Phân tích họ gen β-Amylase ở cây đậu tương (glycine max) - Cao Phi Bằng

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 165-176 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. PHÂN TÍCH HỌ GEN b-AMYLASE Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) Cao Phi Bằng1*, Trần Thị Thanh Huyền2 1Trường Đại học Hùng Vương, Phú Thọ, *phibang.cao@hvu.edu.vn 2Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, Hà Nội TÓM TẮT: Beta-amylase (β-amylase, EC 3.2.1.2) thuộc họ enzyme glycosyl hydrolase 14. Các b-amylase phân cắt các liên kết (1,4)-a-D-glucosidic trong các phân tử đường cao phân tử kiểu tinh bột và giải phóng các đơn phân maltose từ đầu không khử của chuỗi. Trong bài báo này, bằng phương pháp in silico chúng tôi xác định họ b-amylase của cây đậu tương là họ đa gen, với tổng số 19 gen mã hóa cho các enzyme b-amylase trong hệ gen của loài này. Trong đó, 19 gen b-amylase của cây đậu tương phân bố trên 12 trong tổng số 20 nhiễm sắc thể. Kích thước lớn của họ gen b-amylase ở đậu tương bắt nguồn từ nhiều sự kiện nhân gen được quan sát trong hệ gen, trong đó sự kiện nhân gen trên quy mô hệ gen (WGD) giữ vai trò chủ yếu. Dựa trên kết quả phân tích cây phả hệ, chúng tôi đã xếp các b-amylase của cây đậu tương vào bốn phân họ I, II, III và IV. Các gen này mã hóa không liên tục với số lượng intron thay đổi theo phân họ và theo từng gen trong phân nhóm. Các protein suy diễn của chúng có mức tương đồng khá cao khi so với các b-amylase cùng phân họ của cây Arabidopsis. Các protein b-amylase của cây đậu tương có điểm đẳng điện (pI) dao động từ 5,16 tới 9,18. Hầu hết các protein phân họ I, phân họ III và phân họ IV có tính axit. Ngược lại, 6 trong tổng số 8 protein thuộc phân họ II có tính kiềm. Tất cả các b-amylase của cây đậu tương đều mang vùng bảo thủ của họ enzyme glycosyl hydrolase 14 và hầu hết trong số chúng có mang các amino acid giữ vai trò quan trọng đối với chức năng enzyme. Ngoài ra, các b-amylase thuộc phân họ IV của cây đậu tương còn chứa đoạn amino acid giống với vùng bảo thủ của của tác nhân điều hòa phiên mã chống chịu với Brassinazole ở đầu amin. Các b-amylase nghiên cứu đều giàu các xoắn a trong cấu trúc bậc hai. Từ khóa: b-amylase, biểu hiện gen, cây đậu tương, cây phả hệ, đặc trưng của gen, in silico. MỞ ĐẦU Đậu tương (Glycine max) là một trong những cây trồng quan trọng trên thế giới do có hàm lượng protein và dầu trong hạt lớn, ngoài ra, đậu tương còn có khả năng cố định nitơ tự do trong không khí thông qua hệ vi sinh vật cộng sinh trong bộ rễ của chúng. Chính vì thế, cây đậu tương được trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới, cũng như ở Việt Nam. Hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng cao với khoảng 40% chất khô là protein và 20% là dầu [2, 12]. Đậu tương là loại thực phẩm có lợi cho sức khỏe [2, 12]. Nhờ giá trị cao, hệ gen của đậu tương đã được giải trình tự vào năm 2010 [19]. Phiên bản hệ gen của cây đậu tương hiện có kích thước xấp xỉ 975 Mb, gồm có 20 nhiễm sắc thể [19]. Đối với một loài sinh vật có hệ gen được giải trình tự, việc nghiên cứu về cấu trúc và chức năng hệ gen (genomics) đều có nhiều ý nghĩa quan trọng. Những nghiên cứu trên đối tượng hệ gen (chứa khối lượng dữ liệu lớn) thường sử dụng các phương pháp in silico giữ vai trò hết sức quan trọng. Các phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi khi mà các hệ gen, các tập hợp ARN của các loài sinh vật được giải trình tự ngày càng nhiều. Beta-amylase (β-amylase, EC 3.2.1.2) thuộc họ enzyme glycosyl hydrolase 14. Các b-amylase phân cắt các phân tử amylose và liên kết (1,4)-a-D-glucosidic trong các phân tử tinh bột, glycogen và maltooligosaccharide [15]. Enzyme này đã được tìm thấy ở hầu hết thực vật bậc cao và một số vi sinh vật. Ở thực vật, chức năng chính của chúng là tham gia vào sự phân giải tinh bột, nhưng trong báo cáo gần đây b-amylase còn giữ vai trò như tác nhân điều hòa phiên mã kiểm soát sự sinh trưởng chồi và sự phát triển [18]. Enzyme b-amylase được tích lũy nhiều trong hạt nảy mầm, nơi nó giữ vai trò lớn hơn so với các a-amylase, và trong một số mô chịu tác động của các yếu tố bất lợi [9, 22, 23]. Ngoài ra, b-amylase còn được cho là có vai trò trong sự dự trữ protein hay các hợp chất chứa nitơ [17]. Gần đây, một số protein có chứa vùng bảo thủ b-amylase được báo cáo giữ vai trò như những tác nhân điều hòa phiên mã kiểm soát sự sinh trưởng của thân và sự phát triển của Arabidopsis [18]. Những nghiên cứu về cấu trúc của các b-amylase ở thực vật đã cho thấy chúng có chứa vùng bảo thủ của họ enzyme glycosyl hydrolase 14 [1]. Cấu trúc không gian của phân tử có các chuỗi beta và các vòng với các trình tự đặc trưng [16]. Ít nhất một enzyme b-amylase của cây đậu tương đã được phân tích, trong phân tử của enzyme này có hai amino acid giữ vai trò trung tâm xúc tác E186, E380 [8], bên cạnh đó còn có một số amino acid giữ vai trò quan trọng đối với hoạt tính enzyme như T342 giữ chức năng nối trung tâm xúc tác E186 và cơ chất [14]. Gần đây, Luo et al. (2012) [13] đã chỉ ra rằng b-amylase có chứa nhiều xoắn a trong cấu trúc bậc hai. Ở cây Arabidopsis, có 9 b-amylase đã được báo cáo [3]. Các b-amylase này được xếp vào bốn nhóm khác nhau. Các protein thuộc các phân họ khác nhau có cấu trúc khá khác nhau. Lưu ý rằng không phải tất cả các protein này đều có mang các amino acid đặc trưng và cũng không phải tất cả chúng đều có hoạt tính enzyme b-amylase [3]. Ở cây đậu tương, chất dự trữ trong hạt chủ yếu là protein và dầu, tuy nhiên, họ b-amylase còn chưa được nghiên cứu đúng mức, chỉ có những nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính enzyme b-amylase [7] nhưng chưa có nghiên cứu toàn diện về họ gen này trên quy mô hệ gen của cây đậu tương. Trong công trình này, chúng tôi xác định các gen mã hóa cho các b-amylase trong hệ gen của cây đậu tương, đồng thời đưa ra các kết quả phân tích về các đặc tính hóa-lý và cấu trúc của các gen b-amylase ở loài cây này nhờ cách tiếp cận in silico. Cuối cùng, tiến hành phân tích sự biểu hiện của các gen trong họ b-amylase ở các loại mô khác nhau tại nhiều thời điểm phát triển khác nhau của cây đậu tương. Những kết quả nghiên cứu này bước đầu cung cấp các thông tin khoa học có ý nghĩa về nghiên cứu chức năng của các b-amylase trên cây đậu tương cũng như các cây họ đậu nói chung. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cơ sở dữ liệu về các trình tự hệ gen và RNAseq ở cây đậu tương Trình tự hệ gen của cây đậu tương được lấy từ Schmutz et al. (2010) [19]. Dữ liệu RNAseq được lấy từ Severin et al. (2010) [20]. Xác định các gen thuộc họ b-amylase ở cây đậu tương Các b-amylase của cây Arabidopsis [3] được dùng làm khuôn dò để tìm kiếm các gen tương đồng trên dữ liệu nucleotide của toàn hệ gen của cây đậu tương nhờ chương trình TBLASTN. Xây dựng cây phả hệ Các trình tự protein b-amylase nghiên cứu được sắp dãy bằng MAFFT [10]. Cây phả hệ được xây dựng từ các b-amylase của các loài