Nghiên cứu tính đa hình đoạn gen mã hóa carboxylesterase AstV của một số chủng helicobacter pylori phân lập tại Việt Nam - Nguyễn Mai Khánh

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 117-122 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH ĐOẠN GEN MÃ HÓA CARBOXYLESTERASE EstV CỦA MỘT SỐ CHỦNG Helicobacter pylori PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Nguyễn Mai Khánh1, Phạm Thị Vinh Hoa2, Võ Thị Phương1, Phạm Bảo Yên1* 1Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, *cinaus@gmail.com 2Trường Đại học Y tế công cộng TÓM TẮT: Các nghiên cứu gần đây cho thấy lipase đóng vai trò quan trọng trong việc thủy phân lipid màng nhầy dạ dày, giúp vi khuẩn Helicobacter pylori dễ dàng bám dính và xâm nhập dạ dày, gây ra các bệnh dạ dày như viêm loét, ung thư. Lipase gồm phân họ lipase (EC 3.1.1.3), đối tượng của nhiều nghiên cứu, và carboxylesterase (EC 3.1.1.1), đặc biệt là phân lớp V, có rất ít thông tin. Nhằm nghiên cứu tính đa hình ở cấp độ phân tử đồng thời phát hiện các điểm sai khác có khả năng làm phát sinh tính kháng thuốc diệt khuẩn trong trình tự gen mã hóa enzyme này, cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại đoạn gen kích thước xấp xỉ 750 bp với chu trình nhiệt đã tối ưu trên 26 mẫu ADN được tách chiết từ các chủng H. pylori phân lập tại Việt Nam. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR có kích thước dự kiến, không xuất hiện băng phụ, tiếp tục được gửi đọc trình tự và so sánh với chủng tham chiếu H. pylori 26695. Phân tích tính đa hình chỉ ra duy nhất một chủng có tính tương đồng cao (hơn 98% trình tự amino acid chuyển đổi giống trình tự công bố); các trình tự còn lại có sự khác biệt đáng kể với trình tự tham chiếu này. Cụ thể, 14/26 chủng có trình tự khác biệt trên 3% (dựa trên ngưỡng tương đồng về chuỗi polypeptide là 97%). Đặc biệt, một số chủng thể hiện tính đa hình trong vùng trình tự bảo thủ, có thể dẫn tới thay đổi lớn trong hoạt tính enzym cũng như khả năng sống của vi khuẩn. Sắp tới, các thí nghiệm sẽ được tiến hành nhằm nhân dòng gen mã hóa EstV, biểu hiện enzym tái tổ hợp, và xác định ý nghĩa của các điểm đa hình này. Từ khóa: Helicobacter pylori, lipase, đa hình, EstV, nhân dòng. MỞ ĐẦU Vi khuẩn Helicobacter pylori là một trong các nguyên nhân chính gây bệnh viêm loét dạ dày có khả năng phát triển thành ung thư. Năm 1983, Marshall và Warren lần đầu tiên phân lập được Helicobacter pylori, trước đây được gọi là Campylobacter pyloridis [14]. Vi khuẩn này thường tồn tại suốt đời trong dịch niêm mạc dạ dày của bệnh nhân nếu không được điều trị bằng kháng sinh thích hợp [1]. Theo những báo cáo gần đây, khoảng một nửa dân số thế giới bị nhiễm H. pylori và ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, tỷ lệ này lên tới 70% [9, 10]. Trình tự genome hoàn thiện của ba chủng H. pylori cho thấy tính đa dạng di truyền cao, đặc tính này có thể liên quan mật thiết tới cơ chế gây bệnh của vi khuẩn [2]. Duckworth et al. (2009) [3] đã tổng kết được gần 400 protein tham gia vào quá trình sinh trưởng và xâm nhập tế bào vật chủ của H. pylori. Những protein này có thể được sử dụng như là đích tác động của các loại thuốc điều trị tiềm năng. Lần đầu tiên, Slomiany et al. (1989) [15, 16] đã nghiên cứu đặc tính phân hủy lipid và phospholipid màng nhầy dạ dày của lipase, đồng thời cũng nghiên cứu sự ức chế hoạt động của enzyme này bởi hợp chất chống viêm loét subcitrate bismuth và sofalcone. Nhiều nghiên cứu về tác động ức chế hoạt động enzyme của sucralfate, ranitidine bismuth citrate, và các tác nhân chống loét khác [8, 11, 12, 17, 18] cho thấy lipase giữ vai trò quan trọng trong phát triển viêm loét. Gần đây, nhóm nghiên cứu dẫn đầu bởi Ruiz (2007) [13] đã công