Phương pháp và kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử

PHƢƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SHPT GV: Nguyễn Thị Ngọc Yến Mục tiêu  Công cụ cơ bản của SHPT và cách sử dụng  Một số phương pháp cơ bản của SHPT  Ứng dụng trong thực tế Các enzym biến đổi acid nucleic Enzym cắt hạn chế - RE  Restriction enzyme (RE): Endonuclease cắt ADN tại hay gần 1 trình tự nhận diện đặc hiệu  Methylase: methyl hóa trình tự nhận diện đặc hiệu và ngăn cản tác động RE  Cặp RE/methylase khác nhau Phân loại RE  Loại I và III là phức hệ gồm cả 2 hoạt tính RE và methyl hóa, loại này cần ATP và nó cắt ADN tại vị trí khá xa điểm nhận diện ít được dùng  Loại II chỉ có hoạt tính endonuclease, không cần ATP để hoạt động và cắt ADN tại hoặc rất gần vị trí nhận diện sử dụng nhiều o EcoRII o BamHI Nhận diện vị trí cắt  Vị trí nhận diện của đa số RE loại II thường chứa 4 -6 nucleotid theo kiểu palindrome  RE chỉ cắt ADN sợi đôi và tạo ra 2 đầu tận 5’-P và 3-OH. Đầu cắt có thể tà hoặc so le (đầu dính)  Nếu trình tự nhận diện có phần nào tính đối xứng thì điểm cắt thường nằm giữa nó Polymerase – Đặc tính chung  Hoạt tính tổng hợp 5’3’: gắn dNTP vào đầu 3’-OH của mồi và giải phóng PPi  Hoạt tính exonuclease 3’5’: “sửa lỗi”  Hoạt tính exonuclease 5’3’: hủy mồi  Ribonuclease H: hủy ARN trong phức lai ARN-ADN  Dịch chuyển sợi  Khả năng xử lý  Tần suất lỗi Polymerase – Đặc tính chung Phân loại  ADN polymerase phụ thuộc ADN: enzym sao chép  ARN polymerase phụ thuộc ADN: enzym phiên mã  ADN polymerase phụthuộc ARN: reverse transcriptase Taq polymerase o Hoạt động tối ưu ở 75-80oC, giảm 10 lần ở 37oC. Hoạt tính vẫn còn sau 2h ở 95oC o Ứng dụng: • Khuếch đại ADN bằng PCR • Giải trình tự ADN bằng pp dideoxy Ligase Enzym xúc tác phản ứng tạo liên kết phosphodiester giữa 3’-OH và 5’-P của hai sợi acid nucleic Chủng VSV và vector tạo dòng Chủng vi sinh vật E. coli  Bộ máy di truyền được nghiên cứu đầy đủ  Tốc độ tăng trưởng nhanh  Khả năng gây bệnh thấp Chủng vi sinh vật JM103 o Nhân bản vector phage M13 o Dùng với plasmid pUC, plasmid sử dụng kỹ thuật bổ sung anpha để chọn lọc dòng tái tổ hợp o Mang gen cho đoạn omega của β-galactosidase trên plasmid F’, cho phép nó bị nhiễm bởi các phage dạng sợi như M13. Nếu mất plasmid F’ sẽ làm mất khả năng này DH5-ɑ o Mang đặc tính bổ sung anpha như JM103 o Đột biến gen recA làm mất khả năng tái tổ hợp tương đồng o Mang gen deoR đột biến giúp dễ thu nhận mảnh ADN lớn Vector tạo dòng Vật liệu di truyền trung gian chuyển và lưu trữ gen tái tổ hợp trong tb chủ Yêu cầu: o Có khả năng tự sao chép ở tb chủ o Có thể tồn tại ổn định trong tb chủ qua nhiều thế hệ o Trình tự nhận diện enzym cắt giới hạn đưa gen vào o Mang yếu tố chọn lọc để xác định tb có mang vector o Gồm • Plasmid • Vector phage tiêu giải từ phage lamda • Cosmid • Vector phage sợi M13 Vector plasmid  