Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng - Bài 2: Sinh học của tế bào nuôi cấy
SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO
– phụ thuộc vào trạng thái tự nhiên của tế bào:
• Vai trò của bộ gen – Giới hạn Hayflick
• Vai trò của sự biểu hiện gen
– phụ thuộc Môi trường nuôi cấy
• Cơ chất tế bào bám
• Thành phần sinh lí và sinh hoá của môi trường nuôi
• Thành phần của phase khí
• Nhiệt độ nuôi
• Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền
34 trang |
Chia sẻ: Tiểu Khải Minh | Ngày: 17/02/2024 | Lượt xem: 120 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng - Bài 2: Sinh học của tế bào nuôi cấy, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn 1
SINH HỌC CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Đặc điểm sinh học của
tế bào
Các yếu tố ảnh hưởng
đến sự thành công của
nuôi cấy tế bào
9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn
ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn
Tăng trưởng và phân chia chậm
Tính chất cần giá đỡ
Tính cơ học yếu
Thay đổi kiểu gen và kiểu hình
Cơ chế kìm hãm ngược
Có thể được bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu
..9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn
Phân chia chậm
Tăng trưởng, phân chia chậm (20-40 giờ)
Hiệu suất sinh chất có hoạt tính sinh học thấp
9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn
Chu kì tế bào
M
Mitosis
G1
Gap1
G2
Gap2
G0
S
Synthesis Điểm kiểm soát G2• cell big
• environment suitable
Điểm kiểm soát G2
• DNA replicated
• cell big
• environment suitable
Điểm kiểm
soát
Metaphase
• NST sắp xếp
trên mặt phẳng
thoi vô sắc
Interphase:
• Kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động
vật có vú
• Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein
và phát triển về kích thước
o Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi
chu kì tế bào và không phân chia
o Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích
thước, tổng hợp RNA và protein,
có 1 G1 Checkpoint
o S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra
o Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục
phát triển và sản xuất các protein
mới. Có 1 G2 Checkpoint
Mitosis hay M Phase:
• Sự phát triển và tổng hợp protein
• Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau.
• Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ
• Có Checkpoint trong giữa kì của
Mitosis (Metaphase Checkpoint) để
đảm bảo tế bào hoàn thành xong sự
phân chia.
• Là điểm quan trọng quyết
định sự phân chia của tế
• Khi tế bào vượt qua điểm này,
đi vào phase S, quá trình
phân chia không thể đảo
ngược.
Điểm kiểm soát G1
• Đảm bảo tế bào phân chia
thuận lợi
• Nếu tế bào bị lỗi hoặc tổn
thương, G2 checkpoint sẽ
dừng lại để sửa chữa
• Nếu tổn thương không thể
đảo ngược, tế bào đi vào
quá trình apoptosis à đảm
bảo DNA hư hỏng tế bào
không truyền cho thế hệ
sauà quan trọng trong ngăn
ngừa ung thư
Điểm kiểm soát G2
Điểm kiểm soát thoi vô sắc
Tính chất cần giá đỡ
-TB bám vào giá đỡ để có thể sống sót, phân chia
- Ngoại trừ: hồng cầu, TB ung thư, 1 số dòng TB liên
tục
9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn
Tính cơ học yếu
Không có vách tế bàoè tế bào dễ tổn thương
9/16/19 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn
è Tế bào dễ biến đổi
Thay đổi kiểu gen và kiểu hình
Dung hợp, biến nạp, tải nạp à tế
bào thay đổi kiểu gen và kiểu hình
• Ở mỗi tế bào phân chia,
sự tự làm mới và biệt hoá
được quyết định bởi
tương tác của yếu tố bên
trong và tín hiệu hướng
dẫn hoặc tín hiệu chọn lọc
bên ngoài
Thay đổi kiểu gen và kiểu hình
1
MSC của các loài có khả năng biệt
hoá thành tế bào mỡ như nhau ở
pass 5 (6-8 ngày)
2
rASC và hBMMSC thời gian tạo
giọt mỡ dài hơn ở pass10; không
có khả năng tạo mỡ sau pass 15
3
rBMMSC và hASC: ít thay đổi khả
năng biệt hoá, thời gian hình
thành giọt mỡ không khác nhau
cho đến pass 20
Thay đổi kiểu gen và kiểu hình
hASC và rBMMSC biệt hoá thành dòng tế bào
tạo xương trong suốt quá trình nuôi cấy
rASC và hBMMSC mất khả năng biệt hoá thành
dòng tế bào tạo xương sau pass 10
KÌM HÃM
TIẾP XÚC
- ĐIỀU HOÀ
SỰ TĂNG
SINH
• Kìm hãm tiếp xúc
• Kích thích sự tăng sinh
– Mật độ thấp
– Các tín hiệu từ môi trường:
các nhân tố tăng trưởng
• Ức chế sự tăng sinh
– Giới hạn mật độ: mật độ tế
bào cao
– Kìm hãm tiếp xúc: tương
tác tế bào
– Các tín hiệu từ môi trường:
p53 gene product
14
Các yếu tố ảnh hưởng
đến sự thành công của
nuôi cấy tế bào (tăng sinh
invitro)
9/16/19TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn
SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ
BÀO
– phụ thuộc vào trạng thái tự nhiên của tế bào:
• Vai trò của bộ gen – Giới hạn Hayflick
• Vai trò của sự biểu hiện gen
– phụ thuộc Môi trường nuôi cấy
• Cơ chất tế bào bám
• Thành phần sinh lí và sinh hoá của môi trường nuôi
• Thành phần của phase khí
• Nhiệt độ nuôi
• Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền
1
6
Vai trò của bộ gen -giới hạn HayFlick
Leonard
Hayflick
(1965)
Tế bào
phân
chia 50-
70 lần
Vai trò của bộ gen
Chiều dài telomere giảm
theo tuổi
1
Hoạt tính của
telomerase cao nhất ở
các pass đầu tiên
2
Mức độ hoạt động của
telomerase khác nhau
giữa các loài và các
nguồn thu: giảm nhiều
nhất ở rASC và
hBMMSC
3
Thời gian nhân đôi của rBMMSC không thay đổi
trong suốt quá trình nuôi trong khi ở hASC, rASC,
hBMMSC thời gian này tăng gấp 2
Izadpanah R, Trygg C, Patel B, et al. Biologic Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived
From Bone Marrow and Adipose Tissue. Journal of cellular biochemistry. 2006;99(5):1285
Yếu tố phiên mã
Chịu trách nhiệm điều hoà đặc tính sinh
học của tế bào
POU được mã hoá bởi Oct-4
Oct-2 , Sox-2 và Rex 1 điều hoà chặt chẽ trong quá
trình phát triển phôi
Duy trì tính đa tiềm năng của tế bào
Các yếu tố khác (bổ sung từ ngoài): định
hướng sự biệt hoá của tế bào
BMP-6, TGF-β3, dexamethasone, ascorbate 2-
phosphate, proline, pyruvate, insulin, transferrin,
selenous acid, 5aza-cystidine
22
SỰ BÁM DÍNH IN VITRO
• Sự bám dính tế
bào là cần thiết
cho sự tăng
sinh và biệt
hóa
• Các phân tử
bám dính tế
bào:
– Tương tác tế
bào-tế bào:
CAMs,
cadherins
– Tương tác tế
bào-chất nền:
integrin,
transmembra
me
proteoglycan
• Phức hợp nối chặt (Tight junctional complex)
trong tế bào biểu mô cho sự tương tác tế
bào-tế bào.
