Phương pháp lai

A. Các Phương Pháp LaiI.Dòng tự thụ phấn, dòng cận huyết và hiện tượng thoái hóa giống : 1.Dòng tự thụ phấn, dòng cận huyết : a.Tự thụ phấn ( tự phối ) : - Gặp ở thực vật . - Là trường hợp giao tử đựcvà giao tử cái tham gia thụ phấn là của cùng một hoa lưỡng tính hoặc từ những hoa đơn tính của cùng một cây . b. Giao phối cận huyết : - Gặp ở động vật . - Là sự giao phối giữa những động vật cùng bố mẹ hoặc giữa bố hay mẹ với con của chúng 2.Hiện tượng thoái hóa : a. Khái niệm : - Đối với cây trồng giao phấn khi tiến hành tự thụ phấn bắt buộc qua nhiều thế hệ thì con cháu có sức sống kém dần, sinh trưởng phát triển chậm, chống chịu kém, năng suất giảm, nhiều cây bị chết …- Đối với vật nuôi khi giao phối cận huyết (có quan hệ gần gũi) qua nhiều thế hệ làm xuất hiện hiện tượng thoái hóa, xuất hiện quái thai, dị hình, cơ thể suy yếu, sức đẻ giảm ..Ví dụ : Cây ngô vốn là cây giao phấn nếu tự thụ phấn bắt buộc qua nhiều thế hệ thì chiều cao thân giảm dần, giảm năng suất, có nhiều tính trạng xấu… Ngô lúc đầu Ngô thoái hoá Giống lúa ban đầu Giống lúa thoái hóa b. Nguyên nhân thoái hoá giống : - Khi tiến hành tự thụ phấn bắt buộc hay giao phối cận huyết qua nhiều thế hệ thì : + Tỉ lệ thể dị hợp trong quần thể giảm dần . + Tỉ lệ thể đồng hợp tăng, trong đó, các gen lặn có hại biểu hiện ra. Ví dụ : P: Aa x Aa F1: ¼ AA : 2/4 Aa : ¼ aa c. Vai trò của tự thụ phấn bắt buộc và giao phối cận huyết :- Trong chọn giống người ta dùng các này để củng cố một đặc tính mong muốn nào đó- Tạo ra các dòng thuần chủng- Phát hiện những gen có hại hay có lợi từ đó làm cơ sở để lựa chọn hoặc loại bỏ II.Hiện tượng ưu thế lai : 1. Khái niệm: Ưu thế lai là hiện tượng cơ thể lai ưu việt hơn bố mẹ về sức sống, sức chống chịu, khả năng sinh trưởng phát triển, sinh sản, năng suất, khả năng lợi dụng thức ăn …Ví dụ : P: Lúa trồng x Lúa hoang dại(Năng suất cao, chống chịu kém..) (Năng suất thấp, chống chịu tốt..)F1 : (Năng suất cao và chống chịu với môi trường tốt…) 2. Đặc điểm : - Ưu thế lai biểu hiện trong lai khác thứ, lai khác loài, nhưng rõ nhất trong lai khác dòng, vì : + Phần lớn các gen của cơ thể lai trong lai khác dòng đều ở trạng thái dị hợp, trong đó, các gen trội quy định các trạng thái tốt được biểu hiện. + Cơ thể lai khác dòng có độ đồng đều cao về năng suất và phẩm chất . - Ưu thế lai biểu hiện cao nhất ở F1 và giảm dần ở các thế hệ sau : do có hiện tượng phân tính : tỉ lệ thể dị hợp giảm dần, tỉ lệ thể đồng hợp tăng dần, trong đó, các tính trạng quy định bởi các gen lặn (có hại ) được biểu hiện  3.Nguyên nhân : Có 3 giả thuyết : - Giả thuyết về trạng thái dị hợp :  + Trong cơ thể lai phần lớn các gen nằm ở trạng thái dị hợp trong đó các gen lặn chưa được biểu hiện P : AABBCC x aabbcc F1: AaBbCc + Trong các thế hệ sau tỷ lệ thể dị hợp giảm dần nên ưu thế lai cũng giảm - Giả thuyết về sự tác động cộng gộp của các gen trội có lợi : + Càng nhiều gen trội thì ưu thế lai càng tăng Ví dụ : Lai 1 dòng có 2 gen trội với dòng có 1 gen trội tạo ra dòng có 3 gen trộiP : AabbCC x aaBBcc F1: AaBbCc + Biểu hiện rõ nhất ở trạng thái đa gen . Ví dụ : chiều cao của cây phụ thuộc vào gen trội .- Giả thuyết siêu trội : Do sự tương tác giữa 2 alen khác nhau về chức phận của cùng 1 gen dẫn đến hiệu quả bổ trợ mở rộng phạm vi biểu hiện kiểu hình. Thực tế, thể dị hợp phát triển tốt hơn thể đồng hợp trội. P: AA x aa -> F1: Aa (AAaa) Ví dụ : + Cây truốc lá có kiểu gen aa chịu được nhiệt độ khoảng 100C+ Cây truốc lá có kiểu gen AA chịu được nhiệt độ khoảng 350C+ Cây truốc lá có kiểu gen Aa chịu được nhiệt độ khoảng 100C - 350C 4.Phương pháp tạo ưu thế lai :  a. Lai khác dòng đơn : Tạo dòng thuần chủng ( bằng cách cho tự thụ phấn qua 5-7 thế hệ ) , sau đó cho giao phấn giữa 2 dòng thuần với nhau : P: dòng thuần A x dòng thuần B -> C (ưu thế lai)  b. Lai khác dòng kép :P1: dòng A x dòng B -> C P2: dòng D x dòng E -> F => C x F -> G (ưu thế lai )  c.Lai khác thứ : Tổ hợp vốn gen của 2 hoặc nhiều thứ có kiểu gen khác nhau cũng có hiện tượng ưu thế lai, nhưng ở các thế hệ sau có hiện tượng phân tính , ưu thế lai giảm . d. Lai khác loài (lai xa) : Cho lai 2 cá thể khác loài cũng tạo được ưu thế lai .III. Lai kinh tế :  1.Khái niệm : Người ta cho giao phối cặp bố mẹ thuộc 2 dòng thuần chủng rồi dùng con lai F1 làm sản phẩm không dùng để nhân giống . 2. Ý nghĩa : Nhằm sử dụng ưu thế lai ở con lai F1, nhất là ở vật nuôi ( F1 có sức sống tốt, sức sản xuất thịt, trứng, sữa cao, tăng trọng nhanh, sinh sản khoẻ ...) 3. Cách tiến hành : - Cho phối giữa bố mẹ thuộc 2 giống thuần chủng khác nhau -> dùng con lai F1 làm sản phẩm , không dùng để nhân giống .- Phổ biến ở nước ta hiện nay là dùng con cái thuộc giống trong nước giao phối với con đực cao sản thuộc giống nhập nội .để con lai có khả năng thích nghi với điều kiện khí hậu và chăn nuôi của mẹ, có sức tăng sản của bố.Ví dụ : P: Bò cái vàng Thanh hóa x Bò đực Hà Lan F1 : (Chịu được khí hậu nóng, sản xuất 1000 kg sữa/năm, tỷ lệ bơ 4 – 5 %..)IV. Lai cải tiến giống : 1. Ý nghĩa : Dùng một giống cao sản để cải tiến một giống có năng suất thấp . 2. Cách tiến hành : Ở vật nuôi, ta dùng những con đực cao sản ngoại nhập cho phối với những con cái tốt nhất của giống địa phương . - Dùng một con đực giống cao sản để cải tạo một giống cso năng suất kém qua 4 -5 thế hệ để nâng cao phẩm chất và sản lượng của một giống cần cải tạo gần giống với giônh1 cao sản .