bố một bài báo về đặc tính của một lipase gọi là EstV có thể góp phần vào sự hình thành và phát triển của viêm loét, bằng chứng là enzyme này có thể bị ức chế bởi hai chất kháng viêm chiết xuất từ ​​thảo dược. Ở Việt Nam, các số liệu cho thấy liệu pháp chuẩn bộ ba gồm bismuth subsalicylate, metronidazole, và clarithromycin, thường cho tỷ lệ chữa khỏi cao (80-90%) đã được khuyến cáo là không nên dùng bởi các chủng đang lưu hành có khả năng kháng kháng sinh mạnh [20]. Các tác giả đã chỉ ra rằng hơn 80% các chủng H. pylori được phân lập ở Việt Nam có khả năng kháng kháng sinh [4, 6]. Khi tính kháng kháng sinh của H. pylori ngày càng gia tăng, việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất ức chế hoạt động của các enzyme tham gia vào quá trình sinh trưởng và xâm nhập tế bào vật chủ có ý nghĩa quan trọng trong việc điều trị các bệnh dạ dày gây ra bởi vi khuẩn H. pylori. Năm 2012, bài báo nghiên cứu về sự đa hình của gen hp1125 mã hóa cho một protein màng ngoài của vi khuẩn nhằm phát triển vắc-xin là một trong những nghiên cứu đầu tiên ở cấp độ phân tử trên đối tượng này [7]. Tuy nhiên, chưa có một nghiên cứu ở cấp độ phân tử về lipase trên các chủng H. pylori tại Việt Nam để hiểu rõ sự liên hệ giữa tính đa hình, khả năng gây viêm loét cũng như tính kháng các hợp chất chống viêm loét của vi khuẩn H. pylori. Nghiên cứu trình bày trong bài báo này về tính đa hình của gen, đặc biệt là các sai khác có khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính lipase, là cần thiết để từ đó định hướng sàng lọc các hợp chất ức chế enzyme nhằm phát triển các hợp chất kháng khuẩn, chống viêm loét mới. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thu thập chủng và tách chiết ADN Các chủng H. pylori được phân lập từ bệnh nhân Việt Nam và được lưu giữ bởi Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. ADN tổng số đã được tách chiết và bảo quản ở -20oC, được chuyển về Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Đại học Khoa học Tự nhiên. Chúng tôi đã tiếp nhận ADN của 26 chủng để tiến hành nghiên cứu tính đa hình đoạn gen mã hóa lipase mong muốn. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN trong mẫu lưu giữ được kiểm tra lại bằng phương pháp đo quang phổ (Nanodrop Technologies, Rockland, DE). Tối ưu hóa quy trình khuếch đại gen mã hóa lipase và xác định trình tự Cặp mồi với trình tự đã được công bố trong nghiên cứu của Ruiz et al. (2010) [‎13] được sử dụng để khuếch đại gen mã hóa lipase: Lipase_FW_1407: 5’-ACTAAGCTTGAATAA GTAAATGGCC-3’ và Lipase_RV_1407: 5’-T GAGAATTCAGCCAACTAAGAC-3’ Phản ứng chuỗi polymerase theo nguyên lý của Mullis (1987) [‎5] được tiến hành với thể tích là 12,5 ml gồm các thành phần phản ứng: 10 ng ADN tổng số; 0,2 pM mỗi mồi; 5 unit Dream Taq ADN polymerase; 0,2 mM dNTPs và đệm cho Dream Taq (10X) tương ứng với chu trình nhiệt trên máy luân nhiệt iCycler Bio-Rad đã được tối ưu hóa như sau: 94oC - 4 phút, 35 chu kỳ (94oC - 30 giây, 52,5oC - 45 giây, 72oC - 30 giây); 72oC - 10 phút; sau đó giữ ở 4oC. Kết quả PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% (g/100 ml). Sản phẩm PCR đặc hiệu có kích thước xấp xỉ 750 bp từ 26 chủng H. pylori được tinh sạch sử dụng bộ kit của Promega (Berg, Cohen và Boyer, 1973) và gửi đọc trình tự trực tiếp theo nguyên lý của Sanger et al. (1975) [14] tại hãng Macrogen, Korea. Phân tích trình tự nucleotide và amino acid của 26 mẫu Kết quả đọc trình tự nucleotide và amino acid sẽ được so sánh với trình tự tham chiếu – trình tự gen HP0739 của chủng H. pylori 26695. Chúng tôi tiến hành phân tích sự đa hình các trình tự gen thu nhận được sử dụng phần mềm Bioedit ( Để phân tích cây phát sinh chủng loại, phương pháp maximum likelihood theo mô