Phân lập và tuyển chọn một số chủng bacillus sinh tổng hợp nattokinase - Lê Thị Bích Phượng

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 99-104 99 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS SINH TỔNG HỢP NATTOKINASE Lê Thị Bích Phượng*, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)phuongbl58@yahoo.com TÓM TẮT: Nattokinase là enzyme làm tan huyết khối, được phát hiện trong Natto vào năm 1980. Trong bài báo này, hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 chọn lọc được, có khả năng sinh tổng hợp mạnh enzyme làm tan huyết khối (nattokinase). Trên môi trường hạt đậu nành, chiều dày môi trường 2,5 cm, nhiệt độ phòng, sau 40 giờ lên men, hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 sinh ra nattokinase (470 FU/g), chiếm khoảng 70-85% so với hoạt tính protease tổng. Kết quả này cho thấy rằng, chúng ta có thể chủ động sản xuất sản phẩm nattokinase hoạt tính cao, giá thành thấp để vệ sức khỏe người dân, mà không phụ thuộc vào thực phẩm chức năng chứa enzyme nattokinase ngoại nhập. Từ khóa: Bacillus, enzyme làm tan huyết khối, nattokinase. MỞ ĐẦU Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch do các cục máu đông (thrombus) như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não đang tăng cao ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Vì vậy, enzyme nattokinase được quan tâm nghiên cứu sản xuất và sử dụng rộng rãi để phòng ngừa bệnh nghẽn động mạch do các cục máu đông [9]. Nattokinase (EC 3.4.21) là serine protease gồm 275 axít amin, hoạt động ở pH tối ưu từ 8- 10, nhiệt độ tối ưu từ 30-70oC, có trọng lượng phân tử từ 27,7-44 kDa, điểm đẳng điện (pI) 8 và cấu trúc tương đồng với subtilisin. Cơ chế hoạt động của nattokinase là trực tiếp phân cắt fibrin trong huyết khối và gián tiếp bằng cách hoạt hoá sự sản xuất urokinase và plasmin trong mô [7]. Nhiều chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân lập từ các loại thực phẩm lên men truyền thống là nguồn giống quan trọng có khả năng sản xuất các enzym làm tan huyết khối, như B. natto phân lập từ thực phẩm Natto, Nhật [3], Bacillus amyloliquefaciens DC-4 từ Douchi, Trung Quốc [8], Bacillus sp. CK 11-4 TỪ Chungkook-Jang và Bacillus sp. DJ-4 từ Doe-Jang, Hàn Quốc [4, 5]. Nattokinase được tinh sạch từ dịch nuôi cấy B. subtilis natto B-12 (phân lập được từ natto) có độ tinh sạch gấp 51,6 lần và hiệu suất thu hồi 43,2% so với hoạt tính ban đầu, trọng lượng phân tử 29 kDa, hoạt động ở pH và nhiệt độ tối ưu tương ứng là 8 và 40oC, enzyme được hoạt hóa bởi ion Zn2+ nhưng bị ức chế bởi ionFe3+ và Al3+ [14]. Chủng B. subtilis được nuôi cấy chìm chứa glucose 10 g/l, peptone 50 g/l và các chất khoáng; ở điều kiện trong bình tam giác sau 12 giờ nuôi cấy, hoạt tính nattokinase là 630 UI/ml; ở điều kiện trong nồi lên men, sau 10 giờ nuôi cấy, hoạt tính nattokinase cao nhất là 3,400 UI/ml. Tuy nhiên, ở điều kiện nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất dinh dưỡng trong nồi lên men, sau 19 giờ nuôi cấy, hoạt tính nattokinase là 7,100 UI/ ml, cao gấp 2,1 lần so với không bổ sung cơ chất [2]. B. subtilis sinh tổng hợp nattokinase cao (459,11 FU/ml) trong môi trường lỏng chứa cao cám mì (1,5-3o Brix), cao đậu nành (1,0-2oBrix), glucose (0,6-2%), trong thời gian 24-36 giờ ở 27oC [11]. Trong môi trường lỏng chứa peptone từ đậu nành 8,28 g/l, CaCl2 0,64 g/l và cao nấm men 0,74 g/l, B. natto NLSSE sinh tổng hợp nattokinase đạt 1300 UI/ml [6]. B. subtilis LD-8 sinh tổng hợp nattokinase cao trong môi trường lỏng chứa bột gạo 5%, bột đậu nành 4%, NH4NO3 0,5% và CaCl2 0,01% (w/w), pH 