- Về mặt di truyền học, phương pháp lai cải tiến giống ban đầu làm tăng tỷ lệ thể dị hợp, sau đó tăng dần tỷ lệ thể đồng hợp trội giống bố .Ví dụ : P : Cái B (nội) x Đực A (ngoại)F1 : Con lai C x Đực A (ngoại)F2 : Con lại D x Đực A (ngoại)F3 : Con lai E x Đực A (ngoại)F4 : Con lai G x Đực A (ngoại) Ở nước ta, các giống lợn (Ỉ, Thuộc nhiêu ) đã được lai cải tiến làm tăng tầm vóc, trọng lượng cơ thể, tỉ lệ nạc trong thịt .V. Lai tạo giống mới ( Lai khác thứ ) : 1. Ý nghĩa : Tổ hợp vốn gen của 2 hay nhiều thứ kết hợp với chọn lọc để tạo giống mới . 2. Cách tiến hành : Lai 2 thứ khác nhau hoặc lai tổng hợp nhiều thứ có nguồn gen khác nhau để tạo biến dị tổ hợp . Phải chọn lọc vì các thế hệ sau có sự phân tính phức tạp .Ví dụ 1: P Giống lúa X1 ( NN 75 – 10 ) x Giống lúa CN2 ( IR 197446 – 11 – 33)(N.suất cao, chống bệnh bạc lá, không kháng rầy..) (N.suất TB, kháng rầy, chất lượng gạo cao..)F1 : Giống lúa VX – 83.( do viện kĩ thuật nông nghiệp tao ra ) Ví dụ 2 : Viện chăn nuôi đã tạo 2 giống lợn mới : Đại bạch x Lợn Ỉ - 81 và Bơcsai x Lợn Ỉ - 81, phối hợp các đặc tính tốt của lợn Ỉ ( mắn đẻ, đẻ nhiều, xương nhỏ, thịt thơm ngon…) với đặc tính lợn ngoại ( tầm vóc to, thịt nhiều nạc, tăng trong nhanh ….)VI.Lai Xa :  1. Khái niệm : Lai xa là hình thức lai giữa các dạng bố mẹ khác xa nhau về nguồn gốc ( khác loài, khác chi, khác họ ..) Lai xa thường gặp khó khăn vì con lai không có khả năng sinh sản hữu tính ( bất thụ )  2. Những khó khăn trong lai xa : - Ở thực vật : + Hạt phấn khác loài không nảy mầm trên vòi nhụy + Nảy mầm nhưng chiều dài ống phấn không phù hợp với chiều dài vòi nhụy nên không thụ tinh được- Ở động vật : + Do chu kì sinh sản khác nhau không phù hợp giữa các loài + Bộ máy sinh dục không phù hợp, tinh trùng khác loài chết trong đường sinh dục cái. *Khó khăn chủ yếu : con lai bất thụ .  3. Hiện tượng bất thụ trong lai xa : a. Nguyên nhân : Do cơ thể lai xa mang 2 bộ NST của hai loài bố mẹ khác nhau về số lượng, hình dạng, cách sắp xếp các gen trên NST, làm cản trở sự tiếp hợp của các cặp NST tương đồng trong kì đầu của giảm phân I, gây cản trở quá trình phát sinh giao tử, con lai bất thụ. Ví dụ : ngựa cái (2n = 64) x lừa đực (2n = 63) → con la (2n = 63) bất thụ. b. Cách khắc phục hiện tượng bất thụ : Tứ bội hoá cơ thề lai xa từ 2n →4n để mỗi NSt đều có NST tương đồng => giaam4 phân diễn ra bình thường, cơ thể lai xa tứ bội có khả năng sinh sản hữu tính. Cơ thể lai xa sau khi tứ bội hoá gọi là thể song nhị bội ( 2n + 2n) : là cơ thể mang bỗ NST lưỡng bội của bố và mẹ, có khả năng giảm phân bình thường, tạo giao tử.Vi dụ : năm 1927 Cacpêsencô đã tiến hành thí nghiệm như sau :P : Cải bắp (2n = 18R) x Cải củ (2n = 18B)GP: n = 9R n = 9BF1: Cải bắp lai ( n + n = 9R + 9B ) : dạng lưỡng bội bất thụ Sau khi tứ bội hoá F1: Cải bắp lai ( 2n + 2n = 18R + 18B ) :dạng song nhị bội hữu thụ  4.Ứng dụng của phương pháp lai xa : - Lai xa có ý nghĩa quan trọng trong chọn giống ở cây trồng sinh sản sinh dưỡng vì không cần giải quyết vấn đề bất thụ. - Trong chọn giống thực vật : phương pháp lai xa kèm theo đa bội hoá dã tạo những giống lúa mì, khoai tây đa bội có sản lượng cao, chống bệnh tốt. Hiện nay , người ta chú ý lai giữa cây dại chống chịu tốt, kháng sâu bệnh với cây trồng có năng xuất cao, phẩm chất tốt. Ví dụ : Lai giữa khoai tây trồng với khoai tây dại →hơn 20 giống mới có năng suất cao , chống bệnh tốt . - Trong chọn giống động vật : tạo được giống mới do lai khác loài ở tằm dâu , cá Ví dụ : lai khác loài trong họ cá chép →cá chép lai 7 tháng nặng 3 kg, dễ nuôi . - Tuy nhiên, đối với vật nuôi, lai xa bị hạn chế vì đa số những động vật có hệ thần kinh phát triển, kiễm soát tập tính giao phối và dễ bị rối loạn NST giới tính .VII.Lai Tế Bào : 1. Khái niệm : Là sử dụng hợp tử 2 tế bào trần khác loài tạo ra tế bào lai chứa 2 NST của 2 tế bào gốc . 2. Cách tiến hành : Dùng dung dịch chứa tổ hợp enzim để phân huỷ màng tế bào , tạo tế bào trần . Cho các tế bào trần vào môi trường nuôi dưỡng các virut Xenđê đã giảm hoạt tính tác động , làm cho các tế bào trần kết hợp với nhau , tạo ra tế bào lai. Dùng môi trường chọn lọc để phân lập các dòng tế bào lai phát triển bình thường . Dùng các hoocmon phù hợp để kích thích tế bào lai phát triển , tạo thành cơ thể lai. Người ta còn dùng keo hữu cơ pilieylen glycol hoặc luồng xung điện cao áp để tăng tỉ lệ kết dính thành tế bào lai. 3. Ứng dụng ; Đã tạo được cây lai từ 2 loài cây thuốc lá, cây lai giữa cây cà chua và cây khoai tây. Trong tương lai, có thể tạo ra những cơ thể có nguồn gen khác xa nhau mà lai hữu tính không thực hiện được. B. Gây đột biến nhân tạo: Đột biến nhân tạo có thể thu được nhiều dạng khác nhau và qua lai tạo có thể góp phần tạo ra vật liệu mới Đột biến nhân tạo có thể làm thay đổi một vài nhược điểm của giống như xuất hiện dạng đột biến đề kháng với tác nhân bất lợi I. CÁC PHƯỜNG PHÁP ĐỘT BIẾN : 1. Gây đột biến bằng tác nhân vật lí: 1.1 Các loại tia phóng xạ: - Các tia phóng xạ gồm tia tia α, β, γ, X, chùm nơron … - Cơ chế gây đột biến : + Khi chiếu xạ vào mô sống chúng kích thích và gây ion hóa các nguyên tử, các phân tử ADN, ARN trong tế bào chịu tác động trực tiếp của các tia phóng xạ hoặc tác động gián tiếp qua sự tác động lên phân tử nước. + Ngoài việc gây đột biến gen các tia phóng xạ cũng gây đột biến NST. - Ứng dụng : Được sử dụng trong chọn giống thực vật bằng cách chiếu xạ với cường độ, liều lượng thích hợp trên hạt khô, hạt nẩy mầm, đỉnh sinh trưởng, hạt phấn, bầu nhụy ….. - Hiệu quả của phương pháp : Phụ thuộc vào tính chất các tia, đặc điểm sinh lí cây trồng, cường độ, liều lượng, thời gian, bộ phận xử