Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 95 KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT NẤM RƠM STUDIES ON EXTRACTION AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF EXTRACTS FROM STRAW MUSHROOM Lê Thanh Hải1, Nguyễn Minh Trí2, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo3 Ngày nhận bài: 28/12/2012; Ngày phản biện thông qua: 09/9/2013; Ngày duyệt đăng: 10/12/2013 TÓM TẮT Nghiên cứu này nhằm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch nấm rơm thu được có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất khi chiết tách ở 95OC trong 60 phút với tỷ lệ 1 phần nấm với 10 phần nước. Kết quả nghiên cứu còn cho thấy dịch chiết nấm rơm thu được có chứa 5,013 ± 0,176 mg/ml ergothioniene và có khả năng ức chế enzyme polyphenoloxydase nên có thể áp dụng để ngăn chặn sự biến đen ở tôm trong quá trình bảo quản. Từ khóa: nấm rơm (Volvariella volvacea), chống oxy hóa, chất ức chế enzyme polyphenoloxidase ABSTRACT This study was to optimize the extraction conditions for the extraction of antioxidants from straw mushroom. The result showed that the highest antioxidant activity of mushroom extract was obtained at 95OC with for 60 min using a ratio of 1 part mushrooms to 10 parts water. The result was found that the mushroom extract contained ergothioneine at a level of 5,013 ± 0,176 mg/l and acted as an inhibitor of enzyme polyphenoloxydase. Therefore, the mushroom extract can be used for preventing black spots in shrimp during storage. Keywords: Straw mushroom (Volvariella volvacea), antioxidant, enzyme polyphenoloxidase inhibitor 1 Lê Thanh Hải: Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2009 - Trường Đại học Nha Trang 2 TS. Nguyễn Minh Trí, 3 TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm rơm (Volvariella volvacea) là loài nấm ăn được của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới được trồng đầu tiên ở Trung Quốc vào đầu năm 1822. Khoảng từ năm 1932-1935, nấm rơm được đưa vào Việt Nam, Malaysia và các nước Đông Nam Á khác. Nhiệt độ để nấm rơm phát triển được là từ 25-40°C, điều kiện phát triển tốt nhất ở 37°C, pH = 6,0 và độ ẩm 57-60%. Chính vì vậy, nấm rơm được trồng khá phổ biến ở Việt Nam và cho sản lượng cao. Nhiều nghiên cứu cho thấy trong nhiều loài nấm có chứa các hoạt chất sinh học có lợi cho sức khỏe và có khả năng chữa được một số bệnh. Các peptide, β-glucan và fi brolytic enzyme trong dịch chiết từ các loài nấm như nấm linh chi, nấm mỡ, nấm kim châm, nấm vân chi, nấm thượng hoàng có khả năng phòng chống ung thư và bệnh tim mạch (Chen, 2007). Nghiên cứu của Fu và cộng sự (2002) cho thấy các loài nấm như nấm mỡ (Agaricus bisporus), nấm rơm (Volvariella volvacea), nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes), nấm đùi gà (Pleurotus eryngii), nấm sò (Pleurotus ostreatus) chứa các hợp chất phenol có khả năng chống oxy hóa và hoạt tính chống oxy hóa được sắp xếp theo thứ tự: Agaricus bisporus > Hypsizigus marmoreus > Volvariella volvacea > Flammulina velutipes > Pleurotus eryngii > Pleurotus ostreatus. Bao và cộng sự (2010) đã xác định hoạt tính và thành phần các chất chống oxy hóa trong dịch chiết của 10 loài nấm ăn khác nhau bao gồm: Flammulina Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2013 96 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG velutipes, Flammulina populicola, Grifola frondosa, Grifola frondosa, Hypsizigus tessellates, Hypsizigus tessulatus, Lentinula edodes, Pleurotus cornucopiae, Pleurotus eryngii và Pholiota nameko. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ nấm kim châm (Flammulina velutipes) có hoạt tính chống oxy hóa khá cao và 1ml dịch chiết có chứa 2,98 ± 0,02 mg ergothioneine, 2,91 ± 0,04 mg hợp chất phenol. Do có hoạt tính chống oxy hóa nên dịch chiết từ các loại nấm ăn đã được ứng dụng để sản xuất thực phẩm chức năng chống lão hóa, chống oxy hóa lipid và biến màu cơ thịt cá trong quá trình bảo quản lạnh (Bao và cộng sự, 2009), hạn chế sự biến đen ở tôm (Encarnacion và cộng sự, 2009), Nấm rơm là loài được trồng khá phổ biến ở Việt Nam và có hoạt tính chống oxy hóa cao (Fu và cộng sự, 2002). Tuy nhiên, những nghiên cứu về chiết tách và đánh giá hoạt tính của các chất chống oxy hóa từ nấm rơm còn rất hạn chế. Chính vì vậy, nghiên cứu này đã tiến hành chiết tách và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm để tìm ra hướng ứng dụng mới nhằm góp phần nâng cao giá trị sử dụng của nấm rơm và mang lại hiệu quả kinh tế cho người trồng nấm ở Việt Nam. II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nguyên vật liệu và hóa chất Nấm rơm (Volvariella volvacea) được mua ở trang trại nấm của ông Hoàng Văn Thuận, xã Cam Hiệp, huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa. nghiên cứu này là loại đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích, thí nghiệm. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Bố trí thí nghiệm Các nghiên cứu trước cho thấy thành phần hóa học của nấm rơm và nấm kim châm tương tự nhau (Anthony và Joyce, 2007; Akata và cộng sự, 2012). Vì vậy, nghiên cứu này đã dựa vào quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm kim châm của Bao và cộng sự (2009) và xác định lại các thông số của quy trình cho thích hợp chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm. Qua các thử nghiệm chiết lần 2, dịch chiết nấm rơm không có hoạt tính chống oxy hóa. Điều này có nghĩa là chiết 1 lần đã chiết kiệt, nên quy trình và bố trí thí nghiệm cho chiết 1 lần. Sơ đồ quy trình và bố trí thí nghiệm như sau: Hình 1. Nấm rơm Nấm được chọn để dùng cho thí nghiệm này là nấm vừa mới thu hoạch, còn tươi nguyên, không bị dập nát, tổn thương, đồng đều, có đường kính trung bình 2-3 cm. Nấm được cho vào túi PE và bảo quản trong thùng xốp để vận chuyển về phòng thí nghiệm. Gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) được mua từ công ty hóa chất Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ. Các hóa chất khác được dùng trong Hình 2. Sơ đồ quy trình và bố trí thí nghiệm chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm Cách tiến hành: - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm Nấm rơm (2 kg) sau khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm được rửa sạch để loại bỏ các tạp chất. Sau đó, lấy mỗi mẫu 100g nấm đã được xay nhỏ cho vào trong 1000 ml nước và cố định thời gian chiết là 60 phút. Theo nghiên cứu Bao và cộng sự (2009) nhiệt độ chiết tối ưu đối với nấm kim châm là 950C. Do đó, nghiên cứu này đã chọn khảo sát nhiệt độ chiết từ 90-1000C. Dịch chiết nấm rơm thu được ở trên đem điều chỉnh về cùng thể tích là 1000 ml Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 97 rồi phân tích hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử để chọn nhiệt độ chiết thích hợp. - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm Nấm rơm (2kg) sau khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm được rửa sạch để loại bỏ các tạp chất. Sau đó, lấy mỗi mẫu 100g nấm đã được cắt nhỏ cho vào trong 1000 ml nước và cố định nhiệt độ chiết thích hợp đã chọn từ thí nghiệm trước. Theo nghiên cứu Bao và cộng sự (2009) thời gian chiết tối ưu đối với nấm kim châm là 60 phút. Do đó, nghiên cứu này đã chọn khảo sát thời gian chiết từ 30-90 phút. Dịch chiết nấm rơm thu được ở trên đem điều chỉnh về cùng thể tích là 1000 ml rồi phân tích hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử để chọn thời