hình Jones-Taylor-Thornton được lựa chọn với việc sử dụng phần mềm MEGA phiên bản 6.06 [19]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thu thập chủng và tách chiết ADN Nồng độ và độ tinh sạch của ADN trong mẫu lưu giữ được kiểm tra lại bằng phương pháp đo quang phổ (Nanodrop Technologies, Rockland, DE) (bảng 1, và 2), và điện di trên bản gel agarose 0.8 (hình 1). Kết quả cho thấy các mẫu có nồng độ ADN đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Để tiến hành nhân đoạn gene mã hóa lipase, dung dịch ADN mẫu được pha loãng tới nồng độ 10 ng/ul. Tối ưu hóa quy trình khuyếch đại gen mã hóa lipase và xác định trình tự Sử dụng cặp mồi và chu trình nhiệt được công bố, sản phẩm nhân gen thu nhận được kiểm tra trên bản điện di agarose 0,8% cho thấy, một đoạn ADN có độ dài dự kiến, tuy nhiên hình ảnh băng mờ. Quy trình khuếch đại đoạn gen được tối ưu với việc tăng chu kỳ phản ứng luân nhiệt lên 35 chu kỳ, và đã khuếch đại thành công đoạn gen mã hóa lipase từ 26 mẫu nghiên cứu. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR có kích thước dự kiến, khoảng 750 bp, không xuất hiện băng phụ, được tinh sạch để đọc trình tự trực tiếp (hình 1). Bảng 1. Nồng độ ADN 26 chủng H. pylori được sử dụng trong nghiên cứu: Mẫu Nồng độ (ng/ul) Mẫu Nồng độ (ng/ul) Mẫu Nồng độ (ng/ul) 83 25 91 41 101 19 84 52,5 93 32 102 21 85 52 94 25 103 24,5 86 20,5 95 34 104 15,5 87 34 96 28,5 105 12,5 88 21 97 13 7ab 20 89 42 97 22,5 21ab 20 90 33 99 21,5 24ab 18 91 77,5 100 18 Bảng 2. Độ tinh sạch nồng độ ADN chủng H. pylori được sử dụng trong nghiên cứu: Mẫu OD (260/280) Mẫu OD (260/280) Mẫu OD (260/280) 83 2,1 91 1,7 101 2,1 84 2,1 93 1,8 102 1,8 85 1,7 94 1,3 103 1,7 86 2,5 95 1,5 104 1,6 87 1,8 96 1,6 105 2,2 88 1,9 97 0,9 7ab 1,9 89 1,4 97 1,3 21ab 2,0 90 1,6 99 1,6 24ab 1,1 91 1,3 100 1,7 Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR đại diện cho một số mẫu M: thang ADN 1kb; 90, 91, 100, 7ab, 21ab: sản phẩm PCR từ các chủng 90, 91, 100, 7ab và 21ab; (-, +): sản phẩm PCR mẫu đối chứng âm, dương Hình 2. Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối tương quan giữa gen mã hóa lipase của các chủng thu nhập được và chủng H. pylori 26695 (NC 000915.1). Phân tích trình tự nucleotide và amino acid của 26 mẫu Trình tự gen được phân tích và so sánh với chủng tham chiếu H. pylori 26695. Độ dài trình tự được phân tích bao gồm cả các cách đoạn là 630 nucleotide và 176 amino acid. Phân tích tính đa hình trình tự nucleotide và amino acid thu được cho thấy duy nhất chủng 21ab có tính tương đồng cao (hơn 98% trình tự amino acid chuyển đổi giống trình tự công bố); các trình tự còn lại có sự khác biệt đáng kể với trình tự tham chiếu này (hình 2). Cụ thể, 14/26 chủng có trình tự khác biệt trên 3% (dựa trên ngưỡng tương đồng về chuỗi polypeptide là 97%), hầu hết là thay thế cặp nucleotide ở khung đọc mở. Kết quả phân tích trình tự chủng 91 có sự khác biệt nhất so với chủng tham chiếu với mức độ tương đồng ở trình tự nucleotide là 96%, và ở trình tự amino acid chuyển đổi là 98%. Theo đó, 2 trong số 4 điểm amino acid khác biệt nằm trong vùng bảo thủ 3 và 4 đã được nghiên cứu trước đây [13]: A thay thế cho V ở vị trí 95, và I thay thế cho M ở vị trí 113 (hình 3). Tính đa hình trong vùng trình tự bảo thủ này có thể dẫn tới thay đổi lớn trong hoạt tính enzyme cũng như khả năng sống của vi khuẩn. Một điểm phát hiện đáng chú ý là sự thay thế amino acid D cho G ở vị trí 89 được tìm thấy ở tất cả các chủng H. pylori phân lập tại Việt Nam. Hình 3. Một số điểm đa hình tiêu biểu trên trình tự gen mã hóa lipase của các chủng H. pylori phân lập tại Việt Nam với chủng tham chiếu H. pylori 26695 (NC 000915.1). Giả thiết về mối liên hệ giữa tính đa hình di