Plasmid: ADN kép, vòng, nhân bản độc lập với NST  Yêu cầu: o Có yếu tố đánh dấu để chọn lọc dòng tái tổ hợp, thường là một hay nhiều gen kháng kháng sinh o Có điểm Ori cho phép nhân bản độc lập NST. Plasmid được hiện nay có điểm Ori có thể kiểm soát được. VD: cho phép khuếch đại plasmid khi có mặt chất ức chế tổng hợp protein (như chloramphenicol)  hiệu suất cao khi chiết với độ tinh khiết khá tốt o Có vùng tạo dòng (MCS): là nhiều trình tự nhận diện duy nhất của các RE khác nhau nằm liên tiếp (polylinker), để cắt mở vòng plasmid và nối đoạn gen mong muốn vào. Plasmid được đưa vào tb chủ = biến nạp, thẩm điện VD: pUC, pBR322, pBluescript II YT đánh dấu chèn Yếu tố chọn lọc Các vector plasmid  pUC  pBR322  pGEM và pBluescript pUC Vector từ phage lamda Phage tiêu giải Vector từ phage ʎ Tạo vector từ phage: o Cắt bỏ một phần bộ gen phage không liên quan đến quá trình tiêu giải và thay bằng đoạn ADN cần tạo dòng o Kích thước ADN sau tái tổ hợp: 78% (38 kb)  102% (51 kb) so với dạng hoang dại (50 kb) mới đóng gói được Vector từ phage lamda Ưu điểm: o Đóng gói in vitro. Điều này rất có ý nghĩa vì khi đó chỉ cần một lượng ít vector và ADN cần chèn. Đóng gói in vitro là cách đơn giản nhất để đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào E. coli chủ. o Các thư viện phage có thể dễ dàng phát hiện với mẫu dò, khuếch đại và bảo quản trong một thời gian dài Vector cosmid Cosmid = cos site + plasmid: dạng lai phage và plasmid o Mang yếu tố chọn lọc, điểm Ori (~plasmid) o Vị trí tạo dòng, trình tự mã hóa cho vị trí cos (~phage ʎ) Vector cosmid Tạo vector cosmid: o Cắt vector bằng RE tại MCS và trộn với đoạn gen muốn chèn (có chiều dài từ 35 - 45 kb) o Vector và đoạn chèn sẽ được nối lại bằng ligase, tạo sợi ADN thẳng với đoạn chèn bị kẹp giữa 2 phần của vector và tận cùng với các vị trí cos ở 2 đầu o Đóng gói in vitro nhờ nhận diện 2 vị trí cos: Sợi ADN này ủ với các protein vỏ sẽ tạo thành phage và được gây nhiễm vào E. coli o Sau khi vào tế bào chủ, ADN tái tổ hợp sẽ tạo thành vòng nhờ vị trí cos và hoạt động như một plasmid Ƣu điểm  Tạo dòng các đoạn gen có kích thước lớn đến 50 kb, trong khi đó plasmid và phage lambda < 15 kb Các phƣơng pháp & kỹ thuật cơ bản •Chiết tách và tinh chế vật liệu di truyền •Lai acid nucleic •Kỹ thuật PCR •Tái tổ hợp và tạo dòng gen •Xác định trình tự acid nucleic Chiết tách và tinh chế ADN Nguyên tắc  Phá vỡ tế bào phóng thích VLDT + tế bào chất  Tủa các thành phần trong tbc và để lại ADN tan  Cô đặc và thu hồi ADN dạng tinh khiết Chiết bằng phenol/chloroform Phá vỡ tb vật lý/ hóa học Thu hồi acid nucleic Phá thành + màng tb bằng pp vật lý/ hóa học - Biến tính protein và phân tách cùng pha hữu cơ, để lại ADN tan trong nước - Loại ARN: ribonuclease (RNase) - Tủa ADN bằng ethanol tuyệt đối với sự hiện diện muối cation hóa trị I, nhiệt độ thấp - Isopropanol