gian chiết thích hợp. - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nấm/nước đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm Nấm rơm (2kg) sau khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm được rửa sạch để loại bỏ các tạp chất. Sau đó, lấy mỗi mẫu cố định nhiệt độ và thời gian chiết thích hợp đã chọn từ thí nghiệm trước. Theo nghiên cứu Bao và cộng sự (2009) tỷ lệ nấm/nước tối ưu đối với nấm kim châm là 1/10. Do đó, nghiên cứu này đã chọn khảo sát tỷ lệ chiết nấm/ nước (w/v) từ 1/8-1/12. Dịch chiết nấm rơm thu được ở trên đem điều chỉnh về cùng thể tích là 1000 ml rồi phân tích hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử để chọn tỷ lệ nấm/nước thích hợp. 2.2. Các phương pháp phân tích - Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002). - Tổng năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986). - Hàm lượng ergothioniene được phân tích thep phương pháp của Bao và cộng sự (2010). - Hoạt tính ức chế enzyme polyphenoloxydase (PPO) được xác định theo phương pháp của Jang và cộng sự (2003). 3. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu trình bày trong bài báo này là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm. Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2003 để tính giá trị trung bình và vẽ đồ thị. Sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05) của các giá trị trung bình được phân tích trên phần mềm thống kê R phiên bản 2.13.1. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm được trình bày trên đồ thị hình 3. Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B) của dịch chiết nấm rơm Từ kết quả trên đồ thị hình 3 cho thấy khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của dịch chiết nấm rơm tăng lên khi tăng nhiệt độ chiết từ 90oC đến 95oC (P < 0,05). Khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của dịch nấm rơm chiết ở 95oC và 100oC không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Do vậy, chọn nhiệt độ chiết thích hợp là 950C. 2. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm được trình bày trên đồ thị hình 4. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2013 98 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Từ kết quả trên hình 4 cho thấy khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của dịch chiết nấm rơm tăng lên khi tăng thời gian chiết từ 30 phút đến 60 phút (P < 0,05). Khi tiếp tục tăng thời gian chiết từ 60 phút lên 90 phút, kết quả phân tích cho thấy khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của dịch nấm rơm không tăng thêm (P > 0,05). Do vậy, chọn thời gian chiết thích hợp là 60 phút. 3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm/nước chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết nấm rơm được trình bày trên đồ thị hình 5. Hình 4. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B) của dịch chiết nấm rơm Hình 5. Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm/nước chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B) của dịch chiết nấm rơm Từ kết quả trên hình 5 cho thấy khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của dịch chiết nấm rơm tăng lên khi tăng tỷ lệ nấm/nước chiết từ 1/8 đến 1/10 (P < 0,05). Cả khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của dịch nấm rơm không tăng thêm (P > 0,05) khi tăng tỷ lệ nấm/nước chiết từ 1/12 đến 1/10. Do vậy, chọn tỷ lệ nấm/nước chiết thích hợp là 1/10. 