Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệgan của nấm linh chi đỏ (ganoderma lucidum)

129 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA THEO HƯỚNG BẢO VỆ GAN CỦA NẤM LINH CHI ĐỎ (GANODERMA LUCIDUM) Nguyễn Thị Thu Hương∗, Nguyễn Thị Ngọc Hằng** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Nhiều công trình nghiên cứu ñã chứng minh nấm linh chi ñỏ có tác dụng chống oxy hóa, kích thích hoạt ñộng của hệ miễn dịch và có hiệu quả trị liệu tốt cho các bệnh nhân bị ung thư cũng như bị các bệnh về gan. Đề tài này ñược thực hiện với mục tiêu khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của cao chiết cồn và cao chiết nước linh chi ñỏ giống của Nhật ñược nuôi trồng ở Việt Nam trên mô hình thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa tế bào gan bằng cyclophosphamide. Đối tượng-Phương pháp nghiên cứu: Cao cồn ñược chuẩn bị bằng cách chiết hồi lưu bột nguyên liệu với cồn 96%. Cao nước ñược chuẩn bị bằng cách ñun nguyên liệu với nước nóng ở 100°C. Nghiên cứu in vitro: khảo sát hoạt tính dập tắt gốc tự do bằng thử nghiệm 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) và hoạt tính ức chế peroxy hoá lipid màng tế bào não chuột bằng thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA). Nghiên cứu in vivo: Các cao thử ở liều tương ñương 5g dược liệu/kg thể trọng ñược cho uống liên tục trong 8 ngày sau khi tiêm phúc mạc liều duy nhất cyclophosphamide 150 mg/kg thể trọng. Vào ngày thứ 8, mổ tách lấy gan chuột ñem ñịnh lượng MDA. Kết quả: Kết quả nghiên cứu in vitro cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của cao cồn mạnh hơn cao nước. Nghiên cứu in vivo cho thấy cyclophosphamide làm tăng hàm lượng MDA trong gan ở lô chứng uống nước cất. Cao cồn linh chi ñỏ chưa thể hiện tác dụng làm giảm sự gia tăng hàm lượng MDA gây bởi cyclophosphamide trong khi cao nước lại làm giảm ñạt ý nghĩa thống kê sự gia tăng hàm lượng MDA so với lô chứng. Kết luận: Linh chi ñỏ có tác dụng chống oxy hóa, thải trừ các gốc tự do, ức chế quá trình peroxy hóa màng tế bào, làm giảm sự tăng hàm lượng MDA trong gan bị gây tổn thương oxy hóa bởi cyclophosphamide. Từ khóa: Nấm Linh chi ñỏ, cyclophosphamide, tác dụng chống oxy hóa, tác dụng bảo vệ gan. SUMMARY STUDY ON ANTIOXIDANT EFFECTS OF GANODERMA LUCIDUM ON CYCLOPHOSPHAMIDE-INDUCED HEPATOTOXICITY Nguyen Thi Thu Huong, Nguyen Thi Ngoc Hang Objectives: Ganoderma lucidum (Fr.) Karst (Lingzhi or Reishi) is a medicinal mushroom widely used in Asia, and has antioxidant effect, promotes immune function and induces some positive benefits for cancer patients, as well as patients with liver disease. The purpose of this study was to evaluate the in vitro antioxidant activity and hepatoprotective effect of ethanol extract and aqueous extract of Ganoderma lucidum cultivated in Vietnam on liver damage induced by cyclophosphamide in mice. Methods: For in vitro study, the free radical scavenging effect on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH) test and the anti-lipid peroxidation effect on malonyl dialdehyde (MDA) test of test extracts were examined. For in vivo study, the