7 và tỷ lệ giống 5%, sau 72 giờ nuôi cấy, hoạt nattokinase đạt được là 4220 U/ml [13]. B. subtilis được nuôi cấy trên cơ chất bã bậu nành (độ ẩm 80%), ở 37oC trong 20 giờ, hiệu suất nattokinase cao nhất là 0,108 g/150 g cơ chất (dạng ướt) [15]. Le Thi Bich Phuong et al. 100 Bacillus natto được nuôi cấy trong môi trường lỏng tối ưu: glucose 0,065%; KH2PO4 0,0016% và MgSO4 0,0016%, sau 72 giờ nuôi cấy trên máy lắc ở 37oC, hoạt tính nattokinase đạt được 12,34 FU/ml [12]. B. subtilis được nuôi trên môi trường lên men bán rắn chứa cơ chất bã đậu và cám mì, dưới các điều kiện nuôi cấy tối ưu như độ ẩm ban đầu 65%, pH 8, và nhiệt độ 35oC, hoạt tính nattokinase đạt được là 1577 UI/g [1]. Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành một số thực phẩm chức năng chứa nattokinase dưới dạng viên nhộng nhập khẩu từ Nhật Bản, Hoa Kỳ như Nattospes (3000 FU/g), Japato (600 FU/g), Nattokinase plusTM (3000 FU/g), Dosaka (300 FU/g)... với đơn giá rất cao (trên 10 triệu đồng/kg). Dạng thực phẩm truyền thống của Nhật Bản cũng được nhập khẩu nhưng không được dùng phổ biến vì nặng mùi, nhớt, rất khó ăn, không phù hợp với khẩu vị người Việt Nam, hoạt tính nattokinase cũng thấp. Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này nhằm chủ động nguồn giống bằng cách tuyển chọn một số chủng Bacillus spp. từ bộ sưu tập giống của Viện Sinh học nhiệt đới và phân lập từ thực phẩm Natto có khả năng sinh tổng hợp mạnh nattokinase trên cơ chất đậu nành, so sánh hoạt tính nattokinase thu nhận được từ các chủng Bacillus spp. chọn được với các thực phẩm chức năng chứa nattokinase nhập khẩu trên thị trường, thăm dò khả năng cạnh tranh, nghiên cứu công nghệ và sản xuất thử nghiệm sản phẩm nattokinase làm thực phẩm chức năng tiện sử dụng, giá thành thấp PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Các chủng Bacillus spp. lấy từ bộ sưu tập của phòng Vi sinh và phân lập được từ Natto thương phẩm lưu hành tại tp Hồ Chí Minh và Nhật Bản. Nguyên liệu Đậu nành hạt, thực phẩm natto của Nhật Bản (G), thực phẩm chức năng Nattokinase (E)và Nattokinase (H). Hóa chất phân tích Fibrinogen (SIGMA, F8630), Thrombin (SIGMA, T6634). Phương pháp Phân lập vi khuẩn: Các chủng Bacillus được phân lập từ Natto thương phẩm bằng phương pháp trải trên môi trường thạch cao thịt pepton (MPA) chứa 0,5% cao thịt, 1% peptone, ủ ở nhiệt độ thường trong thời gian 1-2 ngày. Các khuẩn lạc được làm thuần và bảo quản trong ống thạch nghiêng ở 4oC. Chọn lọc chủng vi khuẩn: Các chủng vi khuẩn được cấy điểm trên môi trường MPA, nuôi cấy 24 giờ ở nhiệt độ phòng, dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch có vi khuẩn sinh trưởng tốt, đặt lên bề mặt môi trường thạch casein 1% và đĩa máu đông, ủ ở 37oC, đo đường kính vòng phân giải casein sau 20 giờ ủ và vòng phân giải máu đông sau 4 giờ ủ. Lên men rắn thu nattokinase: Các chủng Bacillus spp. được nuôi trên đậu nành hạt đã hấp chín với tỉ lệ giống 2%, chiều dày môi trường 2,5 cm, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng, thời gian lên men 27-48 giờ để thu enzyme protease và nattokinase. Sản phẩm enzyme thô thu được sau sấy khô ở 40oC và xay nhuyễn. Phân tích định tính và định lượng protease và nattokinase: Protease tổng bao gồm nattokinase và các protease khác, nếu hoạt tính protease tổng cao thì hoạt tính nattokinase cũng có khả năng cao. Do hóa chất phân tích nattokinase rất đắt tiền, nên trong một số thí nghiệm có thể gián tiếp định tính và định lượng protease. (1). Định tính protease theo phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường casein 1%, agar 