Arabidopsis và đậu tương đã sắp dãy bằng phần mềm MEGA5 [21]. Phân tích các đặc điểm hóa - lý Các đặc điểm vật lý, hóa học của các gen/protein được phân tích bằng các công cụ của ExPASy [5]. Cấu trúc exon/intron được xây dựng nhờ GSDS 2.0 [6]. Cấu trúc không gian của phân tử protein được xây dựng nhờ Phyre2 [11]. Khảo sát sự biểu hiện gen Sự biểu hiện của các gen được phân tích qua kết quả RNAseq (giải trình tự tập hợp ARN thông tin) của cây đậu tương [20]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Xác định họ gen b-amylase ở cây đậu tương Chúng tôi sử dụng các protein b-amylase của cây Arabidopsis làm khuôn dò để tìm kiếm các gen mã hóa b-amylase trên toàn hệ gen của cây đậu tương nhờ sử dụng chương trình TBLASTN. Tổng số 19 gen mã hóa cho các b-amylase được tìm thấy trong hệ gen của cây đậu tương (bảng 1). Phân tích trình tự protein suy diễn của các gen này cho thấy chúng đều mang vùng bảo thủ của họ glycosyl hydrolase 14 (pfam01373), chỉ riêng GmbAMY06 mang vùng bảo thủ không hoàn thiện ở đầu carboxyl. Mức độ tương đồng giữa các b-amylase của cây đậu tương với b-amylase của cây Arabidopsis nằm trong khoảng từ 29% đến 75% tùy gen. Khi so sánh các b-amylase cùng phân họ giữa cây đậu tương với cây Arabidopsis, mức độ tương đồng giữa chúng tương đối cao. Mức độ tương đồng giữa các b-amylase phân họ I của hai loài thấp nhất là 61% và cao nhất là 70%. Số liệu tương ứng đối với các b-amylase phân họ II là 45% và 75%, phân họ III là 39% và 59%, phân họ IV là 49% và 71%. Khi so sánh với Arabidopsis, cây có hệ gen đã được giải trình tự, kích thước họ gen b-amylase của cây đậu tương lớn hơn hai lần (19 gen ở cây đậu tương so với 9 gen ở câyArabidopsis). Kết quả này phù hợp với tương quan kích thước hệ gen của hai loài, khi Arabidopsis là cây lưỡng bội trong khi đậu tương là cây đa bội thể [19]. Xây dựng bản đồ gen, phân tích cây phả hệ và phân loại các b-amylase Bản đồ gen được xây dựng cho thấy các gen b-amylase của cây đậu tương phân bố trên 12 trong tổng số 20 nhiễm sắc thể (NST) (hình 1). Trong đó, nhiễm sắc thể chứa nhiều nhất là ba gen (NST số 9 và số 13). Kiểu phân bố này cũng bắt gặp ở cây Arabidopsis. Ở loài cây này, các gen mã hóa cho b-amylase cũng chỉ phân bố trên 4 trong tổng số 5 NST [3]. Hình 1. Bản đồ phân bố của các gen mã hóa b-amylase của cây đậu tương (chỉ thể hiện các NST có mang gen mã hóa b-amylase, gạch chân: gen phân họ I, chữ in thường: gen phân họ II, chữ in nghiêng: gen phân họ III, chữ in đậm: gen phân họ IV) Hình 2. Cây phả hệ được xây dựng từ các b-amylase của cây đậu tương (Gm) và cây Arabidopsis thaliana (At). Cây phả hệ được xây dựng từ 28 trình tự protein của hai loài đậu tương và Arabidopsis với các tham biến: thuật toán Maximum Likelihood, mô hình Jones-Taylor-Thornton (JTT), phương pháp Bootstrap với 1000 lần lặp lại, giá trị bootstrap được thể hiện trên mỗi nhánh, tỷ lệ xích là số amino acid thay thế trên một vị trí. Cây phả hệ được xây dựng từ 28 trình tự b-amylase của hai loài đậu tương và Arabidopsis sau khi chúng đã được sắp dãy được thể hiện trong hình 2. Các protein này phân bố vào trong bốn nhánh của cây phả hệ, tương ứng với bốn phân họ khác nhau được kí hiệu từ I tới IV. Số lượng gen b-amylase của cây đậu tương thuộc các phân họ I, II, III và IV lần lượt là 5, 8, 2 và 4. Mức độ tương đồng cao của các gen trong mỗi nhóm cho thấy chúng hình thành từ các quá trình nhân gen. Nhiều gen b-amylase của cây đậu tương hình thành do sự kiện nhân gen trên