lí, cách xử lí, điều kiện ngoại cảnh…. Ví dụ : Ngâm hạt vào nước 220C trong vòng 8h sau đó dùng tia X xử lí Tỷ lệ đột biến tăng gấp 10 lần so với hạt khô không ngâm 1.2. Tia tử ngoại : - Tia tử ngoại là những tia bức xạ có bước sóng ngắn từ 1000 – 4000 A0 - Cơ chế gây đột biến : Chiếu tia tử ngoại vào mô sống sẽ kích thích nhưng không gây ion hóa và được ADN hấp thụ nhiều nhất ở bước sóng 2570 A0. - Ứng dụng : Không có khă năng xuyên sâu nên người ta dùng tia tử ngoại để gây đột biến gen và đột biến NST ở vi sinh vật, bào tử, hạt phấn..... 1.3. Sốc nhiệt : Khi nhiệt độ môi trường tăng hay giảm một cách đột ngột làm cho cơ chế nội cân bằng của cơ thể không khởi động kịp gây chấn thương trong bộ máy di truyền tạo nên đột biến. 2. Gây đột biến bằng tác nhân hóa học : - Các tác nhân hóa học như : 5 – BU, NMU, NEU, DMS, DES, EI, Conxixin,….. - Cơ chế gây đột biến : + Một số hóa chất khi thấm vào tế bào gây biến đổi cấu trúc của ADN gây đột biến gen. Ví dụ : 5 BU gây đột biến thay thế cặp A - T bằng cặp G – X 5BU là 1 hóa chất hóa học có thể thay T liên kết với A ,vừa có thể thay X liên kết với G nên nó gây đột biến thaythế cặp nu A-T bằng cặp G-X+trong quá trình tự nhân đôi ADN,nếu T bị thay bằng 5BU thì sẽ sinh ra đột biến thay thế cặp A-T bằng cặp G-X theo sơ đồ A-T=.>A-5BU=>5BU-G=>G-X + Một số hóa chất cũng có khả năng gây đột biến NST Ví dụ : Khi thấm vào mô đang phân bào dung dịch Conxixin Cản trở sự hình thành thoi vô sắc làm NST không phân li Gây đột biến đa bội thể. Phương pháp này cho hiệu quả cao nhất (cả động vật và thực vật), hiện nay được dùng rất phổ biến. Consixin có công thức hóa học C22H25NO5, là một loại kiềm thực vật, có độc tính cao, rút  ra từ lá cây colchicum autumnale mọc ở bờ Địa Trung Hải, dễ tan trong rượu, benzene và nước. Consixin ngăn cản nhiễm sắc thể di chuyển từ mặt phẳng xích đạo về hai cực tế bào, làm tăng gấp đôi số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào. Người ta thường dùng consixin ở nồng độ 0,1 – 0,2% để xử lý hạt, bôi lên đỉnh sinh trưởng của cây hoặc xử lý tế bào động vật nuôi cấy. - Ứng dụng : + Với cây trồng : Ngâm hạt khô, hạt đang nẩy mầm trong dung dịch hóa chất hoặc tiêm vào bầu nhụy hoặc tẩm hóa chất lên các đỉnh sinh trưởng .... + Với vật nuôi : Cho các hóa chất tác dụng lên tinh hoàn, buồng trứng. -Hiệu quả của phương pháp : Phụ thuộc vào loại hóa chất, đặc điểm sinh lí cây trồng, cường độ, liều lượng, thời gian, bộ phận xử lí, cách xử lí, điều kiện ngoại cảnh…. II. SỬ DỤNG ĐỘT BIẾN TRONG CHỌN GIỐNG : Chọn giống vi sinh vật : Ví dụ : Bào tử nấm penicilum xử lí bằng tia phóng xạ rồi chọn lọc à Chủng penicilum có hoạt tính penicilin tăng gấp 200 lần so với dạng ban đầu. Ví dụ : Xử lí nấm mem, vi khuẩn bằng tia phóng xạ tạo ra các chủng năng xuất cao hoặc những chủng VSV đóng vai trò kháng nguyên gây miễn dịch cho cơ thể vật chủ, trên nguyên tắc đó tạo văcxin phòng bệnh cho người và gia súc Trong chọn giống cây trồng: Ví dụ 1 : Viện di truyền nông nghiệp xử lí giống lúa Mộc Tuyền bằng tia gama tạo giống lúa MT1 xó nhiều đặc tính tốt : Chín sớm, thấp và cứng cây, chịu chua, chịu phân, năng suất tăng 15 – 25%. Ví dụ 2 : Viện lương thực thực phẩm đã xử lí giống táo Gia Lộc (hải dương) bằng tác nhân NMU tạo ra giống táo Má Hồng cho 2 vụ/năm, quả giòn, ngọt, thơm trung bình 50 – 60 quả/kg. Ví dụ 3 : Tạo giống dâu tằm tam bội số 11 và 34 năm 1990 cho lá to và dày. Giống dưa hấu tạm bội sản lượng cao quả ngọt, to, không hạt …. 3. Trong chọn giống vật nuôi: Phương pháp đột biến sử dụng hạn chế ở động vật vì cơ quan sinh sản nằm sâu trong cơ thể rất dễ bị chết khi xử lí bằng các tác nhân gây đột biến ội thể bằng xử lý consixin. C. Kỹ thuật di truyền: ADN tái tổ hợp Trong công nghệ gen, để đưa một gen từ tế bào này sang tế bào khác cần phải sử dụng một phân tử AND đặc biệt được gọi là thể truyền. Kĩ thuật gắn gen cần chuyển vào thể truyền gọi là kĩ thuật tạo AND tái tổ hợp AND tái tổ hợp là một phân tử AND nhỏ, được lắp ráp từ các đoạn AND lấy từ các nguồn khác nhau (gồm thể truyền và gen cần chuyển). AND tái tổ hợp đầu tiên được tạo ra năm 1972 trên cơ sở các thành tựu Di truyền học và hóa sinh học như: chứng minh được AND là vật chất mang thông tin di truyền (1944) và thông tin di truyền được mã hóa trong các trình tự base của nó (1956), tách chiết được enzyme giới hạn (1970), và enzyme AND ligase (1967). Sự hoàn thiện kĩ thuật tái tổ hợp AND hay tạo AND tái tổ hợp đã mở đường cho sự ra đời một lĩnh vực công nghệ mới được gọi là công nghệ AND tái tổ hợp (recombinant DNA technology). Kĩ thuật di truyền - Khái niệm: Kĩ thuật di truyền hay kĩ thuật gen (genetic engineering) là kĩ thuật thao tác trên vật liệu di truyền dựa vào những hiểu biết về cấu trúc hoá học của các axid nucleic và di truyền vi sinh vật. - Phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là kĩ thuật cấy gen, tức là chuyển một đoạn ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận bằng cách dùng plasmid làm thể truyền. Kĩ thuật chuyển gen có 3 khâu chủ yếu: + Tách AND mang gen mong muốn từ dạng cho và AND dùng làm vector. Tách các loại AND từ bộ gen. Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi. Người ta dùng biện pháp lắc cơ học, dùng enzyme cắt restrictase để cắt AND bộ gen thành các đoạn nhỏ dài khoảng 15 000 đến 20 000 cặp base. Bằng các phương pháp tách chiết AND và các đoạn mồi thích hợp người ta đã tách chiết được một số dạng AND của dạng cho với các gen mong muốn ở vật nuôi, cây trồng và con người (gen kiểm soát tổng hợp insulin, hormone sinh trưởng…). - Ngoài ra còn có các phương pháp: sinh tổng hợp gen từ mRNA của gen tương ứng và tổng hợp gen bằng các phương pháp hóa học. + Cắt và nối để tạo AND tái tổ hợp Sinh học phân tử đã phát hiện và hiểu rõ cơ chế tác động của hàng loạt enzyme. Nhờ đó, các nhà khoa học đã sử dụng chúng thành những công cụ hữu hiệu trong việc cắt (dùng restrictase) và nối (dùng ligase) để tạo AND tái tổ hợp. Các enzyme giới hạn còn gọi là các enzyme cắt giới hạn. Mỗi loại enzyme cắt giới hạn sẽ cắt hai mạch đơn của phân tử AND ở những vị trí nucleotide xác định. Các vị trí này gọi là trình tự nhận biết. Kết quả là tạo các đầu dính. Việc cắt AND của tế bào cho và AND của plasmid do cùng một loại enzyme cắt giới hạn. Kết quả tạo ra các đầu dính có trình tự giống nhau. Khi trộn đoạn AND của tế bào cho với AND plasmid đã cắt hở, các đầu dính bắt cặp bổ sung với nhau. Enzyme nối (ligase) có chức năng tạo liên kết phosphodiester làm liền mạch AND. Plasmid mang gen lạ gọi là AND tái tổ hợp. Trong kĩ thuật chuyển gen, ngoài enzyme cắt và enzyme nối còn có các enzyme sửa đổi AND. Các enzyme sửa đổi AND này có tác dụng phân hủy, tổng hợp và biến đổi AND, làm cho AND bị sửa đổi giống với AND của vật chủ. Để chuyển một gen mong muốn từ sinh vật này sang sinh vật khác, người ta sử dụng các vật chuyển gen hay vector chuyển gen. Vector chuyển gen là phân tử AND có khả năng tự nhân đôi, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được gen cần chuyển. Có nhiều loại vector chuyển gen như Plasmid nằm trong tế bào chất của vi khuẩn, là AND vòng, mạch kép. Trong tế bào vi khuẩn có chứa hàng chục plasmid. Vector chuyển gen cũng có thể là thể thực khuẩn λ (phage λ), đó là virus lây nhiễm vi khuẩn, đoạn AND của tế bào cho (gen cần cấy) được gắn vào AND của nó thành AND tái tổ hợp. + Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận. Phương pháp biến nạp: để đưa AND tái tổ hợp vào trong tế bào, các nhà khoa học có thể dùng muối CaCl2 hoặc dùng xung điện để làm dãn màng sinh chất của tế bào. Khi đó, phân tử AND tái tổ hợp dễ dàng chui qua màng vào trong tế bào. Trường hợp thể truyền là virus lây nhiễm vi khuẩn, khi chúng mang gen cần chuyển và xâm nhập vào tế bào vật chủ (vi khuẩn) được gọi là phương pháp tải nạp. Khi đã chuyển được vào tế bào chủ, AND tái tổ hợp điều khiển tổng hợp loại protein đặc thù đã được mã hóa trong nó. Tách dòng tế bào chứa AND tái tổ hợp. Để nhận biết được tế bào vi khuẩn nào đã nhận được AND tái tổ hợp, các nhà khoa học phải chọn thể truyền có các dấu chuẩn hoặc các gen đánh dấu. Nhờ đó mới có thể nhận biết sự có mặt của AND tái tổ hợp. Gen đánh dấu có thể là gen kháng kháng sinh. Ví dụ, tế bào nhận là loại mẫn cảm với chất kháng sinh (như tetracycline). Khi plasmid đã được chuyển gen có gen kháng với tetracycline vào trong tế bào mẫn cảm, nó sẽ trở nên kháng được thuốc kháng sinh. Do đó, khi bổ sung tetracycline vào môi trường nuôi, tất cả các tế bào không chứa AND tái tổ hợp sẽ bị chết, trong bình nuôi lúc này chỉ còn lại các tế bào có chứa AND tái tổ hợp. Dòng tế bào này được nuôi để sản xuất ra sản phẩm mong muốn. Công nghệ di truyền Công nghệ di truyền hay còn gọi là công nghệ gen là một ngành kỹ thuật hay một lĩnh vực công nghệ về quy trình ứng dụng kỹ thuật gen, gồm 4 bước: Tạo ra các đoạn AND mang gen mong muốn và tách các phân tử ADN dùng làm vector. Tạo ADN tái tổ hợp bằng cách nối. Đưa AND tái tổ hợp vào tế bào chủ để nhân lên (tách dòng). Chọn lọc đoạn trình tự quan tâm. Ứng dụng công nghệ di truyền Thành tựu nổi bật nhất trong ứng dụng công nghệ di truyền là khả năng cho tái tổ hợp thông tin di truyền giữa các loài đứng xa nhau trong bậc thang phân loại mà lai hữu tính không thể thực hiện được. Công nghệ gen được ứng dụng nhằm tạo ra các sinh vật chuyển gen. Sinh vật chuyển gen là các cá thể được bổ sung vào bộ gen của mình những gen đã được tái tổ hợp hoặc những gen đã được sửa chữa, do đó còn gọi là sinh vật biến đổi gen. Sản phẩm của sinh vật biến đổi gen phục vụ tốt hơn cho cuộc sống của con người cả về số lượng và chất lượng. Tạo giống vi sinh vật Tạo chủng vi khuẩn E. coli sản xuất insulin của người Insulin là hormone tuyến tụy, có chức năng điều hòa glucose trong máu. Trường hợp insulin do cơ thể sản xuất ra không đủ hoặc mất chức năng sẽ gây bệnh đái tháo đường, glucose bị thải qua nước tiểu. Gen tổng hợp insulin được tách ra từ cơ thể người và chuyển vào vi khuẩn E. coli bằng vector là plasmid. Sau đó vi khuẩn này được sản xuất ở quy mô công nghiệp, tổng hợp ra insulin giống như trong cơ thể người với số lượng lớn hơn rất nhiều, đáp ứng được nhu cầu thuốc chữa bệnh của con người. Tạo chủng vi khuẩn E. coli sản xuất somatostatin somatostatin là loại hormone đặc biệt, được tổng hợp trong não động vật và người, với số lượng rất ít, tại vùng dưới đồi thị. Hormon này có chức năng điều hòa hormone sinh trưởng và insulin đi vào trong máu. Gen mã hóa somatostatin được tổng hợp in vitro. Sau đó bằng công nghệ gen, gen này được gắn vào AND plasmid và đưa vào vi khuẩn. Cứ 7,5 lít dịch nuôi E. coli có AND tái tổ hợp như trên sản xuất được 5 milligram somatostatin nguyên chất. Để có được khối lượng này bằng cách tách chiết não cừu như trước đây vẫn làm thì phải giết thịt 500 000 con. Tạo giống thực vật Tạo giống bằng công nghệ gen mở ra nhiều ứng dụng mới cho trồng trọt: sản xuất các chất bột – đường với năng suất cao, sản xuất các loại protein trị liệu, các kháng thể và chất dẻo. Thời gian tạo giống mới rút ngắn đáng kể. Đến