Ðột biến gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson thể gan

TCNCYH 95 (3) - 2015 1 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 ðịa chỉ liên hệ: ðỗ Thanh Hương, Bộ môn Nhi, Trường ðại học Y Hà Nội Email: drdothanhhuong@yahoo.com Ngày nhận: 27/5/2015 Ngày ñược chấp thuận: 20/7/2015 ðỘT BIẾN GEN ATP7B Ở BỆNH NHÂN WILSON THỂ GAN ðỗ Thanh Hương, Trần Huy Thịnh, Ninh Quốc ðạt, Trần Vân Khánh Trường ðại học Y Hà Nội Nghiên cứu ñược tiến hành nhằm phát hiện các dạng ñột biến gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson thể gan. 16 bệnh nhân chẩn ñoán xác ñịnh bệnh Wilson thể gan dựa theo tiêu chuẩn của Ferenci ñược lựa chọn vào nghiên cứu. Kỹ thuật giải trình tự gen ñược sử dụng ñể xác ñịnh ñột biến trên gen ATP7B. Kết quả cho thấy ñã phát hiện ñược18 dạng ñột b iến gen ATP7B trên nhóm bệnh nhân Wilson thể gan, trong ñó phát hiện ñược 4 dạng ñột b iến mới chưa ñược công bố (p.T850I, c. ins 47/48 CGGCG, p.F1240I và p.G50S); 11 ñột biến ñã ñược công bố gây bệnh (p.S105Stop, c.-75C > A, c.-118/117 ins GCCGC, p.W939C, p.C980S, p.C980Stop, p.G943D, p.N1270I, p.T715A, p.R778L, c.4060 + 6 C > T) và 3 ñột b iến dạng ña hình thái hay thể biến dị (p.V456L, p.K832R, p.F1144I). Từ khóa: Bệnh Wilson thể gan, gen ATP7B, ñột biến gen I. ðẶT VẤN ðỀ Bệnh Wilson ñược biết ñến là bệnh thoái hóa gan - nhân ñậu, ñược tác giả Kinnear Wilson mô tả lần ñầu tiên vào năm 1912 [1]. Cho ñến nay, bệnh ñược phát hiện ở hầu hết các quốc gia và các chủng tộc trên Thế giới với tỷ lệ mắc là 1/105 ñến 1/35.000 trẻ sinh ra. ðây là bệnh di truyền, ñột biến gen lặn trên nhiễm sắc thể thường 13q14.3, mã hóa gen ATP7B gây thiếu hụt enzym ATPase typ P (P - ATPase) [2]. Gen ATP7B gồm 21 exon chiều dài khoảng 80kb, mã hóa cho phân tử protein 1465 acid amin. Gen này có vai trò ñiều hòa quá trình hấp thu, phân bố và thải trừ ñồng t rong cơ thể. Do ñó, khi ñột biến gen xảy ra sẽ gây rối loạn quá t rình chuyển hóa ñồng, ñặc biệt là giảm bài tiết ñồng qua ñường mật. Lượng ñồng ứ lại t rong cơ thể sẽ lắng ñọng dần trong các tổ chức: gan, não (chủ yếu ở nhân xám trung ương), mắt, da, thận, xương,... và gây ra các triệu chứng ña dạng trên lâm sàng. Bệnh biểu hiện sớm ở gan nhưng thường ñược chẩn ñoán muộn với biểu hiện triệu chứng nặng. Nếu bệnh ñược chẩn ñoán và ñiều trị sớm ñặc biệt là ở những bệnh nhân Wilson thể gan, có thể ngăn chặn ñược các biến chứng và hạn chế sự phát triển của bệnh. Ở Việt Nam, lần ñầu tiên có hai t rường hợp bệnh nhân bị bệnh Wilson ñược phát hiện mang ñột biến gen Arg778Leu vào năm 2010 [3]. Các nghiên cứu sau ñó tiếp tục xác ñịnh ñột biến ở một số vùng t rọng ñiểm và hoàn thiện quy trình xác ñịnh ñột biến gen ATP7B [4; 5]. Như vậy, số lượng nghiên cứu ñột biến gen ATP7B ở Việt Nam còn hạn chế và chưa ñầy ñủ về ñột biến gen ATP7B, cũng chưa có phân tích gen giúp chẩn ñoán sớm các bệnh nhân tổn thương gan. Do vậy, ñề tài ñược tiến hành nhằm phát hiện các dạng ñột biến gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson thể gan. II. ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. ðối tượng 16 bệnh nhân ñược chẩn ñoán xác ñịnh bệnh Wilson theo thang ñiểm Ferenci ñều có tổng số ñiểm WD ≥ 4, với biểu hiện tăng enzym gan (AST và ALT ≥ 60 UI/l), tăng lượng ñồng trong nước tiểu 24 giờ (≥ 100 µg/ngày), 2 TCNCYH 95 (3) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ceruloplasmin huyết thanh giảm (< 20mg/dl)), có vòng Kayser - Fleischer [6] và phân loại thể lâm sàng theo tiêu chuẩn của Hội Gan Mật quốc tế năm 2003 [7]. Các bệnh nhân thể gan ñược chọn làm ñối tượng nghiên cứu ñều có tăng enzym gan, một số bệnh nhân có biểu hiện suy gan và không có triệu chứng thần kinh. Các bệnh nhân này ñược ñiều trị tại bệnh viện Bạch Mai và bệnh viện Nhi Trung ương. 2. Phương pháp Lấy mẫu bệnh phẩm: 2ml máu tĩnh mạch chống ñông bằng EDTA. Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi: DNA tổng số ñược tách chiết từ máu toàn phần bằng phenol - chloroform - isopropanol (25:24:1). Kỹ thuật giải t rình tự gen: Toàn bộ 21 exon của gen ATP7B ñược khuếch ñại với các cặp mồi ñặc hiệu [2]. Các sản phẩm PCR sẽ ñược tiến hành giải trình tự trực tiếp trên máy ABI 3100 Genetic Analyzer. Kết quả ñược thu thập và xử lý bằng phần mềm ABI PRISMTM 3100 – Avant Data Collection, DNA Sequencing Analysis 5.2 và BLAST NCBI. Các gen ñột biến ñược so sánh t rên ngân hàng gen: DNA (NG - 008806) và mRNA (NM- 000053). 3. Xử lý số liệu Số liệu ñược thu thập theo một mẫu bệnh án nghiên cứu thống nhất. Nghiên cứu ñược thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường ðại học Y Hà Nội. 4. ðạo ñức nghiên cứu Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu và có quyền rút khỏi nghiên cứu khi không ñồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân sẽ ñược thông báo về kết quả xét nghiệm gen ñể giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác ñồ ñiều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân ñược ñảm bảo bí mật. III. KẾT QUẢ Kết quả xác ñịnh ñột biến gen ATP7B Nghiên cứu ñã phát hiện ñược 18 dạng ñột biến trên các exon: 1, 2, 3, 8, 10, 13, 14, 16,18 và 5’UTR. Các ñột biến hay gặp là: p.V456L trên exon 3 (9/18 ñột biến); ñột biến -ins 47/48 CGGCG trên exon 1 (7/18 ñột biến); ñột biến c. -75 C > A vùng 5’ UTR (6/18 ñột biến) (bảng 1). Trong ñó có 4 dạng ñột biến mới chưa ñược công bố, ñó là: p.T850I; c. ins 47/48 CGGCG (hình 1); p.F1240I và p.G50S. Người bình thường Bệnh nhân mã số W11.00 TCNCYH 95 (3) - 2015 3 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 Người bình thường Bệnh nhân mã số W11.00 Hình 1. Hình ảnh giải trình tự gen ATP7B exon 1 và exon 3 của bệnh nhân W11.00 Bảng 1. Kết quả xác ñịnh ñột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson TT Mã số Exon ðột biến Thể ñột Chú Tài liệu 1 W1.00 2 p.S105 Stop ðồng hợp DV Mak CM, (2008) 10 p.K832R (c.2652A > G) Dị hợp SNP Okada T, (2000) 2 W5.00 1 Ins 47/48 CGGCG Dị hợp New 3 p.V456L (c.1523 G > C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) 10 p.T850I (c.2706 C > T) Dị hợp New 3 W11.00 1 ins 47/48 CGGCG Dị hợp New 3 p.V456L (c.1523G >C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) 4 W17.00 5’UTR c.-75C > A ðồng hợp DV Yamaguchi A, 5’UTR c.