model of cyclophosphamide-induced liver damage was applied to study on the hepatoprotective effect of test extracts. Results: The free radical scavenging effect in DPPH test and the anti-lipid peroxidation effect in MDA test of ethanol extract were higher than those of aqueous extract. A single dose of cyclophosphamide at 150 mg/kg body weight (intraperitoneal injection) produced an increase of hepatic MDA content in control mice. Aqueous extract alleviated significantly the increase of hepatic MDA content caused by cyclophosphamide. Ethanol extract had no effect on cyclophosphamide-induced increase of MDA content. Conclusion: Ganoderma lucidum cultivated in Vietnam had shown an antioxidant activity and produced the hepatoprotective effect against cyclophosphamide-induced liver damage. ∗,** Trung tâm và Dược liệu Tp. HCM- Viện Dược liệu Địa chỉ liên hệ: PGS.TS. Ntuyễn Thị Thu Hương ĐT: 38298530 Email: huongsam@hotmail.com 130 Keywords:Ganoderma lucidum, antioxidant activity, cyclophosphamide, oxidative damage, hepatoprotective effect. ĐẶT VẤN ĐỀ Stress oxy hóa liên quan ñến một số bệnh lý ở người như ung thư, xơ vữa mạch máu, xơ gan, bệnh sa sút trí tuệ, Các chất có tác dụng chống oxy hóa có khả năng bảo vệ các cơ quan (não, tim, mạch máu, gan, thận) khỏi các tác ñộng xấu của stress oxy hóa, ñặc biệt ở người cao tuổi trong quá trình lão hóa. Nhiều công trình nghiên cứu ñã chứng minh nấm linh chi (Ganoderma lucidum (Fr.) Karst) có tác dụng chống oxy hóa, kích thích hoạt ñộng của hệ miễn dịch và có hiệu quả trị liệu tốt cho các bệnh nhân bị ung thư cũng như bị các bệnh về gan [3]. Cyclophosphamide (CY), một thuốc ñược sử dụng khá phổ biến trong phác ñồ hóa trị liệu ung thư, là một tác nhân alkyl hóa kìm tế bào, khi qua gan ñược biến ñổi sinh học trở thành 4- hydroxycyclophosphamide và aldophosphamide có tính alkyl hóa cao, dẫn ñến sự hình thành các tác nhân gây ñộc tế bào như acrolein, chloroacetaldehyde...Những thử nghiệm trên chuột nhắt trắng cũng chứng minh CY làm gia tăng quá trình peroxy hóa lipid trong tế bào gan và có thể gây tổn thương oxy hóa gan khi sử dụng dài ngày [1]. Trên cơ sở ñó, ñề tài này ñược thực hiện với mục tiêu khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của các cao chiết cồn và cao chiết nước linh chi ñỏ giống của Nhật ñược nuôi trồng ở Việt Nam dựa trên mô hình thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa tế bào gan bằng cyclophosphamide trên chuột nhắt trắng. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nấm linh chi ñỏ ñược cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu Linh chi và Nấm Dược liệu. Dược liệu ñược xay nhỏ, bảo quản nơi khô mát. Cao cồn ñược chuẩn bị bằng cách chiết hồi lưu soxhlet bột nguyên liệu với cồn 96% theo tỷ lệ 1:15 (dược liệu:dung môi), dịch chiết ñược cô giảm áp thu ñược cao cồn với hiệu suất chiết là 6,6%. Cao nước ñược chuẩn bị bằng cách ñun nguyên liệu 3 lần với nước nóng, mỗi lần trong 1 giờ ở 100°C theo tỷ lệ 1:15 (dược liệu:dung môi), dịch chiết ñược cô cách thủy thu ñược cao nước với hiệu suất chiết là 6%. Các cao chiết ñược hòa tan trong nước cất và cho chuột nhắt trắng uống với thể tích là 10 ml/kg thể trọng chuột. Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng ñực, chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 20 ± 2 g, ñược cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế – Tp. Nha Trang và ñược ñể ổn ñịnh ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm. Chuột ñược nuôi ñầy ñủ bằng thực phẩm viên, rau xanh và nước uống ñầy ñủ. Thể tích cho uống các cao thử nghiệm hay tiêm phúc mạc cyclophosphamid là 10 ml/kg thể trọng chuột. Thuốc thử nghiệm Endoxan® chứa 534,5 mg cyclophosphamid monohydrat tương ñương với 500 mg cyclophosphamid khan (ký hiệu CY), Baxter Oncology GmbH, Germany. Lô sản xuất 8K593E, sản xuất 11/2008, hạn dùng 11/2011. Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu in vitro Phương pháp xác ñịnh khả năng dập tắt gốc tự do (thử nghiệm DPPH) [2],[ 7] Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế dập tắt gốc tự do sẽ làm giảm màu của 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Xác ñịnh khả năng này bằng cách ño quang ở bước sóng có hấp thu cực ñại tại λ = 515 nm. 0,5 ml mẫu thử ở các nồng ñộ khảo sát ñược cho phản ứng với ñồng lượng dung dịch DPPH 0,8 mM pha trong MeOH. Hỗn hợp sau khi pha ñược ñể ở nhiệt ñộ phòng 30 phút. Đo quang ở bước sóng λ = 515 nm. Acid ascorbic (Merck, Germany) ñược sử dụng làm chất ñối chiếu. Phương pháp xác ñịnh khả năng ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) [4],[7] Xác ñịnh khả năng ức chế peroxy hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác ñịnh hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric ñể tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có ñỉnh hấp thu cực ñại ở λ = 532 nm. 131 0,1 ml mẫu thử ở các nồng ñộ thử nghiệm ñược cho phản ứng với 0,5 ml dịch ñồng thể não và thêm ñệm phosphat 50 mM vừa ñủ 2 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 15 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% trong 15 phút ở nhiệt ñộ 100oC. Làm lạnh và tiến hành ño quang ở bước sóng λ = 532nm. Trolox (Calbiochem Ltd. Co.), ñồng phân của vitamin E ñược sử dụng làm chất ñối chiếu. Tính toán kết quả Công thức tính % hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO% = [(ODC – ODT) / ODC] x 100 ODC: Mật ñộ quang của chứng dung môi (DMSO hay MeOH). ODT: Mật ñộ quang của mẫu thử. Các số liệu kết quả thử nghiệm ñược biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần ño khác nhau. Cách tính giá trị IC50: Vẽ ñồ thị biểu diễn tỷ lệ % khả năng dập tắt gốc tự do hay khả năng ức chế peroxy hóa lipid theo nồng ñộ khảo sát của chất cần thử nghiệm bằng phần mềm Excel. Từ ñồ thị, nội suy ra giá trị nồng ñộ dập tắt gốc tự do hay ức chế peroxy hóa lipid IC50 bằng cách tính phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b và thế y = 50 vào ñể suy ra IC50. Phương pháp nghiên cứu in vivo Gây mô hình tổn thương gan bằng cyclophosphamide [6] Chuột thí nghiệm ñược chia thành hai nhóm: - Nhóm bình thường, ký hiệu CY (-): • Lô chứng: uống nước cất. • Lô thử: uống các cao thử o Cao cồn: liều tương ñương 5 g dược liệu (0,332 g/kg thể trọng). o Cao nước: liều tương ñương 5 g dược liệu (0,300 g/kg thể trọng). - Nhóm bệnh lý, ký hiệu CY(+): chuột ñược tiêm phúc mạc liều duy nhất cyclophosphamid 150 mg/kg thể trọng. • Lô chứng: uống nước cất. • Lô thử: uống các cao thử o Cao cồn: liều tương ñương 5g dược liệu (0,332 g/kg thể trọng). o Cao nước: liều tương ñương 5g dược liệu (0,300 g/kg thể trọng). Thời gian cho uống hằng ngày trong khoảng 8-9 giờ sáng và liên tục trong 8 ngày sau khi tiêm cyclophosphamid. Vào ngày thứ 8, một giờ sau lần cho uống cuối cùng mổ tách lấy gan chuột ñem ñịnh lượng MDA. Phương pháp xác ñịnh hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong gan chuột [7] Tách gan chuột và nghiền ñồng thể trong dung dịch ñệm KCl 1,15 % theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt ñộ 0-5 0C. Lấy 2 ml dịch ñồng thể, thêm vào 1 ml dung dịch ñệm Tris - HCl, ủ ở 37 0C trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%, ly tâm 10000 vòng/phút, lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8 % ở 100 0C trong 15 phút và ño quang ở λ = 532 nm. Đánh giá kết quả Hàm lượng MDA ñược tính theo phương trình hồi qui chất chuẩn MDA: y = 0,0637x - 0,0029 (R2 = 0,9981). Sau khi tính ñược hàm lượng MDA (nmol/ml dịch ñồng thể), suy ra hàm lượng MDA (nmol/g protid). Các số liệu ñược biểu thị bằng trị số trung bình: M ± SEM (Standard error of the mean – sai số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One–Way ANOVA và Student- Newman-Keuls test (phần mềm Jandel Scientific SigmaStat). Kết quả thử nghiệm ñạt ý nghĩa thống kê với ñộ tin cậy 95% khi P < 0,05 so với lô chứng. KẾT QUẢ-BÀN LUẬN Kết quả nghiên cứu in vitro Bảng 1. Hoạt tính chống oxy hóa của cao cồn và cao nước nấm linh chi ñỏ trong thử nghiệm DPPH Nồng ñộ (µg/ml) HTCO Cao cồn (%) HTCO Cao nước (%) 2000 68,01 54,49 132 1500 56,71 46,26 1000 42,99 34,54 500 25,83 22,11 100 12,08 10,98 50 7,71 9,30 10 7,40 4,22 Nhận xét và bàn luận bảng kết quả 1: Trong thử nghiệm DPPH, DPPH là gốc tự do có màu tím nhờ vào ñiện tử N chưa ghép ñôi, nhưng sau khi phản ứng với oxy nguyên tử của chất dập tắt gốc tự do sẽ bị giảm màu tím. Hoạt tính chống oxy hóa của cao cồn và cao nước thể hiện qua việc làm giảm màu DPPH, dẫn ñến giảm ñộ hấp thu ở bước sóng 515 nm. Bảng kết quả 2 cho thấy, hoạt tính chống oxy hóa của 2 mẫu cao cồn và cao nước ở nồng ñộ 2000 µg/ml là cao nhất và tương ñương với chất ñối chiếu acid ascorbic ở trong khoảng nồng ñộ 0,5- 1 mM. Bảng 2. Hoạt tính chống oxy hóa cao cồn và cao nước nấm linh chi ñỏ trong thử nghiệm MDA Nồng ñộ (µg/ml) HTCO Cao cồn (%) HTCO Cao nước (%) 10 25,49 12,64 50 27,46 16,37 100 25,39 16,37 500 35,85 30,26 1000 44,87 22,49 1500 55,13 32,33 2000 58,34 41,66 Nhận xét và bàn luận bảng kết quả 2: Trong thử nghiệm MDA, MDA là chất ñược sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi phản ứng với thuốc thử acid thiobarbituric tạo ra phức hợp có màu hồng. Hoạt tính chống oxy hóa của hai mẫu thử cao cồn, cao nước thể hiện qua việc làm giảm màu của phức hợp này do làm giảm lượng MDA có trong mẫu dẫn ñến giảm ñộ hấp thu ở bước sóng 532 nm. Bảng kết quả 3 cho thấy, hoạt tính chống oxy hóa