KẾT LUẬN
Sự tạo chồi trực tiếp của cây đương quy
Nhật Bản có thể được thực hiện bằng phương
pháp nuôi cấy lớp mỏng chồi ngọn trên môi
trường khoáng MS, vitamin Gamborg B5, bổ
sung 0,1 mg/l NAA, 1 mg/1 TDZ, 30 g/l đường
sucrose, 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine.
Tỷ lệ mẫu tạo rễ từ phiến lá cũng như số rễ
hình thành/mẫu, khối lượng tươi, khối lượng
khô của rễ cao nhất khi phiến lá được nuôi cấy
trên môi trường khoáng và vitamin Gamborg B5,
có bổ sung 10 mg/l NAA.
Lời cảm ơn: Đề tài thuộc chương trình hợp tác
nghiên cứu giữa Trường đại học Chiba, Nhật
Bản và phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện
Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam
9 trang |
Chia sẻ: thucuc2301 | Lượt xem: 517 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu sự phát sinh cơ quan từ lớp mỏng tế bào cây đương quy Nhật Bản (angelica acutiloba) nuôi cấy in Vitro - Hoàng Ngọc Nhung, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204
196
NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN TỪ LỚP MỎNG TẾ BÀO
CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (Angelica acutiloba) NUÔI CẤY IN VITRO
Hoàng Ngọc Nhung1, Nguyễn Thị Quỳnh1*, Nguyễn Vũ Ngọc Anh1,
Nguyễn Lê Anh Thư1, Toyoki Kozai2
(1)Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)qtnguyen_vn@yahoo.com
(2)Trường đại học Chiba, Nhật Bản
TÓM TẮT: Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) có giá trị dược liệu cao hơn các loài đương
quy khác thuộc chi Angelica. Bộ rễ của cây được sử dụng lâu đời trong việc chữa bệnh cũng như trong
nhiều đơn thuốc bổ theo y học cổ truyền ở nhiều nước châu Á. Trong nghiên cứu này, sự phát sinh cơ
quan ở cây đương quy Nhật Bản từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào của chồi ngọn và từ nuôi cấy phiến lá đã
được thực hiện. Lớp mỏng (bề dày từ 1-1,5 mm) cắt từ chồi in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS có
bổ sung NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) kết hợp với TDZ (0,1; 0,5; 1mg/l). Số chồi lớn nhất (8,9 chồi/mẫu) xuất
phát từ lớp mỏng chồi nuôi cấy trên môi trường có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ. Khi thay vitamin Morel
bằng vitamin Gamborg B5, bổ sung 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine, số chồi tăng rõ rệt. Phiến lá
cây đương quy Nhật Bản in vitro cũng đã được chứng minh là nguồn nguyên liệu tốt cho việc sản xuất rễ
bất định. Trên môi trường MS có bổ sung kinetin (0 hoặc 1 mg/l) kết hợp với NAA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l),
hoặc IBA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), phiến lá mở thứ nhất (tính từ ngọn) nuôi cấy trong điều kiện tối đã có đáp
ứng tạo rễ khác biệt. Sự thay đổi thành phần khoáng và vitamin cũng ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành
rễ. Phần trăm mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, trọng lượng tươi và khô của rễ lớn nhất khi phiến lá được nuôi trên
môi trường khoáng Gamborg B5, vitamin Gamborg B5.
Từ khóa: Angelica acutiloba, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, phát sinh cơ quan, rễ bất định.
MỞ ĐẦU
Cây đương quy Nhật Bản (Angelica
acutiloba) thuộc họ Hoa tán (Apiaceae), là loài
thân thảo lớn, có chiều cao trung bình 40-80 cm,
được du nhập vào Việt Nam từ năm 1996 và
trồng ở các tỉnh Hà Giang, Lào Cai, xung quanh
Hà Nội. Rễ của cây đương quy 3 năm tuổi được
đào vào mùa thu, rồi sấy than, cắt thành lát
mỏng dùng làm thuốc. Những lá non có thể ăn
sống hoặc làm trà tươi uống. Trong y học cổ
truyền của Trung Quốc, đương quy là thuốc đầu
vị, dùng rất phổ biến trong thuốc chữa bệnh phụ
nữ, thiếu máu, suy nhược cơ thể, đồng thời
được chỉ định trong nhiều đơn thuốc bổ dựa vào
các hợp chất chính như ligustilide,
butylidenephthalide và acid ferulic. Các
polysaccharide có mặt trong rễ của cây đương
quy Nhật Bản còn có khả năng kích thích hệ
thống miễn dịch của cơ thể [6]. Trong dân gian,
cây đương quy thường được trồng bằng hạt, tuy
nhiên, hạt chỉ có thể thu được vào một thời gian
nhất định trong năm, thường vào năm thứ 3 sau
khi trồng, và sức nảy mầm giảm nhanh chóng
sau một thời gian ngắn. Do nhu cầu về giống
cây ngày càng tăng, đồng thời đòi hỏi việc nuôi
trồng phải đáp ứng các tiêu chuẩn nghiêm ngặt,
bảo đảm được tính sạch và sự ổn định về chất
lượng của hợp chất thứ cấp có trong cây,
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là một
trong những phương pháp nhân giống hữu hiệu
nhất để tạo một lượng lớn cây đương quy đồng
nhất, sạch bệnh trong một thời gian nhất định và
không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết.