truyền và khả năng kháng hợp chất ức chế viêm loét vẫn còn chưa được hiểu rõ, vì vậy, nghiên cứu nhân dòng gen mã hóa EstV sẽ được tiến hành để biểu hiện hoạt tính enzyme tái tổ hợp nhằm xác định ý nghĩa của các điểm đa hình này. KẾT LUẬN Chúng tôi đã khuếch đại đoạn gen mã hóa lipase thành công với cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được tối ưu hóa. Trình tự đoạn gen của 26 chủng H. pylori đã được phân tích tính đa hình và tính tương đồng với chủng tham chiếu H. pylori 26695. Phân tích tính đa hình chỉ ra duy nhất một chủng có tính tương đồng cao; các trình tự còn lại có sự khác biệt đáng kể với trình tự tham chiếu. Việc phân lập các chủng H. pylori để phân tích tính đa hình với số lượng lớn hơn là cần thiết. Sắp tới, nhóm nghiên cứu sẽ tiến hành nhân dòng gen mã hóa EstV được lựa chọn từ các chủng dựa trên phân tích tính đa hình để, biểu hiện enzyme tái tổ hợp nhằm xác định vai trò và ý nghĩa của các điểm đa hình này tới hoạt tính lipase trong mối liên quan với tính kháng hợp chất ức chế viêm loét. Lời cảm ơn: Chương trình nghiên cứu nằm trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu lipase và peptide deformylase của các chủng vi khuẩn Helicobacter pylori phân lập ở Việt Nam: tính đa hình di truyền, tinh sạch và biểu biện enzym tái tổ hợp và kiểm tra khả năng ức chế bởi các dịch chiết thảo dược nhằm định hướng phát triển thuốc” được Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia - Bộ Khoa học và Công nghệ tài trợ (Số 106-NN.02-2013.55). TÀI LIỆU THAM KHẢO Blaser M. J., 1997. Helicobacter pylori eradication and its implications for the future. Aliment Pharmacol Ther., 11(Sup. 1): 103-107. Devi S. H., Taylor T. D., Avasthi T. S., Kondo S., Suzuki Y., Megraud F., Ahmed N., 2010. Genome of Helicobacter pylori strain 908. J Bacteriol. 192(24): 6488-6489. Duckworth M. J., Okoli A. S., Mendz G. L., 2009. Novel Helicobacter pylori therapeutic targets: the unusual suspects. Expert Rev Anti Infect Ther, 7(7): 835-867. Đào Hữu Khôi, Nguyễn Công Kiểm, Nguyễn Thị Thanh Tâm, Nguyễn Hữu Tiếng, Lê Thị Thanh Túc, Nguyễn Thị Thanh Tú, Tô Văn Quyền, Bùi Hữu Hoàng, 2010. Hiệu quả phác đồ Omeprazol+Amoxicillin+Levofloxacin so với Omeprazol+Amoxicillin+Clarithromycin trong điều trị tiệt trừ Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm loét dạ dày. Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, 14(1): 184-198. Mullis K. B., Faloona F. A., 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155: 335-350. Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Trần Văn Hợp, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2010. Khảo sát tính kháng thuốc các chủng Helicobacter pylori phân lập từ các bệnh nhân viêm dạ dày mạn tính, loét dạ dày và ung thư dạ dày. Tạp chí Y học thực hành, 4(712): 20-22. Nguyễn Đức Toàn, Nguyễn Văn Thịnh, Nguyễn Thị Nguyệt, Dương Thu Hương, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2012. Tình hình kháng kháng sinh của Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày và loét tá tràng. Tạp chí Khoa học tiêu hóa Việt Nam, 7(27): 1783-1788. Ottlecz A., Romero J. J., Hazell S. L., Graham D. Y., Lichtenberger L. M., 1993. Phospholipase activity of Helicobacter pylori and its inhibition by bismuth salts. Biochemical and biophysical studies. Dig. Dis. Sci., 38: 2071-2080. Parsonnet J., 1995. The incidence of Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol Ther., 9(Sup. 2): 45-51. Parsonnet J., 1998. Helicobacter pylori: thesize of the problem. Gut., 43(Sup. 1): S6-9. Piotrowski, J., Slomiany A., Liu J., Fekete Z., Slomiany B. L., 1991. Effect of nitecapone on the proteolytic and lipolytic activities of Helicobacter pylori. Biochem. Life Sci. Adv., 10: 79-83. Piotrowski J., Czajkowski A., Yotsumoto F., Slomiany A., Slomiany B. L., 1994. Sulglycotide effect on the proteolytic and lipolytic activities of Helicobacter pylori toward gastric mucus. Am. J. Gastroenterol., 89: 232-236. Ruiz C., Falcocchio S., Pastor F. I., Saso L., Diaz P., 2007. Helicobacter pylori EstV: identification, cloning, and characterization of the first lipase isolated from an epsilon-proteobacterium. Appl. Environ. Microbiol, 73(8): 2423-31. Sanger F., Coulson A. R., 1975. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J. Mol. Biol., 94(3): 441-448. Slomiany B. L., Kasinathan C., Slomiany A., 1989. Lipolytic activity of Campylobacter pylori: effect of colloidal bismuth subcitrate (De-Nol). Am. J. Gastroenterol., 84: 1273-1277. Slomiany B. L., Nishikawa H., Piotrowski J., Okazaki K., Slomiany A., 1989. Lipolytic activity of Campylobacter pylori: effect of sofalcone. Digestion, 43: 33-40. Slomiany B. L., Piotrowski J., Mojtahed H., Slomiany A., 1992. Ebrotidine effect on the proteolyitc and lipolytic activities of Helicobacter pylori. Gen. Pharmacol., 23: 203-206. Slomiany B. L., Piotrowski J., Slomiany A., 1992. Effect of sucralfate on the degradation of human gastric mucus by Helicobacter pylori proteases and lipases. Am. J. Gastroenterol., 87: 595-599. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S., 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol., 24(8): 1596-1599. Tạ Long, Trần Ngọc Bảo, Phạm Thị Thu Hồ, 2012. Đồng thuận về chẩn đoán và điều trị nhiễm Helicobacter pylori ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học tiêu hóa Việt Nam, 7(29): 1929-194. Warren J. R., Marshall B., 1983. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. The Lancet., 321(8336): 1273-1275. GENETIC POLYMORPHISM STUDIES OF A GENE ENCODING LIPASE FROM Helicobacter pylori STRAINS ISOLATED IN VIETNAM Nguyen Mai Khanh1, Pham Thi Vinh Hoa2, Vo Thi Phuong1, Pham Bao Yen1 1Ha Noi University of Science, VNU, Hanoi 2Hanoi School of Public Health SUMMARY Recent studies show that lipase plays an important role in lipid hydrolysis of gastric mucosa, helping Helicobacter pylori bacteria attach and penetrate the stomach, causing gastric ulcer diseases that could develop into cancer. Lipase can be divided into two main groups including lipase (EC 3.1.1.3) and carboxylesterase (EC 3.1.1.1). Interestingly, there has been not much information about the subgroup lipase V, which belongs to the latter. To study the polymorphism at the molecular level and to clone the gene coding for EstV, twenty-six H. pylori strains in Vietnam were isolated for DNA extraction and amplification using specifically designed primers and optimized thermal cycle. The expected PCR product had approximately 750 bp. The electrophoresis results showed a single band as expected without smear and unspecific bands. The PCR product was then sequenced and analyzed by comparison with the H. pylori 26695 strain. The polymorphism analysis showed that only one strain with high similarity with the reference strain (98% similarity in translated amino acid sequence). Specially, 14/26 strains had sequences with more than 3% differences (based on 97% cut off of polypeptide sequence). Interestingly, some strains show polymorphism in the highly conserved amino acid blocks, which could significantly affect the activity of enzyme as well as the survival of the microorganism. To identify the significance of nucleotide changes, the EstV coding gene will be inserted into a cloning vector and the activity of the expressed recombinant enzyme will be characterized. Keywords: Helicobacter pylori, cloning lipase, EstV, polymorphism. Ngày nhận bài: 22-10-2014