2%. Cho 0,1 ml các dịch chiết enzyme vào các lỗ, ủ ở 37oC trong thời gian 20 giờ, đo đường kính vòng phân giải casein; (2). Định lượng hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến; (3). Định tính nattokianse dựa vào khả năng hòa tan huyết khối lợn. Phương pháp tự chế này có thể cho thấy kết quả trực tiếp về khả năng làm tan cục huyết khối: Cho 2 ml dịch chiết enzyme (ở các độ pha loãng 10 lần) vào 2 g huyết lợn đông, ủ 37oC trong 4 giờ. Cân trọng lượng cục huyết đông còn lại sau khi ủ. So sánh khả năng hòa tan cục huyết khối của các mẫu lên men; (4). Định tính nattokinase theo phương pháp đục lỗ thạch chứa hỗn hợp 5 ml dung dịch 0,96% (w/v) fibrinogen, 5 ml TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 99-104 101 dung dịch 2,35% (w/v) agarose và 0,1 ml dung dịch thrombin (20 UI/mL). Mỗi lỗ được cho vào 20 µl dịch chiết enzyme ở độ pha loãng 100 lần, ủ ở 37oC trong 21 giờ. Hoạt tính làm tan fibrin của các dịch enzyme được so sánh bằng cách đo kích thước vòng phân giải xung quanh các lỗ (Choi và Kim (2001). Định lượng hoạt tính nattokinase bằng phương pháp của Japan Bio Science Laboratory Co., Ltd. (JBSL). Một đơn vị (1 FU) được định nghĩa là lượng enzyme phân giải sợi fibrin (hình thành sau phản ứng giữa fibrinogen và thrombin) mà làm tăng sự hấp thụ của dịch thuỷ phân tại bước sóng 275 nm bằng 0,01 trong thời gian một phút dưới các điều kiện phản ứng. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus spp. có khả năng làm tan huyết khối Các chủng Bacillus spp. từ bộ sưu tập giống của phòng Vi sinh (được mã hoá là 12D1, 12D2, và 7.2) và phân lập từ thực phẩm Natto của Nhật Bản (được mã hóa là 1, 2, 3, 4, 6, 7, NP1, NP2 và NP3) được chọn lọc bằng phương pháp phân tích định tính dựa vào đường kính vòng phân giải casein và khả năng làm tan huyết khối, kết quả ghi nhận được chỉ ra trong hình 1. Hình 1. Khả năng phân giải casein và làm tan huyết khối của các chủng Bacillus Hình 2. Khả năng sinh nattokinase của các chủng Bacillus theo thời gian Hình 1 cho thấy, đường kính vòng phân giải casein và làm tan huyết khối của các chủng Bacillus 7.2 (3,4 cm và 2,3 cm) và NP3 (3,5 cm và 2,5 cm) là lớn nhất, của các chủng 12D2, NP1, NP2 lớn hơn các chủng còn lại, nên năm chủng này được chọn cho các khảo sát tiếp theo. Le Thi Bich Phuong et al. 102 Khả năng sinh ra nattokinase của các chủng Bacillus spp. trên môi trường đậu nành Các chủng Bacillus 7.2, 12D2, NP1, NP2, và NP3 được nuôi cấy trên cơ chất đậu nành trong hộp Petri ở nhiệt độ phòng trong thời gian 27, 40 và 48 giờ nuôi ủ. Hoạt tính nattokinase của các mẫu enzyme thô được trình bày trong hình 2. Hình 2 cho thấy, trong số 5 chủng Bacillus khảo sát, hai chủng 7.2 và NP3 sinh tổng hợp nattokinase hoạt tính cao nhất (464.4 FU/g và 472.2 FU/g) sau 40 giờ nuôi cấy. Nên hai chủng 7.2 và NP3 được chọn cho các khảo sát tiếp theo. Kết quả phân tích định lượng này cũng trùng với kết quả phân tích định tính. Các mẫu nattokinase thô 7.2 (A) và NP3 (B) thu nhận từ môi trường nuôi cấy chủng Bacillus 7.2 và NP3 được so sánh với Nattokinase (E) và Nattokinase (H) và thực phẩm Natto của Nhật (G) về khả năng làm tan huyết khối, phân giải fibrin, hoạt tính protease và nattokinase. Kết quả được ghi nhận trong bảng 1. Bảng 1. Kết quả phân tích định tính, định lượng nattokinase và protease Mẫu enzyme % Hòa tan huyết khối Vòng phân giải fibrin (cm) Protease (UI/g) Nattokinase (FU/g) Nattokinase/ protease (%) 7,2 (A) 99 2,3 681 466,4 68,5 NP3 (B) 99 2,6 564 472,5 83,7 Nattokinase (E) 71 1,3 KXĐ 88,8 KXĐ Nattokinase (H) 100 2,6 1098 480,2 47,4 