-118/117 ins GCCGC ðồng hơp DV Gu YH, (2003) 3 p.V456L (c. 1523 G > C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) 10 p.K832R (c.2652A > G) ðồng hợp SNP Okada T, (2000) 5 W19.00 1 ins 47/48 CGGCG Dị hợp New 3 p.V456L (c. 1523 G > C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) 10 p.K832R (c.2652A > G) Dị hợp SNP Okada T, (2000) 12 p.W939C (c.2974G > C) Dị hợp DV Folhoffer A, 13 p.C980S (c.3106G > C; Dị hợp DV Mak CM, (2005) 4 TCNCYH 95 (3) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TT Mã số Exon ðột biến Thể ñột Chú Tài liệu 5 W19.00 13 p.C980 Stop(c.3107C > A) Dị hợp DV Mak CM, (2008) 16 p.F1144I (c.3587T > A) Dị hợp SNP Todorov T, 6 W21.00 1 ins 47/48 CGGCG Dị hợp New 3 p.V456L (c. 1523 G > C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) 7 W22.00 1 ins 47/48 CGGCG Dị hợp New 3 p.V456L (c.1523G > C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) 8 W23.00 14 p.G943D ðồng hợp DV Wan L, (2006) 9 W24.00 5’UTR c.-75C > A ðồng hợp DV Yamaguchi A, (1998) 1 ins 47/48 CGGCG ðồng hợp New 3 p.V456L (c. 1523 G > C) ðồng hợp SNP Gu YH, (2003) 18 p.F1240I (c.3975C > A) Dị hợp New 18 p.N1270I (c.3966A > T) Dị hợp DV Yamaguchi A, 10 W29.00 8 p.T715A (c.2147T > G) Dị hợp DV Gupta A, (2005) 8 p.R778L (c. 2490 G > T) Dị hợp DV Nanji MS, 11 W32.00 1 ins 47/48 CGGCG Dị hợp New 10 p.T850 I (c.2706 C > T) Dị hợp New 12 W33.00 5’UTR c.-75C > A Dị hợp DV Yamaguchi A, 3 p.V456L (c. 1523 G > C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) 10 p.K832R (c.2652A > G) Dị hợp SNP Okada T, (2000) 13 W36.00 5’UTR c.-75C > A Dị hợp DV Yamaguchi A, 2 p.G50S (c.305G > A) Dị hợp New 18 c.4060 + 6 C > T Dị hợp DV Liu XQ, (2004) 14 W40.00 5’UTR c.-75C > A Dị hợp DV Yamaguchi A, 5’UTR c.-118/117 ins GCCGC Dị hợp DV Gu YH, (2003) 3 p.V456L (c. 1523 G > C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) TCNCYH 95 (3) - 2015 5 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 TT Mã số Exon ðột biến Thể ñột Chú Tài liệu 15 W44.00 5’UTR c.-75C > A ðồng hợp DV Yamaguchi A, 5’UTR c.-118/117 ins GCCGC ðồng hợp DV Gu YH, (2003) 16 W45.00 5’UTR c.-75C > A ðồng hợp DV Yamaguchi A, 5’UTR c.-118/117 ins GCCGC ðồng hợp DV Gu YH, (2003) * New: ðột biến mới; DV: Disease Variant (ñột biến gây bệnh); SNP: Single Nucleotide Poly- morphism (tính ña hình ñơn nucleotid) IV. BÀN LUẬN Thống kê từ các nghiên cứu trên Thế giới cho thấy có hơn 300 dạng ñột biến gen gây bệnh Wilson, bao gồm các ñột biến vô nghĩa, sai nghĩa, thêm hoặc bớt nucleotide gây lệch khung dịch mã protein [6]. Tần suất mắc các dạng ñột biến khác nhau giữa các quốc gia và chủng tộc trên Thế giới [8 - 14]. Trong ñó, dạng ñột biến phổ biến nhất ở nhóm bệnh nhân Wilson khu vực châu Âu là ñột biến H1069Q (C3270A) gây ra sự thay thế Histidine thành Glutamine thuộc vùng N của protein ATP7B [10; 12]. ðột biến Arg778Leu trên exon 8 của gen ATP7B ñã ñược công bố là phổ biến nhất trong quần thể người châu Á [9; 11; 13; 14]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi năm 2007 ñã phát hiện 2 bệnh nhân mang ñột biến Arg778Leu dạng dị hợp trong nhóm 29 bệnh nhân ñược phân tích gen [3]. Trong nhóm nghiên cứu này (năm 2012 - 2014), chúng tôi phát hiện ñược 18 dạng ñột biến và chỉ có 1 bệnh nhân mang ñột biến Arg778Leu. Những ñột biến này ñều nằm trong vùng chức năng của protein ATP7B [8]. Cũng trong nghiên cứu này phát hiện ñược 4 dạng ñột biến mới chưa ñược công bố, ñó là: p.T850I (c.2706 C > T); c. ins 47/48 CGGCG; p.F1240I (c.3975C > A) và p.G50S (c.305G > A). Có 7 bệnh nhân (mã số W5.00; W11.00; W 19.00; W21.00; W22.00; W24.00; W32.00) mang