Trong bài này, chúng tôi trình bày kết quả
tạo chồi và rễ bất định từ nuôi cấy lớp mỏng
chồi ngọn và phiến lá cây đương quy Nhật Bản
in vitro dưới ảnh hưởng của thành phần hóa học
và một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật
(ĐHSTTV) bổ sung trong môi trường nuôi cấy,
nhằm hướng đến việc xây dựng hệ thống nhân
chồi và rễ in vitro hữu hiệu để phục vụ cho nhu
cầu dược liệu trong nước.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Chồi in vitro và phiến lá cây đương quy
Nhật Bản (Angelica acutiloba) lấy từ cây mầm
phát triển từ hạt được nuôi cấy trên môi trường
MS [9].
Ngoc Nhung Hoang et al.
197
Môi trường nuôi cấy in vitro
Môi trường khoáng MS hoặc khoáng
Gamborg B5 [3], có bổ sung vitamin Morel
hoặc Gamborg B5, 30 g/l đường sucrose (công
ty Đường Biên Hòa), 7,3 g/l agar (công ty Cổ
phần Đồ hộp Hạ Long). pH của môi trường
trước khi khử trùng là 5,8. Môi trường được
khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong 20 phút.
Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, thời gian
thí nghiệm 6 tuần (42 ngày).
Phương pháp
Ảnh hưởng của NAA và TDZ lên sự tạo chồi từ
nuôi cấy lớp mỏng chồi của cây đương quy
Nhật Bản
Chồi (đã loại bỏ hết lá) được cắt ngang thành
3 lớp mỏng (chiều dày khoảng 1 mm) và được đặt
vào môi trường MS, vitamin Morel, bổ sung 30
g/l đường sucrose, 7,3 g/l agar, chất ĐHSTTV là
NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) và TDZ (0,1; 0,5; 1 mg/l).
Thí nghiệm gồm 9 công thức, mỗi công thức 3
bình (V = 130 ml), mỗi bình có 1 chồi cắt thành 3
lớp và chứa 20 ml môi trường. Thí nghiệm được
đặt trong tủ vi khí hậu (công ty Sanyo, Japan)
dưới cường độ ánh sáng 50 µmol m-2 s-1 (30 µmol
m-2 s-1 trong 3 tuần đầu), thời gian chiếu sáng 16
giờ/ngày, nhiệt độ nuôi cấy là 25oC. Thí nghiệm
được lặp lại 3 lần. Chỉ tiêu theo dõi là số chồi/mẫu
hình thành theo thời gian nuôi cấy (chồi ≥ 1 mm).
Vai trò của vitamin, nước dừa và adenine lên sự
tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi
Chồi sau khi loại bỏ lá được cắt ngang thành
2 lớp mỏng (chiều dày khoảng 1 mm) và đặt vào
môi trường thí nghiệm với thành phần khoáng đa
lượng MS, vi lượng MS, bổ sung 30 g/l đường
sucrose, 7,3 g/l agar, 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l
TDZ. Thí nghiệm được bố trí với 6 công thức
nhằm khảo sát ảnh hưởng của vitamin Morel
hoặc vitamin Gamborg B5 trong môi trường nuôi
cấy lớp mỏng, không hoặc có bổ sung nước dừa
(10%, v/v), không hoặc có bổ sung adenine
sulphate (40 mg/l). Mỗi công thức có 3 bình (V =
130 ml), mỗi bình có 1 chồi được cắt thành 2 lớp
và chứa 20 ml môi trường. Thí nghiệm được lặp
lại 3 lần. Điều kiện nuôi cấy và chỉ tiêu theo dõi
kế thừa từ thí nghiệm trên.
Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
thực vật lên sự tạo rễ từ phiến lá cây đương quy
Nhật Bản in vitro
Mẫu cấy là phiến lá mở thứ nhất từ chồi in
vitro của cây đương quy Nhật Bản, mỗi mẫu
được rạch 9 đường ngẫu nhiên để tạo vết
thương. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường
khoáng MS, vitamin Morel, có bổ sung NAA
hoặc IBA ở các nồng độ 4, 6, 8, 10, và 12 mg/l
và kinetin ở các nồng độ 0 và 1 mg/l. Mỗi công
thức có 2 bình (V = 130 ml), mỗi bình có 2 mẫu
và chứa 20 ml môi trường. Mẫu nuôi cấy được
đặt hoàn toàn trong tối, nhiệt độ phòng nuôi là
25oC. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ (%)
mẫu tạo mô sẹo và tạo rễ được xác định sau 42
ngày nuôi cấy.
Ảnh hưởng của loại môi trường khoáng và
vitamin lên sự tạo rễ từ phiến lá cây đương quy
Nhật Bản in vitro
Phiến lá được nuôi cấy trên môi trường
khoáng MS hoặc Gamborg B5, và vitamin
Morel hoặc Gamborg B5, có bổ sung 10 mg/l
NAA. Mỗi công thức có 7 bình (V = 130 ml),
mỗi bình có 1 mẫu và chứa 20 ml môi trường.
Điều kiện nuôi cấy như thí nghiệm trên. Thí
nghiệm được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ (%) mẫu tạo
mô sẹo và tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi,
trọng lương khô của rễ được xác định ở ngày
thứ 42.
Các số liệu được phân tích thống kê bằng
phần mềm MSTATC phiên bản 2.10 của Đại
học bang Michigan, Mỹ.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Ảnh hưởng của NAA và TDZ lên sự tạo chồi
từ nuôi cấy lớp mỏng chồi của cây đương quy
Nhật Bản
Số lượng chồi hình thành tăng dần ở các
công thức theo thời gian nuôi cấy (bảng 1). Ảnh
hưởng của NAA ở nồng độ thấp (0,1 mg/l) hay
cao (0,2 mg/l) lên sự tạo chồi mới của mẫu ban
đầu chưa rõ rệt so với mẫu nuôi cấy trên môi
trường không có NAA, cho dù nồng độ của
TDZ cao (1 mg/l) hay thấp (0,1 mg/l). Tuy
nhiên, việc bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l
TDZ (công thức L6) vào môi trường đã kích
thích mẫu cấy lớp mỏng chồi và làm gia tăng số
chồi hình thành/mẫu cấy so với các công thức
khác ngay sau 2 tuần nuôi cấy (bảng 1).
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204
198
Bảng 1. Ảnh hưởng của NAA và TDZ lên sự hình thành chồi của cây đương quy Nhật Bản theo
thời gian nuôi cấy
Công thức thí nghiệm Số chồi (chồi/mẫu cấy)
Ký hiệu NAA (mg/l) TDZ (mg/l) Tuần 2 Tuần 4 Tuần 6
L1 0 0,1 1,4 bcx 1,7 e 2,2 f
L2 0 0,5 1,4 bc 2,7 d 3,9 cd
L3 0 1 0,9 c 1,4 e 2,0 f
L4 0,1 0,1 1,4 bc 3,3 bc 4,3 c
L5 0,1 0,5 1,6 d 2,1 de 4,3 c
L6 0,1 1 4,1 a 6,3 a 8,9 a
L7 0,2 0,1 1,1 bc 1,7 e 3,2 e
L8 0,2 0,5 0,9 c 2,7 cd 3,7 de
L9 0,2 1 1,4 bc 3,4 b 7,8 b
ANOVAy
Nồng độ NAA (A) ** ** **
Nồng độ TDZ (B) ** ** **
A × B ** ** **
CV (%) 14,28 10,28 5,86
y **: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01; x Các số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự
khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test.
Sau 6 tuần, số chồi hình thành ở các công
thức tiếp tục gia tăng và sự khác biệt trở nên rất
có ý nghĩa (bảng 1). Số lượng chồi cao nhất ở
công thức L6 (8,9 chồi/mẫu) và thấp nhất ở công
thức L3 (1 mg/l TDZ và không có NAA)
(hình 1). Ngoài ra, chồi xuất hiện tập trung trên
lớp mỏng 1 và 2 tính từ ngọn và hầu như không
thấy xuất hiện trên lớp mỏng thứ 3.
Hình 1. Cụm chồi cây đương quy Nhật bản sau 6 tuần nuôi cấy
(ký hiệu tên nghiệm thức theo bảng 1)
Ngoc Nhung Hoang et al.