Natto-Nhật (G) 30 0,8 44,46 40,5 91 (KXĐ): Không xác định. Hình 3. Đường kính vòng phân giải fibrin của các mẫu nattokinase Kết quả từ bảng 1 và hình 3 cho thấy, ở độ pha loãng 10 lần, khả năng làm tan huyết khối của nattokinase 7.2 và NP3 tương đương nhau (khoảng 99%), và cao hơn 1,4 lần mẫu Nattokinase E (71%). Ở độ pha loãng 100 lần, kích thước vòng phân giải fibrin và hoạt tính nattokinase của mẫu NP3 (2,6 cm và 472,5 FU/g) là tương đương so với mẫu Nattokinase H (2,6 cm và 480,2 FU/g), và cao hơn mẫu 7.2 (2,3 cm và 466,4 FU/g), nattokinase E (1,3 cm và 88,8 FU/g) và Natto - Nhật G (0,8 cm và 40,5 FU/g). Tỷ lệ nattokinase/protease của mẫu NP3 (83,7%) cao hơn các mẫu còn lại, ngoại trừ Natto-Nhật G (chiếm 91%). Hai mẫu nattokinase 7.2 và NP3 dù ở dạng thô, nhưng hoạt tính nattokinase cao tương đương so với các loại thực phẩm chức năng khảo sát. Các mẫu thực phẩm chức năng khảo sát có hoạt tính nattokinase thấp hơn so với số liệu in trên bao bì, nguyên nhân có thể do điều kiện vận chuyển, lưu kho và thời gian bảo quản lâu nên ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Kết quả cũng chứng tỏ hai phương pháp định tính và định lượng hoạt tính nattokinase là trùng khớp. Các mẫu có hoạt tính protease cao thì hoạt tính nattokinase cũng cao, vì vậy phương pháp phân tích protease có thể được sử TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 99-104 103 dụng để chọn lọc sơ bộ các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase. Sản xuất thử chế phẩm nattokinase qui mô 5 kg/mẻ Dựa trên các nghiên cứu trước đây về các điều kiện nuôi cấy Bacillus spp. sinh enzyme protease trên môi trường rắn, chủng NP3 được nuôi cấy trực tiếp trên đậu nành hấp chín trên khay (dài 40 cm × rộng 30 cm × cao 5 cm ) ở nhiệt độ phòng, trong thời gian 40 giờ. Hoạt tính nattokinase và protease của các mẫu nattokinase thô được chỉ ra trong bảng 2. Kết quả thu được (bảng 2) chứng tỏ hoạt tính nattokinase và protease trung bình của các mẻ sản xuất ở điều kiện lên men rắn trên khay tương đối ổn định, tương ứng là 475 FU/g và protease 560 UI/g. Nattokinase chiếm phần lớn trong protease tổng (trên 80%). Bảng 2. Hoạt tính nattokinase và protease của các đợt sản xuất Đợt sản xuất Protease (UI/g) Nattokinase (FU/g) Nattokinase/protease (%) 1 557 476,8 85,6 2 560 470,4 84,0 3 565 475,6 84,1 Tuy nhiên, để triển khai sản xuất nattokinase làm thực phẩm, cần tối ưu hóa môi trường và các điều kiện nuôi cấy, xây dựng qui trình công nghệ hoàn chỉnh, tăng tính ổn định và thời gian bảo quản của sản phẩm, cũng như cải tiến đặc tính của sản phẩm cho dễ sử dụng và giảm giá thành. KẾT LUẬN Hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 chọn lọc được có khả năng sinh ra nattokinase khoảng 470 FU/g trên môi trường đậu nành hạt hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên khay, và hoạt tính này chiếm khoảng 85% so với protease toàn phần. Hoạt tính nattokinase và protease của mẫu NP3 và 7.2 tương đương với một số thực phẩm chức năng hiện đang bán trên thị trường. Kết quả nghiên cứu này cho thấy khả năng có thể chủ động sản xuất sản phẩm nattokinase trong nước, có chất lượng tốt, giá thành rẻ, góp phần giảm thiểu các bệnh tai biến mạch máu não, đột quị do huyết khối và bảo vệ sức khỏe công đồng. Lời cảm ơn: Công trình có sự hỗ trợ về kinh phí của Đề tài cơ sở năm 2011 (Viện Sinh học nhiệt đới). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bao Y., Chen J., Qian Z., Ni M., Wang P., 2004. Optimization of the technique of solid fermentation of nattokinase, Journal of Shenyang Pharmaceutical University, 21(6): 468-471. 