4. Hàm lượng ESH và hoạt tính ức chế enzyme PPO của dịch chiết nấm rơm Kết quả phân tích dịch nấm rơm chiết tách ở điều kiện 95oC trong 60 phút với tỷ lệ 100g nấm trong 1 lít nước có chứa 5,013 ± 0,176 mg ESH và sắc ký đồ được trình bày trên hình 6. Hình 6. Sắc ký đồ của ESH chuẩn (A) và ESH trong dịch chiết nấm rơm (B) Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 99 Kết quả trên hình 6 cho thấy ESH và nội chuẩn (IS) methimazone hấp thụ cực đại ở bước sóng 254 nm với thời gian lưu tương ứng là 7,6 và 25,8 phút. Khối phổ của phân tử ES và IS tương ứng là 230m/z và 115m/z. Nghiên cứu Ancanion và cộng sự (2010) cho thấy ESH trong dịch chiết nấm kim châm có khả năng ức chế hoạt động của enzyme polyphenoloxydase (PPO) và ngăn chặn biến đen ở tôm. Trong nghiên cứu này, hoạt tính ức chế enzyme PPO của dịch chiết nấm rơm được trình bày trên đồ thị hình 7. Hình 7. Khả năng ức chế enzyme PPO của dịch chiết nấm rơm Từ kết quả trên hình 7 cho thấy dịch chiết nấm rơm có khả năng ức chế enzyme PPO. Hoạt tính ức chế emzyme PPO của dịch chiết nấm rơm trong hệ phản ứng sau 10 phút là 48%. Theo nghiên cứu Ancanacion và cộng sự (2010) cho thấy hoạt tính ức chế enzyme PPO của dịch chiết nấm kim châm phân tích trong điều kiện tương tự là 53%. Kết quả này cho thấy khả năng ức chế enzyme PPO của dịch chiết nấm rơm và dịch chiết nấm kim châm xấp xỉ nhau nên có thể sử dụng dịch chiết nấm rơm để ngăn chặn biến đen ở tôm trong quá trình bảo quản. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Nghiên cứu đã xác định được điều kiện thích hợp để chuẩn bị dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa từ nấm rơm là: - Nhiệt độ chiết: 95OC. - Thời gian chiết: 60 phút. - Tỷ lệ nấm/nước: 1/10. Dịch chiết nấm rơm thu được có chứa 5,013 ± 0,176 mg ESH /l và có khả năng ức chế 48% enzyme PPO trong hệ phản ứng sau 10 phút. 2. Kiến nghị Dịch chiết nấm rơm có hoạt tính chống oxy hóa và ức chế enzyme PPO nên có thể nghiên cứu sử dụng dịch chiết nấm rơm để ngăn chặn oxy hóa lipid và biến đen ở tôm trong quá trình bảo quản. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Akata I., Ergonul B., Kalyoncu F., 2012. Chemical Compositions and Antioxidant Activities of 16 Wild Edible Mushroom Species Grown in Anatolia. International Journal of Pharmacology, 8: 134-138. 2. Anthony M. M., Joyce C., 2007. Proximate and nutrient composition of three types of indigenous edible wild mushrooms grown in Tanzania and their utilization prospects. African Journal of Food Agriculture Nutrition and Development, 7(6): 1-16. 3. Bao H. N. D., Shinimiya Y., Ikeda H., Ohshima T., 2009. Preventing discoloration and lipid oxidation in dark muscle of yellowtail by feeding an extract prepared from mushroom (Flammulina velutipes) cultured medium. Aquaculture, 295: 243-249. 4. Bao H. N. D., Osako K., Ohshima T., 2010. Value-added use of mushroom ergothioneine as a colour stabilizer in processed fi sh meats. Journal of the Science of Food and Agriculture, 90 (10): 1634-1641. 5. Chen S. N., 2007. Application of Mushroom Immunomodulatory Peptides, β-Glucans and Fibrolytic Enzymes on Cancer and Cardiovascular Disease. Department of Life Science National Taiwan University Chairman, Taiwan Beta-Glucan Association. 6. Encarnacion A. B., Fagutao F., Hirono I., Ushio H., and Ohshima T., 2009. Effects of ergothioneine from mushrooms (Flammulina velutipes) on melanosis and lipid oxidation of Kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus). Food Chemistry, 105: 727–735. 7. Fu H., Shieh D., Ho C., 2002. Antioxidant and free radical scavenging activities of edible mushrooms. Journal of Food Lipids, 9: 35–46. 8. Jang M. S., Sanada A., Ushio H., Tanaka M., Ohshima T., 2003. Inhibitory effect of enokitake extract on melanosis of shrimp. Fisheries Science, 69 (2): 379–384. 9. Oyaizu, M., 1986. Studies on products of browning reaction antioxidative activity of products of browning reaction prepared from glucosamine. Japan Journal of Nutrition, 44: 307–315.