quy mô hệ gen (Whole Genome Duplication, WGD), chỉ một sự kiện nhân gen trước sau (tandem duplication, TD) giữa GmbAMY14 và GmbAMY15 được ghi nhận. Hiện tượng nhân gen trên toàn hệ gen diễn ra phổ biến ở nhiều họ gen trong hệ gen của cây đậu tương [19]. Hiện tượng nhân gen này diễn ra đặc biệt mạnh ở hai phân họ I và II với lần lượt 3 và 4 sự kiện nhân gen. Hiện tượng nhân gen b-amylase của cây đậu tương giống với ở cây Arabidopsis [3] nhưng với số lượng sự kiện nhân gen nhiều hơn. Đặc điểm các gen b-amylase ở cây đậu tương Các gen Gmb-amylase có kích thước và cấu trúc không giống nhau, chứa từ 2366 đến 5815 nucleotide (bảng 1). Tất cả các gen b-amylase của cây đậu tương đều mã hóa không liên tục với số lượng intron thay đổi tùy nhóm. Các gen phân họ I có số lượng intron thay đổi trong khoảng 5 tới 7. Trong khi đó, các gen phân họ II cùng có 3 intron, các gen phân họ III cùng có 2 intron và các gen phân họ IV có 9 intron (hình 3). Các gen này mã hóa cho các protein có độ dài từ 496 tới 704 amino acid, tương ứng với khối lượng phân tử từ 56,03 kD tới 78,84 kD. Các protein b-amylase của cây đậu tương có điểm đẳng điện (pI) dao động từ 5,16 tới 9,18 (bảng 1). Các protein phân họ I, phân họ III và phân họ IV có tính axit (với giá trị pI nhỏ hơn 7), ngoại trừ GmbAMY14. Ngược lại, các protein thuộc phân họ II đa phần có tính kiềm, chỉ hai trong tổng số 8 protein thuộc nhóm này có giá trị pI thấp hơn 7 (GmbAMY07 và GmbAMY17). Những đặc điểm vật lý này của các b-amylase của cây đậu tương khá tương đồng với các đặc điểm của các b-amylase đã được báo cáo ở cây Arabidopsis [3]. Bảng 1. Các gen thuộc họ b-amylase của cây đậu tương và đặc điểm của chúng Gen Phân nhóm Tên locus Kích thước gen (bp) Chiều dài protein (aa) Khối lượng protein (kD) pI Định khu ở lục lạp Số intron GmbAMY01 IV Glyma01g35500 5147 656 74,40 5,76 - 9 GmbAMY02 II Glyma01g41190 2743 548 61,79 8,53 Có 3 GmbAMY03 II Glyma05g05750 3297 547 61,69 8,03 Có 3 GmbAMY04 II Glyma05g36640 2794 557 63,07 9,18 Có 3 GmbAMY05 I Glyma06g45700 2430 496 56,07 5,33 - 6 GmbAMY06 II Glyma08g02920 2655 553 62,59 8,72 Có 3 GmbAMY07 II Glyma09g29840 3450 569 62,98 5,75 Có 3 GmbAMY08 IV Glyma09g35070 5219 654 74,12 5,87 - 9 GmbAMY09 IV Glyma09g39603 5387 705 78,84 5,16 - 9 GmbAMY10 II Glyma11g04210 3190 554 62,49 8,69 - 3 GmbAMY11 I Glyma12g11130 2541 496 56,03 5,26 - 6 GmbAMY12 I Glyma12g32330 2795 601 68,55 6,31 - 5 GmbAMY13 III Glyma13g28630 2366 536 58,78 5,64 - 2 GmbAMY14 I Glyma13g38110 3372 584 67,12 8,36 - 7 GmbAMY15 I Glyma13g38120 3584 512 58,35 5,96 - 7 GmbAMY16 III Glyma15g10480 2435 536 58,75 5,83 - 2 GmbAMY17 II Glyma16g34360 3788 570 62,95 5,76 Có 3 GmbAMY18 II Glyma17g16020 2931 540 60,54 7,66 Có 3 GmbAMY19 IV Glyma18g46630 5496 704 78,84 5,31 - 9 Các motif bảo thủ và cấu trúc của các b-amylase ở cây đậu tương Hình 4 giới thiệu kết quả sắp dãy 19 b-amylase của cây đậu tương, thể hiện chi tiết các amino acid bảo thủ giữ vai trò quan trọng trong chức năng của enzyme. Cũng giống như các b-amylase của một số loài khác, hầu hết b-amylase của cây đậu tương có chứa các trình tự bộ phận bắt đầu với chuỗi beta và tiếp tục nối với các vòng (β4/L4, β5/L5, β6/L6, β7/L7, β8/L8). Các đoạn trình tự bộ phận, ngoại trừ L3/H5, đều có chứa các amino acid giữ vai trò quan trọng như trung tâm xúc tác của enzyme, duy trì cấu trúc, liên kết với cơ chất hay với các chất ức chế [16]. Tuy nhiên, không phải tất cả các protein trong họ đều có chứa đầy đủ các amino