Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên bề mặt của virus H5N1 phục vụ sản xuất vaccine thực vật

Nguyễn Thu Hiền và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 123 - 127 123 NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT Nguyễn Thu Hiền1, Chu Hoàng Mậu1*, Lê Văn Sơn2, Chu Hoàng Hà2 1 Đại học Thái Nguyên; 2 Viện công nghệ sinh học,VAST TÓM TẮT H5N1 là một phân nhóm của cúm A, nó ảnh hưởng đến sức khỏe con người do tiếp xúc trực tiếp với gia cầm nhiễm bệnh. Để ngăn chặn sự lây nhiễm virus, các phương pháp phổ biến nhất hiện nay là tiêm phòng. Hiện nay, đã có nhiều loại vắc xin phòng bệnh cúm A/H5N1 được bán sẵn trên thị trường. Tuy nhiên, vaccine đường miệng là mục tiêu nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới, bởi vì vaccine này có thể ăn được, dễ quản lý và có khả năng kích thích cơ thể sản xuất kháng thể có hiệu quả hơn so với các loại vaccine tiêm. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu tạo cây đậu tương biến đổi gen ở giống đậu tương DT12 trồng phổ biến ở Việt Nam, bằng cách lây nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens mang vector tái tổ hợp vào nách lá mầm. Kiểm tra các cây chuyển gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, kết quả đã có 8 cây dương tính với PCR. Các kết quả này là cơ sở cho việc tạo các giống đậu tương biến đổi gen có thể sản xuất kháng nguyên phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam Từ khoá: Biểu hiện, kháng nguyên, thực vật chuyển gen, H5N1, vaccine thực vật. MỞ ĐẦU* Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, có khả năng lan truyền từ động vật sang người. Theo Tổ chức y tế thế giới (WHO) tính từ 2003 đến nay toàn thế giới ghi nhận 562 trường hợp mắc cúm A/H5N1 ở 15 quốc gia trong đó có 329 trường hợp tử vong còn ở Việt Nam có 119 trường hợp mắc trong đó 59 trường hợp tử vong (WHO 2011). Đối với dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người.Vaccine ăn được ở thực vật là vaccine tiểu phần protein được sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu được protein làm miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine này bền vững trong dịch tiêu hóa, đi qua đường tiêu hóa mà không bị phân hủy [5]. Với sự phát triển của công nghệ sinh học, diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới ngày càng tăng trong đó đậu tương biến đổi gen chiếm diện tích lớn nhất trong tổng diện tích cây trồng biến đổi gen.Một trong * Tel: 0913383289;Email: mauchdhtn@gmail.com những biện pháp chuyển gen mang lại hiệu quả cao và đang được áp dụng rộng rãi hiện nay là phương pháp chuyển gen thông qua A.tumfaciens [6]. Trong bài báo này chúng tôi đã sử dụng giống đậu tương DT12 làm đối tượng để chuyển gen mã hoá hemaglutinin(HA1) của virus H5N1 thông qua phương pháp nách lá mầm nhờ vi khuẩn A.tumfaciens nhằm cơ sở cho việc sản xuất vaccine ăn được cho gia cầm phòng chống bệnh A/H5N1. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Giống đậu tương ĐT12 do Trung tâm Nghiên cứu Phát triển cây đậu đỗ, Viện cây lương thực và cây thực phẩm cung cấp. Chủng vi khuẩn A.tumefaciens EHA105 chứa vector pBeta-Phaso-HA do Viện công nghệ sinh học cung cấp. Phương pháp nghiên cứu Tạo nguyên liệu chuyển gen Hạt đậu tương chín sau khi được khử trùng, nảy mầm hạt, tách và thu phần lá mầm (tương tự như tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro trong quy trình tái sinh cây) sẽ được gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 7-8 lần vào nách lá mầm. Lá mầm đã được làm tổn thương sẽ dùng cho bước nhiễm khuẩn tiếp theo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Thu Hiền và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 123 - 127 124 Bảng 1. Thành phần các môi trường trong tái sinh cây đậu tương Môi trường Thành phần Nảy mầm hạt (GM) 3,052 g/l muối B5 + 20 g/l sucrose + 6 g/l agar, pH = 5,8. 1 mg/l vitamin B5 Môi trường đồng nuôi cấy (CCM) 0,3052 g/l muối B5 + 3,9 g/l MES + 30 g/l sucrose, pH = 5,4 1 mg/l vitamin B5 + 1,0 - 3,0 mg/l BAP+ 0,2 mM acetosyringon + 400 mg/l L- cystein + 158 mg/l sodium thiosulfate + 154 mg/l DTT + 0,25 mg/l GA3 Môi trường cảm ứng tạo chồi (SIM) 3,052 g/l muối B5 + 0,59 g/l MES + 30 g/l sucrose, pH = 5,6 1 mg/l vitamin B5 + 1,0 - 3,0 mg/l BAP + 50 mg/l Timentin + 200 mg/l Cefotaxim + 50 mg/l Vancomycin + 75 mg/l Kanamycin Môi trường kéo dài chồi (SEM) 4,3 g/l MS + 0,59 g/l MES + 30 g/l sucrose + 6 g/l agar, pH = 5,6. 