hoạt động ở những điều kiện rất khác nhau và khó bất hoạt. Ribonuclease Ribonuclease H (RNAse H) Phân giải đặc hiệu RNA trong phức hợp lai RNA/DNA Phân giải RNA probe của các phản ứng lai Loại bỏ đuôi poly-A ở đầu 3’ của mRNA. RNAse H có hoạt tính tối đa ở điều kiện pH 7,5 – 9,1 với sự có mặt của các tác nhân khử, ion Mg2+/Mn2+ Enzyme bị ức chế bởi N-ethylmaleimide và ở mức thấp hơn bởi nồng độ ion cao.