199
TDZ được biết đến như một cytokinin loại
phenylurea và được sử dụng thay thế cho BA
trong nhiều nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực
vật trong thời gian gần đây. Sự có mặt của TDZ
trong môi trường, ở nồng độ thấp hoặc vừa phải,
đã thúc đẩy sự sinh tổng hợp cytokinin nội sinh
ở mô thực vật nuôi cấy [7]. Bên cạnh đó, tỷ lệ
giữa auxin và cytokinin đóng vai trò hết sức
quan trọng đối với sự phát sinh hình thái cơ
quan trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vì vậy,
sự vắng mặt của NAA trong môi trường nuôi
cấy có thể đã gây nên sự mất cân bằng về tỷ lệ
giữa auxin và cytokinin, hoặc dẫn đến sự dư
thừa cytokinin và tạo phản ứng ngược lên sự
sinh tổng hợp cytokinin của tế bào. Tỷ lệ 1:10
giữa 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ có lẽ đã đạt
được thế cân bằng phù hợp cho sự hình thành
chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi cây đương quy.
Vai trò của vitamin, nước dừa và adenine
lên sự tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi
Ảnh hưởng của loại vitamin, nước dừa và
adenine lên sự tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng
của cây đương quy diễn ra chậm. Số chồi hình
thành ở các công thức không có sự khác biệt về
mặt thống kê sau 2 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, ở
tuần nuôi cấy thứ 4, sự thay đổi loại vitamin
cũng như sự bổ sung thêm nước dừa và adenine
đã gây các phản ứng khác nhau đối với mô nuôi
cấy (bảng 2).
Bảng 2. Ảnh hưởng của loại vitamin, nước dừa và adenine lên sự hình thành chồi của cây đương
quy theo thời gian nuôi cấy
Tên công thức thí nghiệm Số chồi (chồi/ mẫu cấy) Tuần 2 Tuần 4 Tuần 6
M (Vitamin Morel) 0,25 2,71 ex 9,83 d
MC (Vitamin Morel + 10% nước dừa) 0,08 3,67 c 10,67 c
MCA (Vitamin Morel + 10% nước dừa + 40 mg/l
adenine) 0,42 1,92 f 7,17 f
B (Vitamin Gamborg B5) 0,13 3,42 d 7,96 e
BC (Vitamin Gamborg B5 + 10% nước dừa) 1,08 6,08 b 14,29 b
BCA (Vitamin Gamborg B5 + 10% nước dừa + 40
mg/l adenine) 1,21 9,88 a 16,33 a
ANOVAy
Vitamin (A) * ** **
Nước dừa và adenine (B) * ** **
A x B NS ** **
CV(%) 89,5 2,12 0,65
y NS, *, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 hoặc 0,0; x Các số có chữ cái giống
nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test.
Khi thay vitamin Morel bằng vitamin
Gamborg B5, số chồi/mẫu gia tăng rõ rệt sau 4
tuần nuôi cấy ở cả 3 công thức B, BC và BCA.
Số chồi/mẫu trên môi trường BC hơn gần hai
lần so với số chồi/mẫu trên môi trường MC
(bảng 2). Ở tất cả các công thức, sồ chồi đều gia
tăng sau 6 tuần nuôi cấy. Số chồi/mẫu lớn nhất
thu nhận được ở công thức BCA (16,33
chồi/mẫu) và nhỏ nhất ở nghiệm thức MCA
(7,17 chồi/mẫu). Sự hiện diện của nước dừa làm
gia tăng đáng kể số chồi/mẫu, tuy nhiên, sự bổ
sung thêm adenine chỉ có ảnh hưởng rõ rệt khi
vitamin của môi trường Gamborg B5 được sử
dụng (bảng 2).
Vai trò kích thích tăng trưởng của nước dừa
đã được đề cập đến trong nhiều công trình vi
nhân giống lan. Nước dừa có chứa nhiều loại
cytokinin như kinetin, trans-zeatin và một số
chất kích thích tố sinh trưởng thực vật khác
chưa được định danh thuộc nhóm gibberellin và
auxin [13]. Ngoài ra, nước dừa còn có các vi
lượng như sắt và vitamin, các acic amin,
đường... có thể được đưa vào hệ thống
antioxidant của cơ thể người. Trong nuôi cấy
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204
200
tạo chồi cây oliu, nước dừa đã thành công trong
việc thay thế zeatin trong môi trường nuôi cấy
và trong các giai đoạn tiếp theo của quy trình
nhân giống [11]. Ảnh hưởng của adenine lên sự
tăng sinh chồi được mô tả trong thí nghiệm này
khi môi trường khoáng MS kết hợp với vitamin
Gamborg B5. Nandagopal & Kumari (2006)
[10] cũng đã chứng minh trên cây
Cichorium intybus về sự hình thành mô sẹo và
tái sinh chồi đạt hiệu quả cao nhất khi bổ sung
1,36 µM adenine vào môi trường MS có
vitamin Gamborg B5.
Ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự tạo rễ
từ phiến lá cây đương quy Nhật Bản
Tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ ở các công thức vào
ngày thứ 42 có sự khác biệt rất ý nghĩa khi kết
hợp cả 2 yếu tố. Khi khảo sát ảnh hưởng của
NAA có hoặc không có kết hợp với kinetin, tỷ lệ
mẫu tạo rễ cao khi mẫu được nuôi cấy trên môi
trường chỉ có NAA ở các nồng độ 6, 8, 10 hoặc
12 mg/l (bảng 3A). Khi khảo sát ảnh hưởng của
IBA có hoặc không có kết hợp với kinetin, trên
môi trường chỉ có 6 hay 8 mg/l IBA, hoặc trên
môi trường IBA kết hợp với 1 mg/l kinetin, ở
nồng độ 10 hay 12 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo rễ cao hơn
các nghiệm thức còn lại (bảng 3B).
Bảng 3. (A) Ảnh hưởng của NAA, kinetin hoặc (B) IBA, kinetin lên % mẫu tạo mô sẹo, % mẫu tạo
rễ từ phiến lá cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro ngày thứ 42
A
B
Tên công
thứcz
% mẫu tạo
mô sẹo % mẫu tạo rễ
Tên công
thứcz
% mẫu tạo
mô sẹo
% mẫu tạo
rễ
N4K1 88,89 33,33 cx I4K1 77,78 ab 55,56 abcx
N4K0 77,78 33,33 c I4K0 22,21 d 55,56 abc
N6K1 66,67 77,78 ab I6K1 66,67 abc 66,67 abc
N6K0 55,56 66,67 ab I6K0 66,67 abc 88,89 a
N8K1 55,56 55,56 bc I8K1 66,67 abc 33,33 c
N8K0 33,33 88,89 a I8K0 33,33 cd 66,67 abc
N10K1 100 0 d I10K1 100 a 77,77 ab
N10K0 77,77 77,77 ab I10K0 33,33 cd 33,33 c
N12K1 83,33 0 d I12K1 53,33 bcd 55,56 abc
N12K0 72,22 72,22 ab I12K0 44,44 bcd 44,44 bc
ANOVAy ANOVAy
NAA (A) ** ** IBA (A) * *
KINETIN (B) ** ** KINETIN (B) ** NS
A x B NS ** A x B ** **
CV (%) 19,61 24,82 CV (%) 28,5 24,14
z N tượng trưng NAA, I tượng trưng IBA; K tượng trưng cho kinetin; các số đi kèm với N hoặc K hoặc I là
nồng độ của NAA hoặc IBA hoặc kinetin được sử dụng trong nghiệm thức; y NS, *, **: không khác biệt hoặc
khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,05 và 0,01; x Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự
khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test.
Các loại tế bào khác nhau đáp ứng với chất
ĐHSTTV khác nhau. Các tế bào vùng nhu mô
là những tế bào có chức năng hoàn chỉnh. Do
đó, khi bị thương và dưới tác động của tổ hợp
chất ĐHSTTV, các tế bào vùng nhu mô sẽ đáp
ứng lại bằng cách phản biệt hóa tạo khối mô
sẹo. Tuy nhiên, mô sẹo hình thành là những
khối có dạng tròn, xốp, màu nâu nhạt, khả năng
tái biệt hóa rất thấp. Khác với tế bào vùng nhu
mô, các tế bào vùng tượng tầng libe-mộc là
Ngoc Nhung Hoang et al.
201
những tế bào mô phân sinh cấp hai. Vì vậy,
dưới tác động của các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật, các tế bào này không trải qua quá trình
phản biệt hóa mà được hoạt hóa trực tiếp để
hình thành vùng tế bào mô phân sinh, tạo sơ
khởi rễ (hình 2a).
Hình 2. Sự hình thành rễ bất định từ phiến lá cây đương quy Nhật bản
a. Sơ khởi rễ hình thành từ vùng tượng tầng libe-mộc (thanh ngang = 10 µm);
b. Rễ bất định hình thành trên môi trường có bổ sung 10 mg/l NAA (thanh ngang = 5 mm).