2. Cho Y. H., Song, J. Y., Kim K. M., Kim M. K., Lee I. Y., Kim S. B., Kim H. S., Han N. S., Lee B. H., Kim B. S., 2010. Production of nattokinase by batch and fed-batch culture of Bacillus subtilis. New Biotechnology, 27(4): 341-346. 3. Fujita M., Nomura K., Hong K., Ito Y., Asada A., Nishimuro S., 1993. Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan. Biochem. Biophys. Res. Commun., 197(3): 1340-1347. 4. Kim W., Choi K., Kim Y., Park H., Choi J., Lee Y., Oh H., Kwon I., Lee S., 1996. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang. Appl. Environ. Microbiol., 62(7): 1488-2482. 5. Kim S., Choi N., 2000. Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp strain DJ-4 screened from Doen-Jang. Biosci. Biotechnol. Biochem., 64: 1722-1725. 6. Liu J. G., Xing J. M., Chang T. S., Ma Z. Y., Liu H. Z., 2005. Optimization of Le Thi Bich Phuong et al. 104 nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods. Process Biochem., 40: 2757-2762. 7. Meruvu H., Vangalapati M., 2011. Nattokinase: A Review on Fibrinolytic Enzyme, International Journal of Chemical, Environmental and Pharmaceutical Research, 2(1): 61-66. 8. Peng Y., Huang Q., Zhang R. H., Zhang Y. Z., 2003. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean food. Comp Biochem Physiol. Biochem. MolBiol., 134: 45-52 . 9. Peng Y., Yang X., Zhang Y., 2005. Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo. Appl Microbiol Biotechnol., 69: 126-132. 10. Sumi H., Hamada H., Tsushima H., Mihara H., Muraki H., 1987. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet. Experientia, 43(10): 1110-1111 11. Wang D. S., Torng C. C., Lin I. P., Cheng B. W., Liu H. R., 2006. Optimization of nattokinase production conduction using response surface methodology. Journal of Food Process Engineering, 29: 22-35. 12. Wang J. K., Chiu H. H., Hsieh C. S., 2009. Optimization of the Medium Components by Statistical Experimental Methods to Enhance Nattokinase Activity, Fooyin. J. Health Sci., 1(1): 21-27. 13. Wang S. H., Zhang C., Yang Y. L., Diao M., Bai M. F., 2008. Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and characterization of the fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis LD-8547, World J. Microbiol. Biotechnol. 24: 475- 482. 14. Wang C., Du M., Zheng D., Kong F., Zu G., Feng Y., 2009. Purification and Characterization of nattokinase from Bacillus subtilis Natto B-12. J. Agric. Food Chem., 57: 9722-9729. 15. Zu X., Zhang Z., Yang Y., Che H., Zhang G., Li j., 2010. Thrombolytic Activities of Nattokinase Extracted from Bacillus Subtilis Fermented Soybean Curd Residues. International Journal of Biology, 2(2). ISOLATION AND SELECTION OF SOME BACILLUS STRAINS CAPABLE OF NATTOKINASE PRODUCTION Le Thi Bich Phuong, Vo Thi Hanh, Tran Thanh Phong, Le Tan Hung, Truong Thi Hong Van, Le Thi Huong Institute of Tropical Biology, VAST SUMMARY Nattokinase enzyme, found in Natto in 1980 by Dr. Sumi (Japan), can dissolve blood clots. In this paper, two strains of Bacillus sp.7.2 and Bacillus sp.NP3 were selected for nattokinase production. On the steamed soybean substrate, at room temperature, after 40 hours of fermentation, the nattokinase activity was about 470 FU/g, which accounted for about 70-85% as compared to the total protease activity. These results show that we can produce the nattokinase enzyme at low cost for healthcare of the Vietnamese people, and are not dependent on imported functional foods containing nattokinase enzyme. Keywords: Bacillus sp., fibrinotic enzyme, nattokinase. Ngày nhận bài: 21-6-2012