nay đã có trên 1200 loại thực vật đã được chuyển gen. Trong số đó có khoảng 290 giống cây cải dầu (Brassica napus), 133 giống cây khoai tây và nhiều loại khác như cà chua, ngô, lanh, đậu nành, cây bông vải, củ cải đường… Do tế bào thực vật có thành cellulose cứng nên các nhà nghiên cứu đã tìm ra nhiều cách khác nhau để đưa gen vào bên trong tế bào. Phương pháp chuyển gen ở thực vật rất đa dạng: chuyển gen bằng plasmid (ví dụ: Ti-plasmid), bằng virus (virus khảm thuốc lá), chuyển gen trực tiếp qua ống phấn, dùng súng bắn gen… Cà chua chuyển gen Tạo giống cây biến đổi gen có sản phẩm được bảo quản tốt hơn cũng được các nhà khoa học quan tâm. Ví dụ: giống cà chua có gen sản sinh ra etylen đã được làm bất hoạt, khiến cho quá trình chin của quả bị chậm lại nên có thể vận chuyển đi xa hoặc để lâu mà không bị hỏng. Cà chua được chuyển gen kháng virus góp phần giảm sử dụng thuốc hóa học diệt côn trùng gây bệnh, hạn chế gây ô nhiễm môi trường. Lúa chuyển gen tổng hợp β-carotene Gạo của giống lúa này chứa β-carotene, sau quá trình tiêu hóa ở cơ thể người, β-carotene được chuyển hóa thành vitamin A. Tạo giống động vật Sử dụng công nghệ gen để tạo ra những giống động vật mới có năng suất và chất lượng sản phẩm cao hơn, đặc biệt, tạo ra động vật chuyển gen có thể sản xuất ra thuốc chữa bệnh cho con người. Vi tiêm là phương pháp thông dụng nhất trong kỹ thuật chuyển gen ở động vật. Đoạn AND được bơm thẳng vào hợp tử ở giai đoạn nhân non (giai đoạn của tinh trùng và trứng chưa hòa hợp). Sử dụng tế bào gốc: trong phôi có những tế bào có khả năng phân chia mạnh, các tế bào này được lấy ra và được chuyển gen rồi lại cấy trở lại vào phôi. Ở một số đối tượng động vật, người ta còn sử dụng phương pháp dùng tinh trùng như vector mang gen. Người ta bơm đoạn AND vào tinh trùng, tinh trùng này sẽ mang đoạn AND vào tế bào trứng khi thụ tinh. Tạo giống cừu sản xuất protein của người Cừu được chuyển gen tổng hợp protein huyết thanh của người sẽ sản xuất ra sản phẩm này với số lượng lớn trong sữa của chúng. Sau đó, sản phẩm này được chế biến thành thuốc chống u xơ nang và một số bệnh về đường hô hấp ở người. Tạo giống bò chuyển gen Có 2 cách đưa gen mong muốn vào hợp tử: Vi tiêm và dùng phương pháp cấy nhân có gen đã cải biến. Ví dụ: bò được chuyển gen sản xuất r-protein của người và gen này được biểu hiện ở tuyến sữa, có thể cho sản phẩm với số lượng lớn. Từ sữa có sản phẩm này, qua chế biến sản xuất ra protein C chữa bệnh máu vón cục gây tắc mạch ở người. D. Các phương pháp chọn lọc: Hệ số di truyền: Hệ số di truyền là tỉ lệ giữa biến dị kiểu gen và biến dị kiểu hình tính bằng phần trăm (%) hoặc bằng số thập phân từ 0 đến 1. Ví dụ: Hệ số di truyền của sản lượng trứng của gà Lơgo là 9 – 22%. Hệ số di truyền khối lượng trứng của gà Lơgo là 39 – 93%. (Nghĩa là: Tính trạng sản lượng trứng phụ thuộc nhiều vào môi trường nuôi dưỡng; tính trạng khối lượng trứng phụ thuộc ít vào môi trường nuôi dưỡng, phụ thuộc nhiều vào kiểu gen) Chọn lọc hàng loạt (Mass selection): Cách tiến hành:    Trong 1 quần thể vật nuôi hay cây trồng, dựa vào kiểu hình người ta chọn ra một nhóm cá thể phù hợp nhất với mục tiêu chọn lọc để làm giống.    Ở cây trồng, hạt của những cây đã chọn được thu hoạch chung, trộn lẫn với nhau để trồng trong vụ sau. Ở vật nuôi, những cá thể có ngoại hình đẹp, lớn nhanh, đẻ tốt được chọn ra để nhân giống. Việc so sánh năng suất trung bình của vụ sau so với giống ban đầu cho phép đánh giá hiệu quả chọn lọc.    Tuỳ theo vật liệu khởi đầu, yêu cầu và hiệu quả chọn lọc, có thể tiến hành chọn lọc hàng loạt 1 lần hay phải lặp lại nhiều lần.    Từ lâu nông dân ta đã chọn lọc hàng loạt đối với cây lúa theo 3 tiêu chuẩn: khóm tốt, bông tốt, hạt tốt. Giống cải củ số 9 được Viện Cây lương thực thực phẩm chọn lọc hàng loạt từ giống cải củ Hồng Kông nhập vào nước ta năm 1980, có thời gian sinh trưởng 40 – 45 ngày, khối lượng củ trung bình 230g, năng suất 35 – 40 tạ/ha.    Trong chăn nuôi phương pháp chọn lọc hàng loạt đã góp phần tạo ra những giống có năng suất cao về sữa, trứng, thịt, len. Phạm vi ứng dụng:    Đối với những cây tự thụ phấn, có khi chỉ chọn lọc 1 lần đã mang lại hiệu quả. Đối với những cây giao phấn vì quần thể có kiểu gen không đồng nhất, các thế hệ sau có sự phân tính, nên thường phải chọn lọc hàng loạt nhiều lần.    Chọn lọc hàng loạt là phương pháp hữu hiệu để duy trì chất lượng và năng suất của giống khi đưa vào sản xuất đại trà qua nhiều vụ, để phục tráng những giống đã khu vực hoá va` để cung cấp giống cho sản xuất. Ưu, nhược điểm:    Phương pháp chọn lọc hàng loạt đơn giản, dễ làm, ít tốn kém nên có thể áp dụng rộng rãi. Phần lớn các giống tốt ở các địa phương là do nhân dân sáng tạo ra trong thực tiễn sản xuất nông nghiệp bằng phương pháp đó.    Nhược điểm của phương pháp này là chỉ căn cứ trên kiểu hình, không kiểm tra được kiểu gen của cá thể nên việc củng cố, tích luỹ các biến dị tốt chậm đưa đến kết quả. Ta biết rằng mỗi tính trạng trên cơ thể đều phụ thuộc 2 yếu tố: gen và môi trường. Tuy nhiên, tỷ trọng của mỗi yếu tố này là khác nhau tuỳ từng tính trạng, biểu thị ở hệ số di truyền. Hệ số di truyền cao nói lên rằng tính trạng phụ thuộc chủ yếu vào gen, ảnh hưởng của môi trường là ít. Ngược lại, hệ số di truyền thấp, chứng tỏ tính trạng chịu ảnh hưởng nhiều của môi trường. Ví dụ hệ số di truyền sản lượng trứng gà Lơgo là 9 – 22%, khối lượng trứng gà là 36 – 93%, sản lượng sữa bò 1 kỳ vắt sữa là 25 – 38%, hàm lượng mỡ trong sữa bò là 33 – 57%. Phương pháp chọn lọc hàng loạt thường chỉ dễ có hiệu quả đối với tính trạng có hệ số di truyền khá cao.    