Auxin làm giảm tích lũy của cytokinin và
ngược lại cytokinin ức chế một số hoạt tính của
auxin [4]. Chẳng hạn như, ở nồng độ 10 mg/l
NAA, tỷ lệ mẫu tạo rễ là 77,77% (nghiệm thức
N10K0). Tuy nhiên, khi bổ sung 1 mg/l kinetin,
mẫu không đáp ứng tạo rễ (nghiệm thức N10K1),
nhưng tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo lại tăng (bảng 3a).
Yang & Chuang (1995) [12] khi khảo sát sự tạo
rễ từ nuôi cấy tạo mô sẹo của cây đương quy
Trung Quốc - Angelica sinensis cũng đã chứng
minh, đối với vật liệu là cuống lá ex vitro, mô
sẹo được hình thành trên môi trường MS có
chứa 15 mg/l NAA và 2 mg/l kinetin, trong khi
môi trường MS có chứa 15 mg/l NAA và 4 mg/l
kinetin lại thích hợp cho sự hình thành rễ.
Bên cạnh đó, loại auxin khác nhau cũng tác
động lên mẫu cấy khác nhau. Mẫu nuôi cấy trên
môi trường có bổ sung IBA ở nồng độ 6 mg/l
hoặc IBA nồng độ 10 mg/l , 1 mg/l kinetin cho
kết quả tạo rễ khá cao, nhưng rễ tạo ra lại mảnh,
ngắn so với rễ tạo từ phiến lá trên môi trường có
bổ sung 10 mg/l NAA (hình 2b). Phản ứng khác
nhau của mẫu cấy phiến lá đối với hai loại auxin
này có thể do sự nhận biết tín hiệu dẫn đến sự
đáp ứng của mẫu cấy đối với hai loại auxin này
là khác nhau.
Ảnh hưởng của loại môi trường khoáng
và vitamin lên sự tạo mô sẹo và rễ từ phiến lá
nuôi cấy in vitro của cây đương quy
Nhật Bản
Ở ngày thứ 42, tỷ lệ (%) mẫu tạo mô sẹo và
tạo rễ trong các công thức nuôi cấy có sự khác
biệt rất ý nghĩa khi xét cả hai yếu tố là loại môi
trường và vitamin (hình 3).
Hình 3. Mô sẹo, rễ hình thành từ phiến lá
cây đương quy Nhật Bản dưới ảnh hưởng
của môi trường khoáng MS, Gamborg B5
và vitamin Morel, vitamin Gamborg B5
ngày thứ 42 (thanh ngang = 5 mm)
M hay B bên trái tượng trưng cho môi trường
khoáng MS hay khoáng Gamborg B5; M hay B
bên phải tượng trưng cho vitamin Morel hay
Gamborg B5.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204
202
Mẫu nuôi cấy trên môi trường khoáng và
vitamin Gamborg B5 (công thức BB) có tỷ lệ mẫu
tạo mô sẹo và rễ đạt cao nhất (100%) (bảng 4).
Nghiệm thức BB có số rễ hình thành/mẫu,
khối lượng tươi và khối lượng khô cao nhất,
trong khi nghiệm thức MB có số rễ hình
thành/mẫu, khối lượng tươi và khối lượng khô
của rễ thấp nhất (bảng 4).
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi
trường khoáng MS được sử dụng phổ biến cho
hầu hết các loại cây do giàu và cân bằng về mặt
hàm lượng khoáng. Tuy nhiên, môi trường
Gamborg B5 cũng được sử dụng trong nuôi cấy
tạo mô sẹo và rễ ở một số loại cây như sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis) [7]. Quá trình
phiến lá tạo rễ bất định có thể chia làm hai giai
đoạn: giai đoạn đầu là các tế bào tượng tầng
libe-mộc được cảm ứng tạo sơ khởi rễ, giai
đoạn sau là sự phát triển thành cơ quan rễ hoàn
chỉnh. Dưới tác động của nồng độ 10 mg/l
NAA, sơ khởi rễ được hình thành.
Bảng 4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng và loại vitamin lên tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ
lệ mẫu tạo rễ, số rễ hình thành/mẫu, khối lượng tươi (KLT), khối lượng khô (KLK) của rễ từ phiến
lá cây đương quy Nhật Bản ngày thứ 42
Tên công thứcz % mẫu tạo mô sẹo % mẫu tạo rễ
Số rễ hình
thành/mẫu
KLT
(mg/mẫu)
KLK
(mg/mẫu)
MM 57,1 cx 57,1 c 8 c 19,7 c 2,8 c
MB 33,4 d 33,4 d 2 d 5,7 c 0,9 d
BM 71,4 b 71,4 b 17 b 44,3 b 4,7 b
BB 100,0 a 100,0 a 31 a 86,5 a 9,9 a
ANOVAy
KHOÁNG (A) ** ** ** ** **
VITAMIN (B) NS NS ** ** **
A x B ** ** ** ** **
CV (%) 6,3 6,3 3,5 14,8 13,9
z M hay B (bên trái): môi trường khoáng MS hay khoáng Gamborg B5; M hay B (bên phải): vitamin Morel
hay Gamborg B5; y NS, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,01; x Các trị số có chữ cái
giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo phân hạng LSD Test.