đồng thể tích với pha nước Chiết ADN bộ gen tế bào  Phá vỡ tế bào o Tb thực vật: nghiền tb trong cối đá o Tb động vật: enzym, chất tẩy  Tách ADN o Thay phenol/chloroform = CTAB. CTAB tạo phức không tan với ADN, đường và lipid tan o Tách ADN bằng sắc ký hấp phụ Chiết plasmid Tách plasmid khỏi ADN NST:  Kích thước: o Phá vỡ tb trong điều kiện nhẹ nhàng, ADN NST không đứt đoạn nên kích thước lớn và gắn màng tb nhờ đó loại bỏ bằng ly tâm  Cấu dạng: o Phá vỡ tb bằng SDS, ADN NST đứt đoạn o Biến tính ADN thẳng từ sợi kép  đơn bằng pH 12, ADN plasmid siêu xoắn không ảnh hưởng o Thêm acid, ADN NST hồi tính không chính xác nên tủa Chiết ADN phage Chiết tách từ thực khuẩn chứ không từ tb chủ nên chiết tách khá đơn giản. Cần loại bỏ capsid của phage o Ly tâm loại tb chủ o Tủa phage bằng PEG o Loại capsid bằng phenol Tinh chế acid nucleic  Ly tâm phân đoạn: lượng acid nucleic lớn. Ly tâm phân tách theo thang tỷ trọng saccharose hoặc CsCl2  Sắc ký: o Lọc gel: tách ADN qui mô lớn o HPLC: tách oligonucleotid, độ phân giải cao đến 1 nu o Hấp phụ: mARN với đuôi polyA được hấp phụ bằng resin  Điện di: tách ADN qui mô nhỏ o Gel agarose o Gel polyacrilamide: tinh chế acid nucleic với khác biệt 1 nu Định tính & định lƣợng ADN Định lƣợng ADN – Quang phổ kế  Định lượng: ADN hấp thu cực đại 257nm  OD260nm 1 OD260nm tương đương o 50 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đôi o 40 μg/ml dung dịch ARN (hoặc ADN) sợi đơn o 30 μg/ml oligonucleotid (tới 70 base)  Kiểm tra độ tinh khiết: tỷ lệ OD260/230 hoặc OD260/280 Định tính ADN – Điện di gel  Phân tách acid nucleic/ protein dưới tác động của điện trường xuyên qua 1 hệ gel. Các phân tử sẽ tách ra: o Tùy theo kích thước o So sánh với chuẩn Kỹ thuật lai acid nucleic Khái niệm Lai phân tử: 2 ptử nucleic sợi đơn trong điều kiện thích hợp có thể bắt cặp bổ sung bằng lk H2 tạo sợi kép Đặc điểm o = lai phân tử o Sản phẩm: phân tử lai (duplex) o Phản ứng thuận nghịch o Kép  đơn: biến tính bởi to/ hóa chất o Lai đặc hiệu: bắt cặp bổ sung hoàn toàn  bền Yếu tố ảnh hƣởng  Nhiệt độ: quyết định độ bền lk H2  Độ dài trình tự lai  Tỷ lệ GC trong duplex  Nồng độ ion  Nồng độ phân tử, thời gian phản ứng Nhiệt độ chảy Tm: Nhiệt độ tại đó 50% duplex hình thành. Phụ thuộc chiều dài, tỷ lệ GC, nồng độ ion Tm (oC) = 4(GC) + 2(AT) To > Tm: biến tính duplex To < Tm: phản ứng lai (hồi tính) Kỹ thuật lai Nguyên tắc: Dùng đoạn dò để lai và phát hiện ra phân tử đích. Nếu có sự tồn tại phân tử lai  có phân tử đích trong mẫu Đoạn dò (probe): oligonucleotid có trình tự bổ sung với phân tử đích, được đánh dấu bằng phóng xạ, huỳnh quang, enzym. Kỹ thuật lai Phản ứng lai tiến hành trong điều kiện sao cho sự lai diễn ra đặc hiệu: o Đặc hiệu  duplex bền  phát hiện o Không đặc hiệu  biến tính không phát hiện Phân loại  Lai trên màng rắn: phân tử tham gia được cố định trên màng