Trong khi chọn lọc một loạt cây tốt có thể lẫn lộn các kiểu hình tốt do kiểu gen tốt với những thường biến do các yếu tố vi địa hình, vi khí hậu. Để khắc phục điều này, người ta cố gắng tiến hành chọn lọc hàng loạt trên các chân ruộng đồng đều về địa hình, độ phì của đất. Chọn lọc cá thể: Cách tiến hành:    Trong quần thể khởi đầu người ta cũng chọn lấy một số ít cá thể tốt nhất nhưng điều sai khác căn bản so với chọn lọc hàng loạt là ở chọn lọc cá thể con cháu của những cá thể này được nhân lên một cách riêng rẽ theo từng dòng, do đó kiểu gen của mỗi cá thể ban đầu sẽ được kiểm tra qua nhiều thế hệ. Sự so sánh giữa các dòng và so sánh với giống khởi đầu sẽ cho phép chọn được những dòng tốt nhất, loại bỏ những dòng không đáp ứng mục tiêu chọn giống. Phương pháp chọn lọc cá thể có thể được tiến hành 1 lần hay nhiều lần.    Ví dụ, giống đậu tương 138 được chọn lọc từ tổ hợp lai Cọc chùm x V73 bằng phương pháp chọn lọc cá thể tại Viện cây lương thực thực phẩm, đưa vào khảo nghiệm năm 1981, có thân cao, phân nhánh ít, quả to, ít đổ, chống sâu bệnh khá, thời gian sinh trưởng 95 – 100 ngày, năng suất 12 – 16 tạ/ha. Phạm vi ứng dụng:    Khi mục tiêu chọn lọc là loại tính trạng có hệ số di truyền thấp thì phải áp dụng phương pháp chọn lọc cá thể. Chọn lọc cá thể một lần được áp dụng cho các cây nhân giống vô tính và các cây tự thụ phấn. Dòng tự thụ phấn có kiểu gen khá đồng nhất và ổn định nên có khi chỉ chọn lọc cá thể 1 lần la` đã có kết quả.    Đối với cây giao phấn, nếu muốn áp dụng chọn lọc cá thể thì phải tiến hành nhiều lần. Trong quần thể giao phấn rất khó xác địng cây bố, và con cháu của 1 cây ban đầu thường không đồng nhất về kiểu gen và kiểu hình, do đó chọn lọc cá thể 1 lần không đủ để đánh giá.    Đối với vật nuôi, người ta kiểm tra đực giống qua đời sau. Con đực không thể cho sữa, trứng, nhưng ảnh hưởng đến 1 số lượng lớn con cháu, trong đó có cả đực và cái, thuận lợi cho việc đánh giá. Một bò đực giống ở trạm thụ tinh nhân tạo có thể cho 25 ngàn con bê trong 1 năm. Ngày nay phương pháp kiểm tra qua đời con được bổ sung bằng những phân tích hoá sinh, tế bào trên con đực giống.    Trong chăn nuôi gia cầm, người ta còn áp dụng phương pháp kiểm tra qua đời sau đối với con mái.  Ưu, nhược điểm:    Chọn lọc cá thể kết hợp được việc đánh giá dựa trên kiểu hình với việc kiểm tra kiểu gen, do đó nhanh chóng đạt hiệu quả, nhất là khi mục tiêu chọn lọc là những tính trạng chỉ có lợi cho người mà ít có lợi cho bản thân sinh vật như hàm lượng dầu trong hạt hướng dương, tỷ lệ bơ trong sữa bò.    Tuy nhiên chọn lọc cá thể đòi hỏi công phu, theo dõi chặt chẽ, khó áp dụng rộng rãi. Chọn lọc theo họ (Family selection): Chọn một số lượng lớn cá thể và trồng hạt mỗi cây riêng và đời tiếp theo thành họ để so sánh với nhau, từ đó lựa chọn họ tốt nhất để tạo thành giống mới. Kết quả phụ thuộc vào thành phần di truyền giàu hay nghèo của giống địa phương ban đầu. Chọn lọc theo học có giá trị hơn cả khi mức di truyền của tính trạng thấp và các họ có sự giống nhau nhiều do họ hàng gần. Sự tự phối trong từng họ sẽ làm rõ các khác biệt giữa các họ. Thử nghiệm thế hệ (Progeny test): Là phương pháp đánh giá giá trị chọn lọc căn cứ và kiểu hình của hậu thế ở động vật. Phương pháp này có giá trị hơn cả đối với các tính trạng: Chỉ biểu hiện ở một giới tính (ví dụ: đánh giá các gen tạo sữa ở bò đực) Chỉ có thể đo được sau khi giết thịt (ví dụ: các đặc tính của bộ sương động vật nuôi) Có mức di truyền thấp Chỉ có thể thực hiện khi cá thể trưởng thành. Để đánh giá con đực, nó cần được giao phối với vài con cái. Con đực càng có nhiều thế hệ con thì sự đánh giá càng chính xác. E. Công nghệ protein: I. Công nghệ protein là gì? -Công nghệ protein là quá trình xây dựng các phân tử protein mới, bằng cách thiết kế một phân tử protein dựa trên các nguyên lý cơ bản nhất, hoặc sửa đổi cấu trúc của một protein đang có, nhằm mục đích : Nghiên cứu quá trình lắp ráp của các protein và các nhân tố của chuỗi sơ cấp tham gia vào sự cuộn xoắn, ổn định và thể hiện chức năng của chúng. Sàn xuất các protein ổn định cho một mục đích công nghệ đặc biệt, tuy nhiên các phiên bản được tìm thấy trong tự nhiên không có các tính chất tối ưu cần thiết. Vd : một enzyme có thể được xem như một phần của quá trình công nghiệp nhưng một điểm đặc trưng của enzyme, chẳng hạn độ ổn định nhiệt hoặc là độ pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác … không thể tương thích với quá trình đó. -Muốn công nghệ hóa một protein cần phải hiểu biết về các nguyên lý cấu trúc của proein đó và đặc điểm của nguyên liệu để thiết kế hợp lý, hoặc sửa đổi các tính chất mong muốn. hơn nữa, công nghệ này phải có được các công cụ sản xuất và phân tích protein mong muốn. Các công cụ và nguyên lý cơ bản hiện nay đang được phát triển song song. II. Các công cụ. Nhận dạng trình tự : là quá trình bằng cách phân tích trình tự gen hoặc protein. Phân tích trình tự genome đang cung cấp các trình rự mới và các khung đọc mở (open reading frame) lên liên tục. Xác định cấu trúc và mô hình hóa : Các thông số và cấu trúc có độ phân giả cao, được xác định bằng tia X hoặc tinh thể hoc điện tử( electron crystallography) hoặc kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance-NMR), là điểm cốt lõi của sự hiểu biết hóa sinh về protein. Biến đổi trình tự : Là biến đổi một protein bẳng cách sửa đổi trình tự gen. Các phương pháp. Phương pháp biến đổi trực tiếp