Tùy vào từng giai đoạn phát triển, nhu cầu
dinh dưỡng ở các loại tế bào cũng khác nhau.
Theo George & Davies (2003) [5], sự phát triển
của tế bào rễ sẽ bị kìm hãm nếu môi trường
chứa nhiều amonium (NH4+), nhưng ngược lại
rễ tăng trưởng cần nitrate (NO3-). Điều này liên
quan mật thiết đến sự đồng hóa đạm của rễ. Giai
đoạn đầu tiên của sự đồng hóa đạm là sự khử
nitrate, thường xảy ra ở rễ, trong tối. Tiếp theo
là sự tổng hợp acid amin có vai trò quan trọng
trong sự tổng hợp protein của tế bào. Đặc biệt,
sự đồng hóa đạm có những đặc điểm sau: mô
non thích NH4+, NH4+ đối kháng với K+, Ca2+
hay Mg2+. Do đó nếu dùng NH4+ quá nhiều sẽ
gây thiếu K+, Ca2+ hay Mg2+ [1]. Ở môi trường
khoáng MS, có tỷ lệ KNO3/NH4NO3 = 1,15;
trong khi ở môi trường Gamborg B5 tỷ lệ
KNO3/(NH4)2SO4 = 18,65. Như vậy, nồng độ
NH4+ trong thành phần khoáng MS cao gấp 10
lần trong thành phần khoáng Gamborg B5, có
thể gây cản trở sự đồng hóa đạm của rễ và sự
hấp thu các ion K+, Ca2+ hay Mg2+. Trong khi
NO3- giúp cho sự thấm cation, K+ có vai trò
trong sự cân bằng ion (điều hòa thế thẩm thấu
của tế bào), sự đóng mở của khí khổng, hoạt
hóa enzyme và tổng hợp protein. Như vậy, kết
quả thí nghiệm đã cho thấy, nồng độ khoáng đa
lượng của môi trường Gamborg B5 thích hợp
hơn cho việc tạo rễ từ nuôi cấy phiến lá cây
đương quy Nhật Bản.
Vitamin tác động rõ rệt lên số rễ/mẫu và
khối lượng tươi, khối lượng khô của rễ (bảng 4).
Vitamin là hợp chất cần thiết cho nhiều phản
ứng sinh hóa, trong đó thiamine (B1), nicotinic
acid (B3), myo-inositol, pyridoxine (B6) là
những vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô
thực vật. Trong thành phần vitamin Gamborg
Ngoc Nhung Hoang et al.
203
B5 nồng độ thiamine cao gấp 10 lần so với nồng
độ thiamine trong vitamin Morel. Thiamine
được xem là chất cần thiết cho quá trình cảm
ứng tạo rễ bất định ở cây Taxus sp. [2]. Cơ chế
này chưa được biết rõ trên cây đương quy Nhật
Bản, nhưng số lượng rễ hình thành trên mẫu
nuôi ở môi trường khoáng và vitamin Gamborg
B5 cao hơn so với các công thức khác có thể là
do tác động của thiamine.
KẾT LUẬN
Sự tạo chồi trực tiếp của cây đương quy
Nhật Bản có thể được thực hiện bằng phương
pháp nuôi cấy lớp mỏng chồi ngọn trên môi
trường khoáng MS, vitamin Gamborg B5, bổ
sung 0,1 mg/l NAA, 1 mg/1 TDZ, 30 g/l đường
sucrose, 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine.
Tỷ lệ mẫu tạo rễ từ phiến lá cũng như số rễ
hình thành/mẫu, khối lượng tươi, khối lượng
khô của rễ cao nhất khi phiến lá được nuôi cấy
trên môi trường khoáng và vitamin Gamborg B5,
có bổ sung 10 mg/l NAA.
Lời cảm ơn: Đề tài thuộc chương trình hợp tác
nghiên cứu giữa Trường đại học Chiba, Nhật
Bản và phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện
Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Avilla A., Pereira M. and Arguello A.,
1998. Nitrogen concentration and
proportion of NH4+-N affect potato cultivar
response in solid and liquid media. Hort.
Sci., 33: 336-338.