ñột biến c. ins 47/48 CGGCG trên exon 1. ðột biến thêm 5 nucleotide CGGCG trong vùng mã hóa acid amin gây lệch toàn bộ khung dịch mã, làm mất khả năng tổng hợp protein. Bệnh nhân có biểu hiện bệnh nặng nếu ñây là ñột biến ñồng hợp tử. Bệnh nhân mã số W5.00 và W32.00 mang ñột biến mới p.T850I (c.2706 C > T) trên exon 10. ðột biến này nằm trong vùng cấu trúc xuyên màng. ðột biến p.T850I làm thay ñổi tính chất acid amin tại vị trí 850 và làm ảnh hưởng ñến chức năng protein. Hơn nữa, cả 2 bệnh nhân này ñều có thêm ñột biến mới c. ins 47/48 CGGCG trên exon 1dạng dị hợp cho nên 2 dạng ñột biến mới này gây nên biểu hiện lâm sàng của bệnh Wilson. Bệnh nhân mã số W36.00 mang ñột biến mới p.G50S (c.305G > A) trên exon 2 và bệnh nhân mã số W24.00 mang ñột biến mới p.F1240I (c.3975C > A) trên exon 18. Cả hai bệnh nhân này ñều mang ñột biến missense nằm trong vùng mã hoá (thay thế nucleotid 6 TCNCYH 95 (3) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC dẫn ñến thay thế acid amin) làm biến ñổi cấu trúc cũng như chức năng của gen ATP7B và biểu hiện bằng các t riệu chứng tích lũy ñồng ở gan. Trong nghiên cứu này, chỉ có 1 trường hợp mang 1 ñột biến (bệnh nhân mã số W23.00): ñột biến p.G943D trên exon 14 dạng ñồng hợp ñã ñược công bố gây bệnh; còn lại 15/16 trường hợp ñều mang ít nhất 2 ñột biến. Trong số các bệnh nhân mang từ 2 ñột biến trở lên có thể là dạng ñồng hợp tử hoặc có thể mang toàn ñột biến dị hợp tử hoặc kèm theo thể biến dị: bệnh nhân mã số W19.00 mang 7 ñột biến ñều là dạng dị hợp tử; bệnh nhân mã số W5.00 mang ñột biến dị hợp p.V456L (c. 1523 G > C) dạng SNP ñược công bố là không gây bệnh nhưng lại có thêm 2 ñột biến dạng dị hợp tử mới p.T850I (c.2706 C > T) và c. ins 47/48 CGGCG. ðiều này có thể giải thích bệnh nhân mang ñột biến dù là dạng dị hợp nhưng ở các vùng chức năng tổng hợp gen và phối hợp nhiều ñột biến dị hợp có thể tạo ra hiệu ứng cộng hưởng gây bệnh. Như vậy, ñột biến gen gây bệnh Wilson thể gan trên gen ATP7B có rất nhiều dạng, trên cùng một bệnh nhân có thể có nhiều ñột biến dị hợp khác nhau tạo nên các biểu hiện tổn thương gan và thay ñổi các chỉ số sinh hóa trong máu và nước tiểu. ðặc ñiểm này cho thấy t ính ña hình của các bệnh lý di truyền gen lặn t rên nhiễm sắc thể thường. V. KẾT LUẬN Nghiên cứu ñã phát hiện ñược 18 ñột biến trong ñó có 4 ñột biến mới chưa ñược công bố (p.T850I, c. ins 47/48 CGGCG, p.F1240I và p.G50S); 11 ñột biến ñã ñược công bố gây bệnh (p.S105Stop, c.-75C > A, c.-118/117 ins GCCGC, p.W939C, p.C980S, p.C980 Stop, p.G943D, p.N1270I, p.T715A, p.R778L, c.4060 + 6 C > T) và 3 ñột biến ở dạng ña hình thái (p.V456L, p.K832R, p.F1144I). Lời cảm ơn Nghiên cứu ñược thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi ðề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu phát hiện ñột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson” và sự giúp ñỡ của các cán bộ của Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Bộ môn Nhi, Trường ðại học Y Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Wilson SAK (1912). Progressive len- ticular degeneration: a familial nervous disease associated with cirrhosis of the liver. Brain, (34), 295 - 507. 2. Bull P, Thomas G R, Forbes J et al (1993). The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes disease gene. Nature Genet, (5), 327 - 337. 