nitrocellulose, probe tự do trong dung dịch  duplex gắn trên màng o Southern blot: đích là ADN o Northern blot: đích là ARN o Dot blot: hỗn hợp acid nucleic chấm trực tiếp trên màng  Lai tại chỗ: định vị acid trong mô/tb  Lai trong dung dịch, duplex được tách khỏi dung dịch để phát hiện  chẩn đoán bệnh dựa trên acid nucleic Lai sau khi điện di, phát hiện và xác định kích thước phân tử đích S o u th e rn b lo t Southern blot Southern blot Kỹ thuật PCR Nguyên lý Dựa trên sao chép ADN in vitro o Trong điều kiện có sẵn nucleotid o Enzym polymerase sẽ kéo dài mạch ADN theo nguyên tắc bổ sung nếu đầu 3’-OH trống Tiến trình PCR Sự lặp lại của 1 tiến trình gồm 3 bước: o Biến tính: dsADN  ssADN nhờ nhiệt độ o Gắn mồi: ủ các đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid ADN tổng hợp đặc hiệu, gồm mồi xuôi, mồi ngược) với các ssADN o Kéo dài: enzym kéo dài mồi theo NTBS với khuôn mẫu 3’ 5’ Chƣơng trình PCR  Biến tính khởi đầu: 95oC / 5-10 phút  Chu kỳ nhiệt: gồm 3 bước lặp lại 25-40 lần o Biến tính: 94-95oC / 30s-vài phút o Gắn mồi: 40-70oC (< Tm của mồi) / 30s-60s o Kéo dài: 65-74OC / thời gian tùy theo độ dài khuôn  Kéo dài kết thúc: 72-74oC / vài lần thời gian kéo dài Thành phần phản ứng: • Khuôn mẫu • Mồi • Đệm: pH thích hợp và nồng độ Mg++ thay đổi • dNTPs: A, T, G và C • DNA polymerase Yêu cầu thành phần phản ứng  Mồi o 18-30 nu, bổ sung đặc hiệu với mạch khuôn o Tỷ lệ GC 40-60% o Không tạo nút kẹp tóc, 2 mồi không bắt cặp với nhau o Tính Tm  Nhiệt độ gắn mồi < Tm (oC) 3-5oC  Polymerase o Chịu nhiệt, nguồn gốc từ VSV ưa nhiệt o VD: Taq polymerase 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ ADN đích ADN đích biến tính Gắn mồi Kéo dài Biến tính Gắn mồi Kéo dài Biến tính và gắn mồi Kéo dài 3’ 3’ 3’ 3’ Đoạn đích q u a y l ạ i Đoạn đích q u a y l ạ i Tiếp tục biến tính, gắn mồi và kéo dài trong 20-40 chu kỳ 5’ 5’ Ƣu nhƣợc điểm  Ưu: Nhanh, Đơn giản, Nhạy, Đặc hiệu  Nhược o Phải biết trình tự 2 đầu để thiết kế mồi o Ngoại nhiễm  mất tính đặc hiệu  Cải tiến o Nested PCR (mồi tổ) o RT-PCR: PCR ngược, dùng ARN là khuôn tổng hợp ADN o Realtime-PCR: phát hiện và định lượng sp bằng huỳnh quang  số lượng ADN khuôn ban đầu • Nhuộm xen giữa • Phân hủy đoạn dò • Lai hóa đoạn dò Nhuộm xen giữa Hủy đoạn dò Lai hóa đoạn dò Ứng dụng  Khuếch đại ADN dùng trong nghiên cứu, tạo dòng gen  Phát hiện ADN trong chẩn đoán, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao  Xác định huyết thống, pháp y Tái tổ hợp và tạo dòng gen Nguyên lý  Cô lập gen số lượng lớn ở dạng tinh khiết để nghiên cứu cấu trúc, cần đưa vào tb chủ để nhân bản  Tạo dòng gen  Khác PCR: tạo dòng gen chưa biết cấu trúc, do đó thực hiện trước khi PCR  Gồm o Tạo đoạn ADN o Nối đoạn ADN cần tạo dòng vào vector tạo phân tử tái tổ hợp o Đưa ADN tái tổ hợp vào tb chủ o Chọn lọc dòng tái tổ hợp Tạo đoạn gen mong muốn Dùng RE o Cắt