protein bằng phát sinh đột biến điểm định hướng oligonucleotide theo phương thức tổng hợp gen hoàn chỉnh từ các oligonucleotide primer. Dùng phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Các phương pháp nói trên chỉ giới han cho cá amino acid được mã hóa bởi gen. Tuy nhiên, nhiều trình tự cũng có thể được tạo ra bằng cách tổng hợp protein theo phương pháp hóa học trong điều kiện in vitro, phương pháp này cũng cho pháp hợp nhất các aminno acid không được mã hóa trong chuỗi protein. Các phương pháp phát sinh đột biến điểm định hướng : Có 2 phướng pháp cơ bản để sửa đổi một trình tự mã hóa đang tồn tại của protein ở mức độ DNA. Cả 2 phương pháp đều đòi hỏi gắn một hoặc nhiều oligonucleotide (ít nhất là tạm thời) trên DNA sợi đơn, sau đó hoạt tính DNA polymerase in vitro sẽ xúc tác để mở rộng các oligonucleotide này. Hai phương pháp đó là : Phương pháp không dùng PCR : Ở phương pháp không dùng PCR, trình tự DNA được biến đổi liên kết với gốc tái bản. Vd : plasmid, bacteriophage hoặc phagemid. Cho phép khuếch đại in vivo kiểu gen bố mẹ hoặc kiểu gen đã được sửa đổi. Một oligonucleotide tổng hợp mang đột biến cần thiết được gắn với khuôn mẫu ssDNA mạch vòng, hoặc với một khuôn mẫu dsDNA đã được sợi đơn hóa từng phần. Sử dụng nhiều phương pháp enzyme khác nhau có thể tạo ra khuôn mẫu ssDNA từng phần. HÌNH: Các oligonucleotide được gắn hoạt động như một primer cho sự tổng hợp in vitro DNA bằng cách dùng enzyme DNA polymerase,cùng với sự hiện diện enzyme DNA ligase, các phân tử DNA sợi đôi mạch vòng đóng sẽ được tạo ra. DNA sợi đôi được đưa vào trong các tế bào vật chủ thích hợp để tái bản và phân chia. Sau đó, sự biến đổi mong muốn được xác định bằng 1 trong số phương thức sàng lọc hoặc chọn lọc. Phương pháp dựa trên PCR: Phương pháp dựa trên cơ sơ PCR cho phép thực hiện sự biến đổi mong muốn và khuếch đại in vitro bằng cách gắn DNA đích được biến tính với 1 oligonucleotide mang đột biến cần thiết có thể hoạt động như 1 primer cho sự tái bản sợi DNA bổ sung . HINH Phát triển phân tử: đây là phương pháp để sản xuất và thử nghiệm các tập hợp biến thể của một trình tự đặc biệt. phương pháp này dựa vào ba đặc điểm chính: Đó là nucleic acid mã hóa cho trình tự protein quna tâm duy trì liên kết vật lý với protei. Một phương pháp được phát triển để tạo ra một số lượng lớn các biến thể bằng cách đưa các đoạn oligonucleotode thoái biến vào trong trình tự mã hóa theo phương thức chèn đoạn cassette hoặc dùng kỹ thuật PCR, hoặc bằng phương thức phát sinh đột biến in vitro. Tuy nhiên chỉ có một đoạn nhỏ protein được sửa đổi. Các phương pháp này đòi hỏi một phương thức sàng lọc hoặc chọn lọc các trình tự protein mới có kiểu hình quan tâm. Phương thức này cũng đòi hỏi có sự xúc tác và kết quả là các protein xuất hiện và được giữ lại trên các giá thể rắn. Biểu hiện. Sự biểu hiện của các protein tái tổ hợp là một công việc vô cùng phức tạp và các hệ thống biểu hiện vật chủ ở trong phạm vi từ vi khuẩn tới nấm men, các tết bào côn trùng và các nuôi cấy tế bào động vật có vú và cuối cùng tới động-thực vật chuyển gen. phân tích. Khi một chức năng được sửa đổi thì một phương pháp thử nghiệm sinh học thích hợp có thể được phát triển để xác định khả năng của protein mới được sản xuất. III. Ứng dụng của công nghệ protein. các đột biến điểm. Vd1: sản xuất interferon β-1b. proein này được tạo ra bởi su75bthay thế của cysteine cho Serine ở gốc thứ 17 của phân tử interferon β dài 154 amino acid.protein được tổng hợp hiểu hiện trong E.coli một hoạt tính đặc trưng gần với interferon β tự nhiên có nguồn gốc từ fibroblast. Vd2: Humalog là một dạng biến đổi gen của insulin người trong đó 2 gốc ở C-terminus của chuỗi B, proline và lysine ở cá vị trí 28 và 29, tương ứng, được đỏa ngược thứ tự của chúng. Sắp xếp lại vùng (liên kết, trao đổi và xóa bỏ) Hầu hết các protein lớn do các vùng cuộn soắn độc lập nhỏ hơn tạo thành. Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, người ta có thể bổ sung hoặc laoi5 bỏ các vùng từ một protein này tới protein khác để xây dựng lại các phân tử protein. . Các vùng liên kết. 2.1.1. các dung hợp vùng cho tế bào đích. Vd: dung hợp gen enzyme-kháng thể được thực hiện bằng cách dùng trình tự DNA mã hóa cho thành phần chuỗi nặng của Fab của kháng thể để liên kết nó với trình thự mã hóa cho nuclease của khuẩn tụ cầu hoặc trình tự mã hóa cho DNA polymerase của E. coli. Các gen dung hợp sau khi được chuyển vào tế bào sản xuất chuỗi nhẹ của kháng thề đã biểu hiện và khôi phục lại cả hoạt tình enzyme và liên kết kháng nguyên 2.1.2. các cytokine được dung hợp. Liên kết các cytokine bằng cách dung hợp các gen trong khung buộc hai nhóm chức năng lại với nhau và có thể về nguyên tắc dẫn đến hiệu quả sinh học mong muốn ở các liều thấp hơn nếu được thực hiện riêng rẽ. Vd: gần đây là PIXY321 , một dạng dung hợp của GM-CSF và IL-3. Nấm men biểu hiện PIXY321 cho thấy ái lực thụ thể đã được tăng cường , hoạt tính sinh sản và hoạt tính kích thích tạo khuẩn lạc cũng đã được so sangh1 với một trong số các protein khởi đầu monomer. 2.2. Trao đổi vùng proetin. Là phương pháp trao đổi các vùng hoàn chỉnh, trong đó cá vùng tương tự của các nguồn khác nhau được trao đổi trong một protein đa vùng để cung cấp một chức năng mới. 2.2.1. các kháng thể khảm người-chuột ở đây các vùng liên kết kháng nguyên ở kháng thể đơn dòng của chuột được gắn với các vùng không thay đổi của một kháng thể người. Sự chuyên đổi này có thể làm giảm rõ rệt khả năng tạo miễn dịch không mong muốn so với kháng thể gốc của chuột. 