của 2 mẫu cao cồn và cao nước ở nồng ñộ 2000 µg/ml là cao nhất và tương ñương với chất ñối chiếu trolox ở trong khoảng nồng ñộ 1-5 mM. Tóm lại, dựa trên giá trị IC50 của cao cồn và cao nước linh chi ñỏ trong cả hai thử nghiệm DPPH và MDA có thể kết luận hoạt tính chống oxy hóa in vitro của cao cồn mạnh hơn cao nước (bảng 3). Bảng 3. Giá trị IC50 của cao cồn và cao nước linh chi ñỏ IC50 (µg/ml) DPPH MDA Cao cồn Cao nước Cao cồn Cao nước 1326 1708 1368 2818 Kết quả nghiên cứu in vivo Bảng 4. Kết quả khảo sát hàm lượng MDA trong gan ở lô uống cao cồn nấm linh chi ñỏ Nhóm Lô n=10 Liều (g/kg) Hàm lượng MDA (nmol/ml dịch ñồng thể) Hàm lượng MDA (nmol/g Protid) CY (-) Chứng - 3,172 ± 0,116 86,595 ± 3,168 133 Cao cồn 0,332 3,019 ± 0,107 84,902 ± 2,908 Chứng - 5,932 ± 0,324 161,962 ± 8,854# CY (+) Cao cồn 0,332 5,747 ± 0,371 159,390 ± 10,139 # P < 0,001 so với lô chứng bình thường, không tiêm cyclophosphamide. Bảng 5. Kết quả khảo sát hàm lượng MDA trong gan ở lô uống cao nước nấm linh chi ñỏ Nhóm Lô n=10 Liều (g/kg) Hàmlượng MDA (nmol/ml dịch ñồng thể) Hàm lượng MDA (nmol/g Protid) Chứng - 3,172 ± 0,116 86,595 ± 3,168 CY (-) Cao nước 0,300 3,757 ± 0,269 98,269 ± 6,243 Chứng - 5,932 ± 0,324 161,962 ± 8,854# CY (+) Cao nước 0,300 3567 ± 0,263 99,860 ± 7,191* # P < 0,001 so với lô chứng bình thường, không tiêm cyclophosphamide. * P < 0,05 so với lô chứng tương ứng Nhận xét và bàn luận bảng kết quả 4 và 5: Lô chứng tiêm cyclophosphamide và uống nước cất trong 8 ngày có hàm lượng MDA tăng ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường, chứng tỏ cyclophosphamide gây tổn thương peroxy hóa màng tế bào dẫn ñến việc làm tăng hàm lượng MDA trong gan. Do tại gan, cyclophosphamide ñược biến ñổi sinh học trở thành 4-hydroxycyclophosphamide và aldophosphamide có tính alkyl hóa, dẫn ñến sự hình thành các tác nhân gây ñộc tế bào như acrolein, chloroacetaldehyde [1]. Ngoài ra, nghiên cứu trước ñây của nhóm cũng ñã chứng minh cyclophosphamide làm giảm hàm lượng glutathion, chất chống oxy hóa nội sinh trong cơ thể, ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học ở ngày thứ 8 sau khi tiêm cyclophosphamide [6]. Điều này cho thấy glutathion và những nhóm chất có chứa sulfhydryl (như cystein và N-acetylcystein) với chức năng giải ñộc ñã thông qua hệ thống cytocrom P-450 tương tác với acrolein, chất chuyển hóa của cyclophosphamide trong cơ thể. Độc tính của cyclophosphamide tăng kéo theo sự suy giảm glutathion nội sinh trong gan, do ñó gián tiếp làm tăng quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào dẫn ñến hàm lượng MDA tăng. Lô bình thường không tiêm cyclophosphamide và uống cao cồn hoặc cao nước nấm linh chi ñỏ trong 8 ngày có hàm lượng MDA không thay ñổi ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng, chứng tỏ cao cồn và cao nước không có tác dụng trên cơ thể chuột bình thường. Lô tiêm cyclophosphamide và uống cao cồn nấm linh chi ñỏ ở liều 0,332 g/kg thể trọng chuột trong 8 ngày không làm thay ñổi hàm lượng MDA ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng, cho thấy cao cồn chưa thể hiện tác dụng ức chế sự gia tăng hàm lượng