phân tử ADN lớn thành các đoạn nhỏ. Điều này thường được sử dụng khi xây dựng các thư viện gen o Sử dụng 2 loại RE khác nhau để các đoạn tạo ra có kích thước vừa phải cho việc tạo dòng  phân tích các đoạn thu được và lập bản đồ các vị trí cắt của bộ gen o Lưu ý vị trí cắt sẽ tạo ra đầu tù/ đầu dính phù hợp với vector mới nối vào được Kỹ thuật PCR o Nếu cấu trúc đoạn gen đã được biết o Đoạn ADN thu được bằng PCR có các đầu bị so le (lệch) không xác định về trình tự o Làm tà đầu sản phẩm PCR, gắn linker hoặc adaptor o Thiết kế mồi có chứa trình tự nhận diện cắt của RE Nối ADN  Dùng ligase của T4 (tinh chế từ E. coli nhiễm T4)  Trộn vector duỗi thẳng và ADN với ligase trong điều kiện thích hợp  lk phosphodiester và nối các ADN lại  Đầu tù: o Linker (đoạn nối): Oligonucleotid sợi đôi tổng hợp ngắn có đầu tà và chứa trình tự cắt (đầu dính) của một RE o Adaptor: khắc phục nhược điểm linker, đây là một oligonucleotid sợi đôi tổng hợp có sẵn một đầu dính o Tạo đuôi homopolymer: dùng enzym doxynucleotidyl transferase để thêm một loạt các nucleotid cùng loại vào đầu 3’-OH của sợi ADN tạo thành đuôi homopolymer Linker Homopolymer Chuyển ADN vào tb chủ  Biến nạp: Vk bắt ADN từ môi trường  Tải nạp: sử dụng thực khuẩn để gây nhiễm tế bào đích  Thẩm điện: dùng điện thế cao làm thủng màng tế bào để ADN lọt qua  Chuyển nhiễm: cơ chế giống biến nạp nhưng có thể áp dụng cho tế bào động vật  Đạn sinh học: “súng bắn gen” đưa ADN gắn trên hạt vàng xuyên qua màng tế bào Chọn lọc dòng tái tổ hợp  Kỹ thuật bổ sung anpha  Sử dụng sự đề kháng kháng sinh  Chọn lọc trực tiếp  Lai khóm Xác định trình tự acid nucleic Giải trình tự 2 phương pháp:  Sanger – Coulson  Maxam – Gilbert So sánh Sanger-Coulson Maxam-Gilbert Hiệu quả Cao Kém Độc hại Ít Độc Mồi Cần Không Phƣơng pháp Sanger-Coulson  PP enzym/dideoxy: dựa vào sự ngừng tổng hợp ADN khi gặp phải dideoxynucleotid (Frederick Sanger)  Qui trình: o Thực hiện 4 phản ứng PCR riêng biệt với 1 mồi: A: có dNTP + ddATP T: có dNTP + ddTTP G: có dNTP + ddGTP C: có dNTP + ddCTP o Mỗi ống sản phẩm được nạp vào một giếng điện di o Kết quả điện di được đọc  trình tự Đọc kết quả Phƣơng pháp Sanger 5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’ ddG ddA ddT ddC 5’ 3’ Phương pháp Sanger- Coulson cải tiến Phƣơng pháp Maxam-Gilbert PP hóa học: dựa vào sự thủy giải đặc trưng của ADN o Tạo ADN sợi đơn từ đoạn ADN cần giải trình tự o Đánh dấu các phân tử ADN ở một đầu o Thực hiện 4 ống phản ứng riêng biệt: G: + dimethyl sulphate  Guanine bị methyl hóa AG: + formic acid  Adenin và Guanine bị methyl hóa TC: + Hydrazine  biến đổi Thymin và Cytosin C: + Hydrazine + 1,5 M NaCl  biến đổi Cytosin o Xử lý 4 ống trên với piperidine 1M/90oC để cắt ADN ở liên kết phosphat kế nucleotid bị biến đổi o Mỗi ống được nạp vào một giếng điện di o Kết quả điện di được đọc và biện luận  trình tự HẾT!