acid giữ vai trò quan trọng trong chức năng của enzyme (hình 3). Kết quả này tương tự với kết quả khi nghiên cứu về họ b-amylase ở cây Arabidopsis [3]. Riêng các b-amylase thuộc phân họ IV của cây đậu tương, ngoài vùng bảo thủ của họ glycosyl hydrolase 14, còn chứa đoạn amino acid giống với vùng bảo thủ của của tác nhân điều hòa phiên mã chống chịu với Brassinazole (Brassinazole resistant, BZR1) ở đầu amin (N-terminal). Kết quả này cũng phù hợp với các kết quả phân tích cấu trúc của hai gen BAM7 và BAM8 (phân họ IV) của cây Arabidopsis [18]. Kết quả phân tích cấu trúc bậc hai của một số protein b-amylase của cả bốn phân họ đầu giàu các xoắn a (hình 5), trong đó GmbAMY11 và GmbAMY17 có 13 xoắn (tương đương với 35% chiều dài phân tử), GmbAMY16 có 16 xoắn (tương đương với 37% chiều dài phân tử), GmbAMY08 có 16 xoắn (tương đương với 35% chiều dài phân tử). Kết quả nghiên cứu này tương tự với kết quả công bố gần đây của Luo et al. (2012) [13]. Hình 3. Cấu trúc exon/intron của các gen b-amylase của cây đậu tương Bảng 2. So sánh từng cặp protein b-amylase tương đồng của cây đậu tương và Arabidopsis. Giá trị biểu thị mức độ tương đồng (%). Gen Arabi dopsis AtBA M5 AtBAM6 AtBAM1 AtBAM3 AtBAM4 AtBAM9 AtBAM2 AtBAM7 AtBA M8 Đậu tương Phân nhóm I I II II III III IV IV IV GmbAMY05 I 70 69 50 50 40 31 52 47 41 GmbAMY11 I 69 69 50 50 41 31 52 47 42 GmbAMY12 I 65 64 49 49 41 30 52 48 41 GmbAMY14 I 62 65 49 46 39 29 49 47 41 GmbAMY15 I 61 64 45 44 41 30 47 42 37 GmbAMY02 II 47 49 64 70 43 38 48 47 42 GmbAMY03 II 49 47 64 72 43 36 46 46 40 GmbAMY04 II 38 35 47 50 39 35 38 38 38 GmbAMY06 II 37 35 45 49 38 35 38 37 37 GmbAMY07 II 49 45 75 62 43 38 49 43 41 GmbAMY10 II 47 49 64 69 43 37 51 45 41 GmbAMY17 II 49 43 74 61 38 38 48 43 39 GmbAMY18 II 49 47 64 70 43 38 50 46 40 GmbAMY13 III 36 35 40 43 40 59 38 36 39 GmbAMY16 III 35 33 39 41 39 59 37 35 39 GmbAMY01 IV 42 45 41 42 35 35 55 52 64 GmbAMY08 IV 42 46 41 43 34 35 57 53 70 GmbAMY09 IV 45 50 44 47 39 36 69 65 49 GmbAMY19 IV 47 51 45 48 39 37 71 66 50 Hình 4. Kết quả sắp dãy các protein b-amylase của cây đậu tương. Dấu éđánh dấu các amino acid bảo thủ, các amino acid giữ vai trò vị trí xúc tác được viết đậm và gạch chân, các amino acid gắn với cơ chất được viết đậm, các vùng bảo thủ được đóng khung. Hình 5. Mô hình 3D cấu trúc không gian của các b-amylase của cây đậu tương với các cấu trúc xoắn a (cuộn xoắn) và chuỗi b (mũi tên) a: GmbAMY11; b: GmbAMY17; c: GmbAMY16; d: GmbAMY8. Phân tích sự biểu hiện gen Sự biểu hiện gen của các gen b-amylase của cây đậu tương được nghiên cứu thông qua phân tích kết quả RNAseq (giải trình tự các ARN thông tin) thu được từ các mô, cơ quan trong các giai đoạn phát triển khác nhau, gồm mô lá, mô hoa, mô quả (ở ba thời điểm), mô hạt (ở 7 thời điểm khác nhau), mô rễ và nốt sần. Kết quả phân tích sự biểu hiện của các gen được trình bày trong bản đồ nhiệt (bảng 3). Trong tổng số 19 gen b-amylase của cây đậu tương, 18 gen biểu hiện ở ít nhất một mô và điều kiện nghiên cứu, mức độ biểu hiện khác nhau tùy theo từng gen và thay đổi tùy loại mô khác nhau (hình 6). Chỉ gen GmbAMY09 không có ARN tương ứng được phát hiện. Gen biểu hiện mạnh nhất trong hầu hết các mô nghiên cứu là GmbAMY05 (ở các mô lá, hoa, quả nhỏ, quả lớn, các mô hạt từ 14 ngày sau thụ tinh, và nốt sần). Xét riêng từng phân nhóm, chỉ phân họ III có các gen biểu hiện trong tất cả các mô nghiên cứu, cả hai gen của phân họ này biểu hiện mạnh nhất ở nốt sần và thấp nhất ở mô hạt 42 ngày sau thụ phấn. Trong phân họ I, chỉ hai gen GmbAMY05 và GmbAMY11 biểu hiện ở tất cả các mô nghiên cứu, các gen khác biểu hiện rất yếu hoặc không biểu hiện trong nhiều mô. Trong phân họ II, hai gen GmbAMY02, GmbAMY03 và GmbAMY10 không biểu hiện ở mô rễ, hơn nữa, gen GmbAMY02 không biểu hiện ở mô lá còn gen GmbAMY03 không biểu hiện ở mô hạt 42 ngày sau thụ tinh. Các gen còn lại trong phân họ này biểu hiện ở tất cả các mô nghiên cứu. Trong số 5 gen thuộc phân họ IV, chỉ ba gen GmbAMY01, GmbAMY08 và GmbAMY19 biểu hiện ở tất cả các mô. Những kết quả nghiên cứu về sự biểu hiện gen b-amylase của các loài thực vật khác hiện có không nhiều. Sự biểu hiện của gen mã hóa b-amylase ở rễ của cây cỏ linh lăng đã được báo cáo bởi Gana et al. (1998) [4]. Sự biểu hiện các gen b-amylase của một số loài trong điều kiện các yếu tố bất lợi đã được báo cáo bởi Kaplan và Guy [9]. Tuy nhiên, lần đầu tiên sự biểu hiện của toàn bộ họ gen b-amylase trong các mô thực vật ở các giai đoạn phát triển được giới thiệu trong nghiên cứu này. Mức độ biểu hiện mạnh của gen GmbAMY05 ở hầu hết các mô nghiên cứu gợi ý về vai trò quan trọng của gen này trong quá trình phát triển của cây đậu tương. Bảng 3. Sự biểu hiện của các gen b-amylase của cây đậu tương trong các mô nghiên cứu (DAF = Số ngày sau thụ phấn, nd = không xác định) Mô Gen Lá non Hoa Quả nhỏ (7 DAF) Quả trung bình (10DAF) Quả lớn (14DAF) Hạt (10DAF) Hạt (14DAF) Hạt (21DAF) Hạt (25DAF) Hạt (28DAF) Hạt (35DAF) Hạt (42DAF) Rễ Nốt sần GmbAMY01 7 8 9 8 3 5 5 4 5 4 8 4 7 4 GmbAMY02 0 32 6 16 22 18 33 9 32 4 10 2 0 466 GmbAMY03 10 64 1 8 7 9 6 2 20 1 6 0 0 40 GmbAMY04 70 48 43 44 35 25 42 12 39 28 42 31 39 38 GmbAMY05 245 745 151 200 280 65 131 140 3322 3953 8921 5363 63 778 GmbAMY06 51 55 45 41 27 22 25 8 32 18 23 16 65 46 GmbAMY07 96 340 51 130 134 20 22 26 50 35 33 7 55 115 GmbAMY08 71 71 83 62 67 30 62 24 51 18 44 18 61 55 GmbAMY09 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd GmbAMY10 2 66 28 43 17 46 48 19 55 19 15 3 0 106 GmbAMY11 10 9 16 17 4 6 12 4 20 24 50 26 6 9 GmbAMY12 12 3 4 12 3 0 1 0 0 0 0 0 5 0 GmbAMY13 99 234 63 217 255 59 73 27 70 42 46 24 113 700 GmbAMY14 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 27 GmbAMY15 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 GmbAMY16 77 440 105 300 239 67 76 39 77 49 53 12 72 656 GmbAMY17 109 136 64 62 52 12 38 27 65 38 47 15 28 42 GmbAMY18 38 178 34 46 19 17 34 33 53 39 53 16 49 28 GmbAMY19 101 49 68 77 62 31 46 20 39 18 34 14 72 50 KẾT LUẬN Trong công trình này, chúng tôi đã xác định và phân tích in silico chi tiết họ gen b-amylase ở cây đậu tương với tổng số 19 gen được phát hiện trong toàn hệ gen với các đặc điểm hóa lý và cấu trúc của tất cả các gen và protein suy diễn trong họ. Các motif và các amino acid bảo thủ giữ vai trò quan trọng đối với hoạt tính enzyme đã được tìm thấy trong hầu hết các protein của họ b-amylase của cây đậu tương. Sự kiện nhân gen xảy ra trên quy mô hệ gen (WGD) dẫn tới sự hình thành nhiều gen b-amylase của cây đậu tương. Hầu hết các gen b-amylase biểu hiện trong ít nhất một loại mô nghiên cứu với mức độc khác nhau. Lời cảm ơn: Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ chương trình nghiên cứu khoa học cơ bản của Trường Đại học Hùng Vương, tỉnh Phú Thọ. TÀI LIỆU THAM KHẢO Filiz E., 2014. In silico sequence analysis and homology modeling of predicted beta-amylase 7-like protein in Brachypodium distachyon L. J. BioSci. Biotech., 3(1): 61-67. Friedman