Các nhân tố
ảnh hưởng
đến sự bám
dính
23
• Sự phân tách bằng enzyme: tiêu hủy các phân
tử bám dính và chất nền ngoại bào
• Hầu hết tế bào từ mô rắn phát triển dạng lớp
đơn (monolayer)
• Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích sự tăng
sinh và biệt hóa của tế bào
Experimental Methods 2006
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự
thành công của nuôi cấy tế bào
Experimental Methods 2006 24
Tế bào thích hợp Điều kiện thích hợp
Phase rắn
• Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển
eg. glass, plastic, collagen, agar
Phase lỏng
• Các đặc tính sinh lí và lí hóa của thành
phần môi trường nuôi
Phase khí
Nhiệt độ
Độ vô trùng của môi trường
Pha rắn
• Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và
di chuyển
• Dụng cụ phổ biến nâất là polystyrene plastic
• Những cơ chất khác như glass, filter wells
• Bề mặt có têể được xử lí với:
• Phủ với cơ chất nền như Collagen, poly-l-lysine,
matrigel
• Lớp feeder: monolayer of supporting cells,
perhaps promote cell growth and differentiation
by cell contact and substance secreted
• Neurons on glial cell feeder layers
Phase lỏng
• Thành phần của môi trường
– Muối vô cơ
• Cân bằng áp suất thẩm thấu
• Điều hòa điện thế màng: sodium, potassium và calcium ions.
• Cần thiết cho sự bám dính như enzyme cofactor.
– Carbohydrate
• Hầu hết chứa 4-20 mM glucose
• Nguồn năng lượng: glycolysis
Phase lỏng
– Proteins and Peptides
• Được sử dụng để thay thế hiện diện trong huyết thanh eg. transferrin,
fibronectin
– Amino acids
• Quan trọng cho sự tăng sinh và biệt hóa
• glutamine có thể đi vào chu trình Kreb’s cycle
– Fatty Acids and Lipid
• Quan trọng trong môi trường serum free media e.g. cholesterol and
steroids cần thiết cho các tế bào đặc biệt.
Phase lỏng
– Vitamin
• vitamins B cần thiết cho sự phát triển và sự tăng sinh
• Tiền chất cho các co-factors
• Vitamins thường sử dụng là thiamine, riboflavin and biotin
– Trace Element
• zinc, copper, selenium và tricarboxylic acid intermediates.
• Selenium is a detoxifier và giúp tách các gốc O2 tự do
Phase lỏng
– Hệ đệm
• Hầu hết các tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4
• Kiểm soát pH cần thiết cho nuôi cấy tối ưu:
– Hệ thống đệm bicarbonate/CO2
– Hệ đệm hóa chất: HEPES
• Môi trường nuôi cấy thương mại như pH indicator
– vàng (acid) hay hồng (alkali)
– Áp suất thẩm thấu
• Tương tự áp suất thẩm thấu 290 mOsm
Phase lỏng
– Huyết thanh
• Nhân tố không xác định: albumins, growth factors và growth inhibitors
• Gia tăng khả năng đệm
• Tăng khả năng bám dính và trung hòa chất độc
• Quan trọng cho các tế bào phát triển chậm hay khi nuôi mật độ thấp
• Biến thiến từng mẻ
• Huyết thanh bất họat nhiệt (incubation at 56ºC for 30 minutes) có thể giúp
giảm rủi ro nhiễm
Experimental Methods 2006 31
Phase khí
– Carbondioxide
• Quan trọng cho hệ đệm
– 5-10% CO2
– Sản xuất sản phẩm: pyruvate
– Oxy
• Hầu hết tế bào cần thiết phân áp oxy thấp
• anaerobic glycolysis
• Nồng độ oxy cao có thể gia tăng gốc O2 tự do
H3C C C O-
O O
C S
O
H3C CoA
HSCo A
NAD+ NADH
+ CO2
Pyruvate Dehydrogenase
pyruvate acetyl-CoA
Experimental Methods 2006 32
Hình dạng tế bào khi nuôi
• Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính:
– Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào)
• Dòng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma)
– Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi.
• Tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal,
fibroblasts
Hela-Epithelial
MRC5-Fibroblast SHSY5Y-Neuronal
BAE1-Endothelial
Nhiệt độ
– Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài
• Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận
• Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be
lower than the rest of the body)
Experimental Methods 2006 33
10/9/17 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- bai_giang_nuoi_cay_te_bao_dong_vat_ki_thuat_va_ung_dung_bai.pdf