3. ðỗ Thanh Hương, Nguyễn Văn Liệu, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Vân Anh (2010). ðột biến gen R778L ở bệnh nhân Wilson Việt Nam. Tạp chí Nhi khoa, (3), 231 - 235. 4. Hồ Cẩm Tú, Tạ Minh Hiếu, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn (2011). Xây dựng quy trình xác ñịnh ñột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson. Tạp chí Nghiên cứu Y học, 74(3), 26 - 29. 5. Nguyễn Thị Mai Hương, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Phương Mai và cộng sự (2013). Xác ñịnh ñột biến gen ATP7B trên vùng hot-spots ở bệnh nhân Wilson. Tạp chí Y học Việt Nam, 407(2), 132 - 135. 6. Peter Ferenci (2006). Regional distribu- tion of mutations of the ATP7B gene in pa- tients with Wilson disease: impact on genetic testing. Hum Genet, (120), 151 - 159. 7. Ferenci P, Caca K, Loudianos G et al (2003). Diagnosis and phenotypic classifica- tion of Wilson disease. Liver International, (23), 139 - 142. TCNCYH 95 (3) - 2015 7 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 Summary IDENTIFICATION OF ATP7B GENE MUTATION IN PATIENTS WITH HEPATIC WILSON DISEASE Objective of the study was to identify ATP7B gene mutation features of hepatic Wilson dis- ease. Sixteen patients with confirmed hepatic Wilson disease on Ferenci’s criteria were analyzed by direct sequencing to identify ATP7B gene mutation. We identified 18 mutations in ATP7B gene: four new mutations have not been published, p.T850I, c. ins 47/48 CGGCG, p.F1240I and p.G50S; eleven identified disease-causing mutations are p.S105Stop, c.-75C > A, c.-118/117 ins GCCGC, p.W939C, p.C980S, p.C980Stop, p.G943D, p.N1270I, p.T715A, p.R778L, and c.4060 + 6 C > T. In addition, three SNP mutations are also identified, p.V456L, p.K832R, and p.F1144I. Keywords: hepatic Wilson disease, ATP7B gene, mutation 8. Michael D. Bates, Nicholas P. Mata- razzo (2009). Different types of anorectal malformations are associated with different combinations of other congenital anomalies. conference on clinical research for rare Dis- eases. 9. Mak CM, Lam CW, Tam S et al (2008). Mutational analysis of 65 Wilson disease patients in Hong Kong Chinese: identification of 17 novel mutations and its genetic heterogeneity. Journal of human genetics. (53), 55 - 63. 10. Curtis D, Durkie M, Balac P et al (1999). A study of Wilson disease mutations in Britain. Human mutation, (14), 304 - 311. 11. Brage A, Tome S, Garcia A et al (2007). Clinical and molecular characterization of Wilson disease in Spanish patients.Hepatol Res, (37), 18 - 26. 12. Wu ZY, Wang N, Lin MT et al (2001). Mutation analysis and the correlation between genotype and phenotype of Arg778Leu muta- tion in chinese patients with Wilson disease. Archives of neurology, (58), 971 - 976. 13. Santhosh S (2006). ATP7B mutations in families in a predominantly Southern Indian cohort of Wilson’s Disease patients. Indian J. Gastroenterol. (25), 277 - 282. 14. Gupta A (2007). Molecular pathologenesis of Wilson disease among Indi- ans: a perspective on mutation spectrum in ATP7B gene, prevalent defects, clinical het- erogeneity an implication towards diagnosis. Cellular and molecular neurobiology, (37), 1023 - 1033.