M., Brandon D. L., 2001. Nutritional and health benefits of soy proteins. J. Agric. Food Chem., 49(3): 1069-1086. Fulton D. C., Stettler M., Mettler T., Vaughan C. K., Li J., Francisco P.,  Gil M., Reinhold H., Eicke S., Messerli G., Dorken G., Halliday K., Smith A. M., Smith S. M., Zeeman S. C., 2008. Beta-amylase4, a noncatalytic protein required for starch breakdown, acts upstream of three active beta-amylases in Arabidopsis chloroplasts. Plant Cell, 20(4): 1040-1058. Gana J. A., Kalengamaliro N. E., Cunningham S. M., Volenec J. J., 1998. Expression of beta-amylase from alfalfa taproots. Plant Physiol., 118(4): 1495-1506. Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Wilkins M. R., Appel R. D., Bairoch A., 2005. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server. In The proteomics protocols handbook: 571-607: Springer. Guo A. Y., Zhu Q. H., Chen X., Luo J. C., 2007. GSDS: a gene structure display server. Yi Chuan, 29:1023-1026. Hirata A., Adachi M., Sekine A., Mikami B., 2004. Structural and enzymatic analysis of soybean-amylase mutants with increased pH optimu. J. Biol. Biochem., 279(8): 7287-7295. Kang Y. N., Adachi M., Utsumi S., Mikami B., 2004. The roles of Glu186 and Glu380 in the catalytic reaction of soybean beta-amylase. J. Mol. Biol., 339(5): 1129-1140. Kaplan F., Guy C. L., 2004. beta-amylase induction and the protective role of maltose during temperature shock. Plant Physiol., 135(3): 1674-1684. Katoh K., Standley D. M., 2013. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Mol. Biol. Evol., 30: 772-780. Kelley L. A., Sternberg M. J., 2009. Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server. Nat. Protoc., 4: 363-371. Liu K., 2005. Soybeans as functional foods and ingredients. AOCS Publishing. Luo J. C., Wang S. C., Jian W. B., Chen C. H., Tang J. L., Lee C. I., 2012. Formation of amyloid fibrils from beta-amylase. FEBS Lett., 586(6): 680-685. Mikami B., Degano M., Hehre E. J., Sacchettini J. C., 1994. Crystal structures of soybean beta-amylase reacted with beta-maltose and maltal: active site components and their apparent roles in catalysis. Biochem., 33(25): 7779-7787. Oyefuga O. H., Adeyanju M. M., Adebawo O. O., Agboola F. K., 2011. Purification and some properties of b-amylase from the nodes of sugar cane, Saccharium offinacium. Int. J. of Plant Physiol. and Biochem., 3(5): 117-124. Pujadas G., Ramirez F. M., Valero R., Palau J., 1996. Evolution of beta-amylase: patterns of variation and conservation in subfamily sequences in relation to parsimony mechanisms. Proteins, 25(4): 456-472. Qi J. C., Zhang G. P., Zhou M. X., 2006. Protein and hordein content in barley seeds as affected by nitrogen level and their relationship to beta-amylase activity. J. of Cereal Sci., 43(1): 102-107. Reinhold H., Soyk S., Simkova K., Hostettler C., Marafino J., Mainiero S., Vaughan C. K., Monroe J. D., Zeeman S. C., 2011. beta-amylase-like proteins function as transcription factors in Arabidopsis, controlling shoot growth and development. Plant Cell, 23(4): 1391-1403. Schmutz J., Cannon S. B., Schlueter J., Ma J., Mitros T., Nelson W., Hyten D. L., Song Q., Thelen J. J., Cheng J., Xu D., Hellsten U., May G. D, Yu Y., Sakurai T., Umezawa T., Bhattacharyya M. K., Sandhu D., Valliyodan B., Lindquist E., Peto M., Grant D., Shu S., Goodstein D., Barry K., Futrell-Griggs M., Abernathy B., Jianchang Du J., Tian Z., Zhu L., Gill N., Joshi T., Libault M., Sethuraman