1 mg/l vitamin B5 + 50 mg/l L-asparagine + 100 mg/l L-pyron glutamic acid + 0,1 - 0,5 mg/l IAA + 0,5 -1,5 mg/l GA3+ 50 mg/l Timentin + 200 mg/l Cefotaxim + 50 mg/l Vancomycin + 75 mg/l Kanamycin Môi trường tạo rễ (RM) 1,58 g/l MS + 0,59 g/l MES + 20 g/l sucrose + 6 g/l agar, pH = 5,6 0,1 mg/l IBA + 1 mg/l vitamin B5+ 50 mg/l Timentin + 200 mg/l Cefotaxim + 50 mg/l Vancomycin + 75 mg/l Kanamycin Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: cấy trải A. tumefaciens EHA 105 mang vector chuyển gen giữ chủng trong glycerol lên đĩa môi trường YEP đặc, có bổ sung kháng sinh là: 50 g/l rifamycin và 100 mg/l spectinomycin. Đĩa khuẩn được đặt ở tủ 280C trong điều kiện tối 2 ngày. Nuôi lỏng vi khuẩn: dùng que cấy chọn một khuẩn lạc trong đĩa khuẩn cho vào 50 ml YEP lỏngcó bổ sung 50 g/l rifamycin và 100 mg/l spectinomycin. Nuôi lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 16h. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: dịch khuẩn thu từ quá trình nuôi lỏng được ly tâm ở 5000v/p trong 10 phút ở 40C. Loại bỏ phần dịch nổi và hòa tan cặn khuẩn trong môi trường CCM lỏng có bổ sung acetosyringone 200 mg/l và pha loãng cho đến khi dịch khuẩn có OD660nm đạt 0,8-1. Dịch huyền phù này được dùng cho biến nạp. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy Môi trường đồng nuôi cấy là CCM đặc có bổ sung acetosyringone 200 mg/l, thành phần môi trường được chỉ ra trong bảng 1.CCM được đổ trên đĩa petri, khi khô đặt giấy thấm đã khử trùng lên trên bề mặt môi trường. Mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 5 ngày. Diệt khuẩn và tạo đa chồi Mẫu sau thời gian đồng nuôi cấy được lắc trong môi trường SIM lỏng có bổ sung 500 mg/l cefotaxim trong thời gian là 10 phút. Sau đó, đặt mẫu lên giấy thấm khử trùng, thấm khô mẫu. Dùng panh và dao cắt bỏ chồi chính xuất hiện trên các mảnh lá mầm, cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi SIM đặc, có bổ sung 500 mg/l cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ dung 500 mg/l cefotaxim, trong 2 tuần. Tái sinh cây hoàn chỉnh Các cụm chồi sống được trên môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM có bổ sung kháng sinh 500 mg/l cefotaxim và 50mg/l kanamycine. Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3-5 cm thì được chuyển sang môi trường ra rễ RM có bổ sung 250 mg/l cefotaxim và 25mg/l kanamycine. Cây To tái sinh hoàn chỉnh được chuyển ra trồng trên đất chăm sóc trong nhà lưới. Kiểm tra cây chuyển gen bằng phản ứng PCR DNA của cây được tách chiết theo phưong pháp của Edwards(1991) [7].Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen HA1 theo chu kì nhiệt: 940C/5 phút 30 chu kì Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Thu Hiền và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 123 - 127 125 (940CC/30 giây, 540C/30 giây, 720C/1 phút 30 giây 720C/7 phút và 40C/30 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8%. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá khả năng tạo chồi Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như nguồn vật liệu ban đầu, môi trường nuôi cấy, thời gian nhiễm khuẩn, vector chuyển gen, Trong nghiên cứu này, cây mầm 4 – 5 ngày tuổi được sử dụng làm vật liệu chuyển gen bởi ở giai đoạn này, việc tách đôi hai lá mầm được thực hiện dễ dàng, đồng thời chồi ngọn và chồi bên có thể được phát hiện và loại bỏ nhằm tránh hiện tượng ưu thế ngọn ảnh hưởng đến sự phát triển của các mô phân sinh phụ nằm ở vùng nách lá mầm.Việc sử dụng dao gây tổn thương nách lá mầm giúp cho mẫu vật sản sinh ra các hợp chất phenolic có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn, làm tăng cường khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn. Ngoài ra, tổ hợp các hợp chất có chứa thiol (L-cysteine, dithiothreitol và sodium thiosulfate) được bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy CCM giúp làm tăng khả năng gắn T-DNA vào bộ gen thực vật và do đó tăng hiệu quả chuyển gen (Olhoft et al., 2001). Tiến hành thí nghiệm với tổng số 650 mẫu cho chuyển gen HA, có 65 chồi kéo dài trên môi trường chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, trong đó 45 chồi có khả năng ra rễ và thu nhận được 32 cây T0 phát triển trên giá thể (bảng2). Bảng 2. Khả năng tái sinh thông qua nách lá mầm của giống đậu tương ĐT12 Lô thí nghiệm Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo chồi Số chồi kéo dài Số chồi ra rễ Số cây sống trên giá thể 1 250 80 30 16 12 2 220 70 25 25 10 3 180 55 20 14 10 Tổng 650 205 65 45 32 Hình 1. Quy trình chuyển gen ở đậu tương Hạt sau khử trùng 3 ngày Gây nhiễm 40’ Cảm ứng tạo chồi trên SIM-Km50/5d