MDA trong gan gây bởi cyclophosphamide. Lô tiêm cyclophosphamide và uống cao nước nấm linh chi ñỏ ở liều 0,300 g/kg thể trọng chuột trong 8 ngày làm hàm lượng MDA giảm ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng, cho thấy cao nước thể hiện tác dụng ức chế sự gia tăng hàm lượng MDA trong gan gây bởi cyclophosphamide. Những công trình nghiên cứu trên thế giới ñã chứng minh các triterpenoid, polysaccharide là những nhóm hoạt chất quyết ñịnh dược tính của Linh chi, trong ñó có tác dụng chống oxy hóa. Nấm linh chi có rất nhiều loại như linh chi ñỏ, ñen, xanh, tímnhưng trong ñó tốt nhất là Linh chi ñen và ñỏ, ñặc biệt là Linh chi ñỏ. Lý do là vì trong hai loại Linh chi này có chứa hàm lượng polysaccharide cao hơn hẳn so với những loại còn lại [5]. Các polysaccharide trong Linh chi có tác dụng bảo vệ gan và phục hồi những tổn thương gan do stress oxy hóa gây bởi carbon tetraclorid, ethanol theo cơ chế dập tắt gốc tự do như: ức chế sự tăng sinh quá mức nitric oxide (NO) tạo ra peroxynitrit và superoxid anion (O2.-), ức chế sự 134 tạo thành sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid là malonyl dialdehyd (MDA), ức chế sự giảm hoạt năng của enzym superoxide dismutase [3]. Các thành phần hoạt chất của nấm Linh chi ñỏ khi ñược nuôi trồng ở Việt Nam ñã ñược phía Nhật Bản xác ñịnh (theo xác nhận của nhà cung cấp-Trung tâm Nghiên cứu Linh chi và Nấm Dược liệu). Điều này ñược khẳng ñịnh qua kết quả tác dụng chống oxy hóa của cao chiết nước trên thực nghiệm gây tăng MDA trong gan bởi cyclophosphamide. KẾT LUẬN Linh chi ñỏ có tác dụng chống oxy hóa, thải trừ các gốc tự do, ức chế quá trình peroxy hóa màng tế bào, làm giảm sự tăng hàm lượng MDA trong gan bị tổn thương oxy hóa bởi cyclophosphamide. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abraham P, Sugumar E.,(2008), Increased glutathione levels and activity of PON1 (phenyl acetate esterase) in the liver of rats after a single dose of cyclophosphamide: a defense mechanism?. Exp. Toxicol. Pathol., 59(5): pp. 301-306. 2. Amarowiez R., Pegg R.P., Rahimi-Moghaddam P., Barl B., Weil J.A.,(2004) Free radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the Canadian prairies, Food Chemistry, pp. 84, 551-562. 3. Boh B., Berovic M., Zhang J., Zhi-Bin L.,(2007) Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds, Biotechnol. Annu. Rev., 265-301. 4. Stroev E. A., Makarova V. G., (1998), Determination of lipid peroxidation rate in tissue homogenate laboratory. In: Manual in Biochemistry, Moscow, 243 -256. 5. Lê Xuân Thám (2005), Nấm Linh Chi Ganodermataceaea Donk. NXB Khoa học và Kỹ thuật, 6. Lê Minh Triết, Dương Thị Công Minh, Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Công Luận (2008), Tác dụng của Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata Burm. F. Nees, Acanthaceae) trên thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophospamid”, Y học TP. Hồ Chí Minh, tập 12, phụ bản của số 4, tr. 142-147. 7. Viện Dược liệu – Bộ Y Tế (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ Dược thảo, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội , tr. 279-292.