A., Zhang X. C., Shinozaki K., T. Nguyen H. T., Wing R. A., Cregan P., Specht J., Grimwood J., Rokhsar D., Stacey G., Shoemaker R. C., Jackson S. A., 2010. Genome sequence of the palaeopolyploid soybean. Nature, 463(7278): 178-183. Severin A. J., Woody J. L., Bolon Y. T., Joseph B., Diers B. W., Farmer A. D., Muehlbauer G. J., Nelson R. T., Grant D., Specht J. E., Graham M. A., Cannon S. B., May G. D., Vance C. P., Shoemaker R. C., 2010. RNA-Seq Atlas of Glycine max: a guide to the soybean transcriptome. BMC Plant Biol., 10, 160. doi: 10.1186/1471-2229-10-160 Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S., 2011. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol., 28: 2731-2739. Todaka D., Kanekatsu M., 2007. Analytical method for detection of beta-amylase isozymes in dehydrated cucumber cotyledons by using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem., 365(2): 277-279. Todaka D., Matsushima H., Morohashi Y., 2000. Water stress enhances beta-amylase activity in cucumber cotyledons. J. Exp. Bot., 51(345): 739-745. ANALYSIS OF b-AMYLASE GENE FAMILY IN SOYBEAN (Glycine max) Cao Phi Bang1, Trần Thị Thanh Huyền2 1Hung Vuong University, Phu Tho 2Hanoi National University of Education, Hanoi SUMMARY Beta-amylases (β-amylase, EC 3.2.1.2) belong to the glycosyl hydrolase family 14. These enzymes hydrolyze the 1,4-a-D-glucosidic linkages in starch-type polysaccharide substrates to remove successive maltose units from the non-reducing ends of the chains. Using in silico methods, showed that soybean b-amylase was a multigenic family. A total of indentified 19 genes encoding the b-amylase in the whole genome of this crop plant. These 19 genes distributed on 12 out of 20 chromosomes. Compared to Arabidopsis, the b-amylase family was larger in soybean. The large size of the b-amylase family in soybean is derived from many different gene duplication events which were observed in its genome. Based on our phylogenetic analysis, we classified the soybean b-amylases into four subfamilies I, II, III and IV. These subfamilies contained 5; 8; 2 and 5 members respectively. All of 19 genes encoded discontinuously, their intron numbers differed up on the subfamily. The pairwise comparison of predicted proteins from the same subfamily between the two species (soybean and Arabidopsis) showed that they were similar. The pI values of soybean b-amylase ranged from 5.16 to 9.18. Most of the proteins of subfamilies I, III and IV were acidic while 6 out of 8 subfamily II proteins were basic. All soybean b-amylases contained the conserved domain of the glycosyl hydrolase family 14, and most of the proteins included amino acids which are important for the enzymatic function. In addition, the subfamily IV proteins contained the amino acid sequence in N-terminal which was similar to the transcription factors of the BRASSINAZOLE RESISTANT1 (BZR1) type. The predicted secondary structure of all of the studied proteins was rich in a-helice. Finally, our expression survey results showed that most soybean b-amylases expressed in at least one tissue. However, the transcript abundances of each gene varied in many of the tissues studied. This result suggests that differential expression exists in different tissues and at different developmental stages of the same tissue. Keywords: b-amylase, gene expression, soybean, phylogenetic tree, gene characterization, in silico, gene identification. Ngày nhận bài: 22-10-2014