2.2.2. Xóa các vùng. Hoạt tố plasminogen mô (tPA) là môt serine protease tách chiết từ các tế bào màng trong. Sau khi liên kết với fibrin, tPA hoạt hóa plasminogen thành plasmin đây là yếu tố phân giả huyết khối cục bộ. Reteplase là một dạng biến thể mà 3 trong 5 vùng của tPA đã bị xóa. V. sản xuất protein trên quy mô rộng lớn. Nuôi cấy các vi sinh vật trên quy mô rộng lớn là phương pháp kinh tế nhất có các ưu điểm sau: Sử dụng các môi trường đơn giản, rẻ tiền. Ác chu kỳ lên men ngắn ngày Có thể kiểm soát trạng thái sin lý của svs trong quá trình lên men và đảm bảo được tính đồng nhất của ac1c mẻ lên men. Có thể kế hoạch hóa việc thu hoạch protein một cách một cách hợp lý, phù hợp với các quá trình phân tách và tinh sạch đầu ra. Hiệu suất protein có thể được tăng lên nhiều lần bằng cách cải thiện các chủng truyền thống và phát triển quá trình lên men, cùng với việc sử dụng thêm công nghệ DNA tái tổ hợp. Các enzyme của các dạng vi sinh vật sống ở điều kiện khắc nghiệt nhờ kỹ thuật tái tổ hợp DNA nay có thể sinh trưởng thuận lợi trong các nuôi cấy mesophilic và có thể sản xuất các enzyme với các đặc tính chịu nhiệt hoặc chịu muối ở nồng độ cao. F. Công nghệ tế bào: I. Khái niệm công nghệ tế bào: Công nghệ tế bào là ngành kỹ thuật về quy trình ứng dụng phương pháp tế bào hoặc mô để tạo cơ quan hoặc cơ thể hoàn chỉnh. Công nghệ tế bào gồm 2 công đoạn chính: Tách tế bào từ cơ thể rồi nuôi cấy ở môi trường dinh dưỡng để tạo mô sẹo. Dùng hoocmon sinh trưởng để kích thích mô sẹo phân hóa thành cơ quan hoặc cơ thể hoàn chỉnh. (mô sẹo là khối tế bào không có tổ chức hình thành từ các mô và các cơ quan phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt như có vết thương, xử lý bằng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật… các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này phải chịu một sự phân hóa trước lần đầu tiên phân chia, biệt hóa thành những mô khác nhau và tái sinh thành cây trưởng thành) Các cơ quan hoặc cơ thể hoàn chỉnh có kiểu gen như dạng gốc vì cơ thể hoàn chỉnh được sinh ra từ 1 tế bào của dạng gốc có bộ gen nằm trong nhân tế bào và được sao chép trong quá trình sinh trưởng. Mục đích và cơ sở di truyền học của ngành CNTB:- Mục đích: Tạo ra những mô, cơ quan hay cơ thể hoàn chỉnh với đầy đủ các tính trạng của cơ thể gốc. - Cơ sở di truyền học: Cơ thể con được tạo thành qua quá trình nguyên phân có bộ NST 2n sao chép nguyên vẹn từ bộ NST 2n của cơ thể gốc. II. Ứng dụng công nghệ tế bào: Nhân giống vô tính trong ống nghiệm (vi nhân giống) ở cây trồng: Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô thực vật: dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật, có nghĩa là bất kì tế bào hoặc mô nào của cơ thể như thân, lá, rễ… của thực vật đều có chứa bộ gen quy định kiểu gen của loại cây đó và chúng đều có khả năng sinh sản vô tính để tạo thành cây trưởng thành Quy trình công nghệ nhân giống cây bằng nuôi cấy mô thực vật: Chọn vật liệu nuôi cấy à Khử trùng à Tạo chồi à Tạo rễ à cấy cây trong môi trường thích hợp à trồng cây ở vườn ươm. Ví dụ: Nhân giống vô tính mía, khoai tây, dứa, phong lan, bạch đàn, nhân sâm, sinh địa… Nhân giống vô tính trong ống nghiệm có ưu điểm: Tăng nhanh số lượng cây trồng. Rút ngắn thời gian tạo cây con. Bảo tồn một số nguồn gen thực vật quý hiếm. Ứng dụng nuôi cấy tế bào và mô trong chọn giống cây trồng: Người ta đã tiến hành nuôi cấy mô tạo vật liệu mới cho giống cây trồng bằng cách tạo và chọn dòng tế bào xôma biến dị. Nguồn nguyên liệu ban đầu: tế bào 2n. Cách tiến hành: Nuôi trên MT nuôi cấy nhân tạo, chọn lọc các dòng TB có ĐBG và BD số lượng NST khác nhau. Cơ sở di truyền: dựa và ĐBG và BD số lượng NST tạo thể lệch bội khác nhau. Lợi ích: Tạo ra các giống cây trồng mới có các KG khác nhau từ cùng một giống ban đầu. Ví dụ: Tạo ra các giống lúa mới với năng suất cao, khả năng chống chịu tốt, kháng sâu bệnh tốt. Dung hợp tế bào trần: Tế bào trần là TB TV đã bị loại bỏ vách bởi 1 xử lý enzyme. Đó là TB tự do, cô lập, không định hướng. Dung hợp TB trần là sự hợp nhất của các TB sôma không có thành TB từ các cá thể hoặc các loài khác nhau, sau đó tái sinh thành cây lai từ các TB đã dung hợp. Nguồn nguyên liệu ban đầu: hai dòng TB có bộ NST 2n của hai loài khác nhau. Cách tiến hành: Tạo TB trần, cho dung hợp hai khối nhân và TBC thành một, nuôi trong MT nhân tạo để phát triển thành cây lai. Cơ sở di truyền: lai xa, lai khác loài để tạo thể song nhị bội, không thông qua lai hữu tính, tránh hiện tượng bất thụ con lai. Lợi ích: Tạo được giống mới mang đặc điểm của cả hai loài mà bằng cách tạo giống thông thường không làm được. Ví dụ: Potato + Tomato = Pomato Nhân bản vô tính ở động vật: Nhân nhanh nguồn gen động vật quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng. Tạo cơ quan nội tạng của động vật đã được chuyển gen người để chủ động cung cấp cơ quan thay thế cho các bệnh nhân đã bị hỏng cơ quan. Công nghệ tạo cừu Dolly: Tách tế bào tuyến vú của cừu cho nhân vào nuôi trong phòng thí nghiệm. Tách tế bào trứng của 1 cừu khác, sau đó loại bỏ nhân của tế bào trứng này. Chuyển nhân tế bào tuyến vú vào trong tế bào trứng đã bị bỏ nhân. Nuôi cấy trên môi trường nhân tạo cho chúng phát triển thành phôi. Chuyển phôi vào tử cung của 1 cừu mẹ để nó mang thai và đẻ ra cừu con. ð Cừu Dolly giống y hệt cừu cho nhân tế bào. Từ sau khi cừu Dolly ra đời, nhiều loài động vật khác đã được nhân bản thành công như: chuột, trâu, bò, lợn, dê, thỏ, ngựa, mèo hoang Châu Phi, mèo Bangan, hươu, …