2. Chee P., 1995. Stimulation of adventitious
rooting of Taxus species by thiamine. Plant
Cell Rep., 14: 753-757.
3. Gamborg L., Miller A. and Ojima K., 1968.
Nutrient requirements of suspension
cultures of soybean root cells. Exp. Cell
Res., 50: 151-158.
4. Gaspar T., Kevers C., Greppin H., Reid M.
and Thrope A., 1996. Plant hormones and
plant growth regulators in plant tissue
culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant, 32:
272-289.
5. George E. F., Davies W., 2003. Effects of
the Physical Environment. Plant
Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition
1: The Background. George EF, Hall MA,
Klerk GJ De (eds.) Springer, Dordrecht,
Netherlands: 245-246.
6. Kumazawa Y., Mizunoe K., Otsuka Y.,
1982. Immunostimultaing polysacchride
separated from hot water extract of Angelica
acutiloba Kitagawa (Yamato tohki). Pub.
Med. Immunology, 47(1): 75-83.
7. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành và
Nguyễn Văn Kết, 2010. Nghiên cứu khả
năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong
nuôi cấy in vitro. Tạp chí khoa học ĐHQG
Hà Nội, Khoa học tự nhiên và Công Nghệ,
27: 30-36.
8. Mok C., Mok S., Turner E., Mujer V., 1987.
Biological and biochemical effects of
cytokinin-active phenylurea derivatives in
tissue culture systems. Hort. Sci., 22: 1194-
1197.
9. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised
medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Plant,
15(3): 473-497.
10. Nandagopal S. and Kumari D., 2006.
Adenine sulphate induced high frequency
shoot organogenesis in callus and in vitro
flowering of Cichorium intybus L. cv. Focus
- a potent medicinal plant. Acta agriculturae
Slovenica, 87(2): 415-425.
11. Peixe A., Raposo A., Lourenço R., Cardoso
H. and Macedo E., 2007. Coconut water and
BAP successfully replaced zeatin in olive
(Olea europaea L.) micropropagation.
Scientia Horticulturae, 113: 1-7.
12. Yang J. S. and Chuang S. H., 1995. Callus
formation and plant regeneration from
petiole - derived calli of Angelica sinensis.
Plant Tis. Cul. Lett., 12(1): 91-93.
13. Yong H., Ge L., Yan N., Tan N., 2009. The
chemical composition and biological
properties of coconut (Cocos nucifera L.)
water. Molecules, 14: 5144-5164.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204
204
A STUDY ON ORGANOGENESIS FROM THIN CELL LAYER CULTURE
OF Angelica acutiloba
Hoang Ngoc Nhung1, Nguyen Thi Quynh1,
Nguyen Vu Ngoc Anh1, Nguyen Le Anh Thu1, Toyoki Kozai2
(1)Institute of Tropical Biology, VAST
(2)Chiba University, Japan
SUMMARY
Angelica (Angelica acutiloba) plants originating in Japan were considered as of higher value than other
varieties of the genus Angelica. Angelica’s roots have been used historically to treat health disorders and in
many supplemental remedies in Asian traditional medicine. In this study, organogenesis from thin cell layer
culture of japanese Angelica shoot tips and leaf blades was shown. Thin layers (1-1.5 mm thick) of shoot tips
of Angelica were cultured on MS medium supplemented with NAA (0, 0.1, or 0.2 mg/l) and/or TDZ (0.1, 0.5
or 1 mg/l). The numbe of shoots was the largest (8.9 shoots/explant) when explants were cultured on the
medium supplemented with 0.1 mg/l NAA and 1 mg/l TDZ. When Morel vitamins were replaced by
Gamborg’s B5 vitamins together with the addition of 10% (v/v) coconut water and 40 mg/l adenine to the
culture medium, the number of shoots per explants was remarkably increased after 6 weeks of culture.
In vitro Angelica leaves also proved a potential source for adventitious root production. On MS medium
supplemented with kinetin (0 or 1 mg/l), NAA (4, 6, 8, 10 or 12 mg/l), IBA (4, 6, 8, 10 or 12 mg/l), the first
open leaves from the shoot tip, when cultured in dark period, had a different response to the root formation.
The root formation from japanese Angelica’s leaf culture significantly varied with the change of medium
elements (minerals and vitamins). Percent of leaf explants having roots, number of roots per explant, root
fresh and dry weights were the largest when leaf blades were cultured on the medium containing minerals and
vitamins of Gamborg’s B5.
Keywords: Angelica acutiloba, Adventitios root, organogenesis, plant growth substances.
Ngày nhận bài: 21-6-2012
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- 1770_5653_1_pb_7708_2016698.pdf