Chọn lọc trên SIM- Km75/4 tuần Kéo dài chồi trên SEM-Km50/ 4 -8 tuần Ra rễ trên RM/4 tuần Hạt đậu tương Ra cây trên cát/trấu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Thu Hiền và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 123 - 127 126 Kết quả kiểm tra cây chuyển gen HA bằng phản ứng PCR Sử dụng 3µl sản phẩm DNA đã được tách chiết, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy đã thu nhận được 8 cây dương tính với phản ứng PCR nhân gen HA, chiếm tỷ lệ 1,2 % tổng mẫu biến nạp (Hình2). Các dòng cây này đang được tiếp tục trồng để thu hạt và đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển ở các thế hệ sau( hình 3). Hình 2. Phân tích cây đậu tương T0 chuyển gen HA .M: Thang DNA chuẩn 1kb; -: Đối chứng âm; WT: Cây không chuyển gen; 1 – 8: Các dòng T0 được phân tích; +: Đối chứng dương (plasmid) KẾT LUẬN Hình 3 . Các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 được trồng trong nhà lưới. Sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm nhờ vi khuẩn A.tumefacien, bước đầu đã thu được 8 dòng cây T0 mang gen HA. Đây là tiền đề quan trong cho việc tạo được các dòng đậu tương mang gen mã hoá cho các kháng nguyên của virus H5N1 làm vacine ăn đựơc cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1 ở Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Bardiya N and Bae JH (2005). Influenza vaccines: recent advances in production technologies. Appl Microbiol Biotechno 67: 299 – 305. [2]. Biemelt S, Sonnewald U, Galmbacher P, Willmitzer L, Mueller M (2003). Production of Human Papillomavirus Type 16 Virus-Like Particles in Transgenic Plants. J Virol 77: 9211-9220. [3]. Binh LT and Trang CH (2005). Research and development of plant edible vaccines. J Biotech 3: 133-143. [4]. Bolivar FM, Wright R, Funk V, Sentz D, Barrroso L, Wilkins TD, Petri W, Cramer CL (2003). A non – toxic lectin for antigen delivery of plant – based mucosal vaccine. Vaccine 21: 997-1005. [5]. Dinh DK, Le TH, Nong VH, Phan VC, Nguyen BN, Nguyen DT and Le TB (2004). Molecular analysis of the avian influenza virus H5N1 isolated inpoultry in Vietnam. GenBank Acc Number AY574192. [6]. Donaldson PA, Simmonds DH (2000). Susceptibility of A.tumefaciens andcotyledonary node transformation in shor-season soybean. Plant Cell Rep 19: 478-484. [7]. Edwards K, Johnstone C and Thompson C (1991). A simple and rapid method for thepreparation of genomic plant DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res 19: 1349. [8]. Fischer R, Stoger E, Schillberg S, ChristouP and Twyman RM (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. CurrOpinion in Plant Biol 7: 152-158. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Thu Hiền và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 123 - 127 127 SUMMARY THE STUDY CREATED TRANSGENIC SOYBEAN CULTIVARS BEARING STRUCTURE EXPRESSED GENES ENCODING SURFACE ANTIGEN OF THE H5N1 VIRUS FOR PRODUCTION OF PLANT VACCINE Nguyễn Thu Hien1, Chu Hoang Mau1*, Le Van Son2, Chu Hoang Ha2 1Thai Nguyen University, 2Institute of Biotechnology H5N1 is a subtype of influenza A, it affects human health by direct contact with infected poultry. To prevent the virus infection, the most common method today is vaccination. Currently, many types of influenza A/H5N1 vaccine is commercially available in the market. To prevent the viral infection, the most common method is vaccination. Currently, many types of influenza A/H5N1 vaccine is commercially available in the market. However, the oral vaccine is the research targeted of scientists in the world, because this vaccine can eat, easy to manage and able to stimulate the body to produce antibodies and have more effectively than the other injected vaccine. In this paper, we present the results of research to create genetically modified soybean cultivars from DT12 soybean in Vietnam, by infecting in cotyledonary-node by bacteria A.tumefaciens carrying recombinant vector. Testing these genetically modified soybean plant by PCR with specific primers, results show there were 8 positive cultivars with PCR. These results are base for creating transgenic soybean cultivars with can produce antigen poultry flu A/H5N1 disease for in Vietnam. These results are the basis for creating the genetically modified soybean, can produce antigen A/H5N1 bird flu in Vietnam Keywords: Antigen, gene expression, H5N1, transgenic plant, plant vaccine * Tel: 0913383289;Email: mauchdhtn@gmail.com Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên