In vitro fertilization (IVF) is a major technique producing in vitro embryos for biomedical
researches and biodiversity conservation in pigs. Main materials in this case are sperm frozen –
thawed and oocytes. In this study, we evaluated effect of frozen semen on the ability to form male
pronuclei and subsequent development of porcine oocytes matured and fertilized in vitro. Sperm
freezing and IVF was carried out according to the method of Kikuchi et al., 2002. The parameters
for the evaluationare the incidence of male pronuclei formation, monospermy, cleavage and the
morula- blastocyst rates. Frozen sperm from two Landrace porcine TL1 and TL2 stored in nitrogen
liquid is used. There was no difference (P>0,05) in male pronuclei formation rate and monospermy rate
between TL1 and TL2 groups(85,7 ± 14,3 and 57,03 ± 6,83, respectively), (53,48 ± 5,52 and 39,61 ±
3,7, respectively). The cleavage, morula/blastocyst rates did not differ between TL1 and TL2 (51,49 ±
5,77 and 29,96 ± 7,26, respectively) and (52,99 ± 8,13 và 16,69 ± 4,31, respectively). The results show
that the frozen semens are available for using in pig IVF system
6 trang |
Chia sẻ: thucuc2301 | Lượt xem: 508 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu sử dụng tinh trùng đông lạnh từ mào tinh hoàn trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn - Nguyễn Thị Hiệp, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nguyễn Thị Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 101 - 106
101
NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH TRÙNG ĐÔNG LẠNH TỪ MÀO TINH HOÀN
TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM Ở LỢN
Nguyễn Thị Hiệp1, Nguyễn Thị Ước1,
Hứa Nguyệt Mai2, Nguyễn Việt Linh1*
1Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên
TÓM TẮT
Thụ tinh ống nghiệm (TTON) là kỹ thuật chủ yếu tạo phôi in vitro với mục đích phục vụ nghiên
cứu y sinh và bảo tồn đa dạng sinh học ở lợn. Nguồn nguyên liệu chủ yếu trong các trường hợp
này là tế bào trứng và tinh trùng ở dạng đông lạnh. Trong bài này chúng tôi trình bày nghiên cứu
ảnh hưởng của các lô tinh đông lạnh tới kết quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Kỹ thuật TTON và
đông lạnh tinh được tiến hành theo phương pháp của Kikuchi và cộng sự (2002). Trứng lợn loại A,
B (có trên 3 lớp tế bào cận noãn) được nuôi thành thục trong môi trường 199 bổ sung 10% FBS
(huyết thanh thai bò) trước khi thụ tinh với tinh thu từ dịch hoàn của lợn Landrace, được xử lý và
bảo quản trong nitơ lỏng. Các chỉ tiêu theo dõi trong các thí nghiệm là tỷ lệ hình thành tiền nhân
đực, tỷ lệ đơn tinh trùng, tỷ lệ phân chia và phát triển của phôi. Kết quả kiểm tra tế bào trứng sau
thụ tinh cho thấy tỷ lệ hình thành tiền nhân đực trong tế bào trứng được thụ tinh với các lô tinh
TL1 và TL2 tương ứng là 75,31 ± 6,88% và 57,03 ± 6,83% (P>0,05), tỷ lệ đơn tinh trùng tương
ứng là 40,84 ± 5,03% và 39,61 ± 3,7%. Tỷ lệ chia, tỷ lệ phôi dâu/ phôi nang cũng không có sự
khác biệt giữa hai lô tinh, tương ứng là 51,49 ± 5,77% và 29,96 ± 7,26% đối với lô tinh TL1 và
52,99 ± 8,13% và 16,69 ± 4,31% đối với lô tinh TL2. Kết quả thí nghiệm cho thấy các lô tinh đông
lạnh có thể sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn.
Từ khóa: Thụ tinh ống nghiệm (TTON), tinh đông lạnh, lợn, tiền nhân đực, đơn tinh trùng, phôi
dâu, phôi nang
MỞ ĐẦU*
Công nghệ chuyển gene ở phôi lợn là một
trong những lĩnh vực đang được quan tâm
nghiên cứu [1], [3]. Hơn nữa, sản phẩm phôi
ống nghiệm là công cụ quan trọng trong việc
nghiên cứu qui luật của sự thành thục và sự
phát triển ở giai đoạn sớm ở lợn [3]. Các
công nghệ này góp phần nâng cao hiệu quả
chăn nuôi lợn thịt và cho phép thực hiện một
số nghiên cứu ứng dụng y sinh mới như ghép
mô khác loài ở người [6], [5], [10]. Khi
trứng, phôi lợn dùng để thao tác chuyển gene
được khai thác bằng phương pháp gây rụng
trứng thông thường, giá thành công nghệ sẽ
tăng cao do việc phải phẫu thuật nhiều con
cho. Việc thiết lập thành công một hệ thống
thụ tinh ống nghiệm chắc chắn với các sản
phẩm phôi lợn bảo đảm chất lượng sẽ mang
lại hiệu quả giảm giá thành và chủ động thời
gian thao tác [5].
Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng xảy ra ở lợn
nhiều hơn so với các loài động vật khác, ngay
* Tel: 0949 492281, Email: nvlinh@ibt.ac.vn
cả khi thụ tinh trong cơ thể dưới các điều kiện
thực nghiệm đa dạng [11],[4]. Mặc dù các kỹ
thuật về thành thục ống nghiệm, thụ tinh ống
nghiệm ở lợn đã được cải thiện dần dần trong
những năm gần đây, tỷ lệ đa tinh trùng cao ở
lợn vẫn là một trong những tồn tại chính trong
hệ thống thụ tinh ống nghiệm ở lợn [2]. Nguyên
nhân cho hiện tượng này có thể bao gồm chất
lượng tinh dịch ở thời điểm thụ tinh [10].
Với mục đích đánh giá khả năng sử dụng tinh
trùng đông lạnh thu từ dịch hoàn của lợn đực
giống đã trưởng thành để thụ tinh ống
nghiệm, trong bài này chúng tôi trình bày kết
quả nghiên cứu ảnh hưởng của các lô tinh
đông lạnh - giải đông tới khả năng hình thành
tiền nhân đực và sự phát triển tiếp theo của tế
bào trứng lợn thành thục.
VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP
Thu trứng và nuôi thành thục in vitro
Buồng trứng lợn được lấy ở lò mổ trong khu
vực Hà Nội, vận chuyển về phòng thí nghiệm
Nguyễn Thị Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 101 - 106
102
trong vòng 1-2 giờ ở 30-35oC trong dung dịch
nước muối sinh lý 0,9%, bổ sung kháng sinh
gentamycin 40mg/ml với liều lượng 6ml trên
một lít dung dịch nước muối sinh lý. Buồng
trứng được thấm máu và rửa lại 3-5 lần trong
nước muối 0,9% ở 37oC, thu trứng trong tủ
hút vô trùng bằng phương pháp rạch nang từ
các nang có kích thước là 2-6 mm. Rửa cụm
trứng và tế bào cận noãn trong môi trường
TCM199 (TCM -Tissue culture medium) dưới
kính hiển vi Nikon ở độ phóng đại 10-20 lần
bằng cách dùng kim thủy tinh có kích thước phù
hợp. Phân loại chất lượng dựa vào hình thái và
số lớp tế bào cận noãn theo phương pháp của
Leibfried và First (1979) [8] Chỉ có những trứng
loại A, B để nuôi thành thục.
Trứng loại A: có trên 3 lớp tế bào cận noãn
bao quanh trứng, các lớp tế bào cận noãn này
dày, đều đặn, đồng nhất và liên kết chặt chẽ
với nhau, nguyên sinh chất của trứng đồng
đều, toàn bộ trứng nhìn trong suốt và đầy đặn.
Trứng loại B: có từ 2-3 lớp tế bào cận noãn
bao quanh trứng, các tế bào này liên kết
không chặt chẽ, có nơi bị mất một phần tế
bào, nguyên sinh chất đồng đều nhưng hơi tối
màu ở vùng ngoại vi trứng, toàn bộ trứng
nhìn ít trong và ít đầy đặn hơn.
Môi trường nuôi thành thục trứng là môi
trường TCM 199 bổ sung 10% FBS (fetal
bovine serum - huyết thanh thai bò) với 40-50
trứng /1giếng 500 µl. Trứng lợn sau khi
nuôi 44-46 giờ trong môi trường 199 bổ
sung 10% FBS có thể đạt đến giai đoạn
thành thục (Hình 1-a). Những trứng bông
tơi và có tế bào chất đồng nhất được lựa
chọn để thụ tinh ống nghiệm.
Thụ tinh ống nghiệm (IVF)
Môi trường thụ tinh là môi trường Pig-FM cải
biên có bổ sung 2 mM caffein và 5 mg/ml
huyết thanh thai bò. Kỹ thuật IVF được làm
theo phương pháp của Kikuchi và cộng sự
(2002) [7]. Kỹ thuật này được mô tả một cách
ngắn gọn như sau: Trứng sau khi nuôi trong
môi trường TCM 199 bổ sung 10% FBS 44-
46 giờ, tổ hợp trứng-tế bào cận noãn (COCs)
được chuyển vào giọt 100 µl môi trường thụ
tinh FM được nạp trong đĩa tròn và được phủ
dầu paraffin ấm. Mỗi giọt thụ tinh chứa 10-15
trứng được thụ tinh bằng tinh trùng đông lạnh
- giải đông của lợn đực giống Landrace. Tinh
trùng được ủ trong tủ 37oC phủ dầu ấm 15
phút. Nồng độ tinh cuối cùng trong giọt thụ
tinh là là 105 tinh trùng/ml. Trứng được ủ với
tinh trùng trong 3 giờ ở 38,5oC, 5% CO2.
Ngày thụ tinh được tính là ngày 0.
Nuôi phôi in vitro (IVC)
Tiến hành tách tế bào tế bào cận noãn và tinh
trùng bám quanh trứng khỏi tế bào trứng bằng
cách dùng kim thủy tinh có kích thước phù
hợp và chuyển trứng vào nuôi trong môi
trường IVC: Môi trường IVC gốc là NCSU-
37 cải tiến bằng cách thêm 0,4% huyết thanh
thai bò (BSA) (theo thể tích) và 50 µM β-
mercaptoethanol. Có hai loại môi trường IVC:
IVC-PyrLac (Môi trường IVC cơ bản có bổ
sung 0,17 mM natri pyruvat và 2,73 mM natri
lactac) và IVC-glu (môi trường cơ bản có bổ
sung 5,55 mM glucose). Phôi được nuôi trong
tủ nuôi 38,5oC, 5% CO2 trong môi trường
IVC PyrLac từ ngày 0 đến ngày 2, sau đó
được chuyển sang nuôi trong môi trường có
bổ sung glucose cho đến ngày 6.
Đánh giá khả năng hình thành tiền nhân,
sự phát triển của phôi.
Sau thụ tinh từ 8-10 giờ, trứng được cố định
trên tiêu bản và đưa vào dung dịch cố định (3
ethanol: 1 acid acetic). Sau 4 ngày, tế bào
trứng được nhuộm bằng dung dịch orcein 1%
trong 5-7 phút, rửa bằng dung dịch aceto-
glycerol (1 acid acetic: 1 glycerol: 3 nước
cất). Tiêu bản được để khô và soi dưới kính
hiển vi có độ phóng đại 400 lần để đánh sự
hình thành tiền nhân đực, tỷ lệ đơn tinh, đa
tinh trùng.
Sự phát triển của phôi được ghi nhận ở ngày
thứ 2 và ngày thứ 6 sau thụ tinh (Ngày thứ 2
ghi nhận tỷ lệ chia của phôi. Ngày thứ 6 đánh
giá tỷ lệ hình thành phôi dâu, phôi nang).
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của các lô tinh tới
khả năng thụ tinh bình thường trong thụ tinh
Nguyễn Thị Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 101 - 106
103
ống nghiệm ở lợn: Tế bào trứng lợn nuôi
thành thục in vitro được thụ tinh bằng tinh
trùng đông lạnh - giải đông của hai lô tinh là
TL1, TL2 (TL1, TL2 thu từ mào dịch hoàn
của lợn Landrace thu tại lò mổ Thanh Oai, Hà
Nội. Mào dịch hoàn được chuyển về phòng
thí nghiệm 1-2 giờ sau khi lợn bị giết mổ,
đông lạnh theo phương pháp của Kikuchi và
cs, 2002. Tinh đông lạnh trong cọng rạ với
nồng độ 1 triệu tinh trùng/cọng rạ. Tinh đông
lạnh có hoạt lực 30-40%.
Các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm 1 là :
Tỷ lệ thành thục của trứng, tỷ lệ hình thành
tiền nhân đực, tỷ lệ đơn tinh trùng, tỷ lệ đa
tinh trùng.
Tỷ lệ thành thục (%) = Số trứng ở giai đoạn
metaphase II + trứng có hình thành tiền
nhân/Tổng số trứng thí nghiệm *100
Tỷ lệ hình thành MPN (%) = Số trứng hình
thành MPN/Tổng số trứng thí nghiệm *100
Tỷ lệ đơn tinh trùng (%) = Số trứng có 1
MPN/Tổng số trứng thí nghiệm *100
Tỷ lệ đa tinh trùng (%) = Số trứng có trên 2
MPN/Tổng số trứng thí nghiệm *100
Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của các lô tinh tới
sự phát triển tiếp theo của phôi lợn thụ tinh
ống nghiệm: Tế bào trứng lợn nuôi thành thục
in vitro, thụ tinh bằng tinh trùng đông lạnh -
giải đông của hai lô tinh TL1, TL2. Kiểm tra
tỷ lệ phân chia vào ngày thứ 2, tỷ lệ phôi
dâu/phôi nang vào ngày thứ 6 sau thụ tinh.
Các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm 2 là
tỷ lệ phôi chia và tỷ lệ hình thành phôi
dâu/phôi nang.
Tỷ lệ phôi chia (%) = Số phôi chia/Tổng số
trứng thụ tinh *100
Tỷ lệ phôi dâu/phôi nang (%) = Số phôi dâu,
phôi nang/Số trứng thụ tinh *100
Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và
Minitab 16. Tỷ lệ hình thành tiền nhân đực, tỷ
lệ đơn tinh, tỷ lệ chia, tỷ lệ phôi nang được so
sánh bằng phân tích ANOVA One - Way
analysis of Variance theo phương pháp
Turkey’s test, sự khác biệt P<0,05 là có ý nghĩa.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Ảnh hưởng của các lô tinh đông lạnh tới sự
thụ tinh, quá trình hoạt hóa của trứng và
tinh trùng
Khả năng hình thành tiền nhân đực của tế bào
trứng lợn sau thụ tinh chứng tỏ tế bào trứng
được thụ tinh và hoạt hóa. Trong thí nghiệm 1
chúng tôi đánh giá ảnh hưởng của các lô tinh
đông lạnh tới khả năng hình thành tiền nhân
đực, sự thụ tinh bình thường, đa tinh của tế
bào trứng lợn. Kết quả ở bảng 1 cho thấy, tỷ
lệ hình thành tiền nhân đực (Hình 1-b) của
nhóm tế bào trứng thụ tinh bằng tinh đông
lạnh TL1, TL2 tương ứng là 75,31% và
57,03%. Lô tinh đông lạnh TL1 cho tỷ lệ hình
thành tiền nhân cao hơn lô tinh TL2 (75,31%
sv 57,03%) P>0,05. Kết quả hình thành tiền
nhân của chúng tôi tương đương với kết quả
của tác giả Nguyễn Việt Linh và cs, 2009.
[12]. Theo đó, tỷ lệ hình thành tiền nhân đạt
từ 50,81% tới 66,03%.
Một trong những vấn đề nan giải trong thụ
tinh ống nghiệm ở lợn là hiện tượng đa tinh
trùng (Hình 1-c), tức là nhiều tinh trùng cùng
xâm nhập vào tế bào trứng. Khi tỷ lệ đơn tinh
trùng càng cao thì tỷ lệ đa tinh trùng càng
giảm. Đây là chỉ tiêu quan trọng cần đánh giá
trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Tỷ lệ đơn
tinh trùng của tế bào trứng được thụ tinh bằng
lô tinh TL1 cao hơn so với TL2 (40,84% sv
39,61%) P>0,05. Để đánh giá tổng quan chất
lượng của các lô tinh đông lạnh sử dụng,
chúng tôi tiến hành so sánh các kết quả với
các nghiên cứu liên quan của các phòng thí
nghiệm khác trên thế giới.
Kết quả về tỷ lệ đơn tinh trùng của chúng tôi
cũng tương đương với các kết quả của tác giả
Nguyễn Việt Linh và cs, 2009 [12]. Theo tác
giả, tỷ lệ đơn tinh trùng dao động từ 28,2 ±
6,1% tới 38,3 ± 7,7% tùy vào nồng độ của
cystein trong môi trường nuôi thành thục.
Nguyễn Thị Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 101 - 106
104
Bảng 1. Ảnh hưởng của các lô tinh tới khả năng hình thành tiền nhân đưc
của trứng thành thục, thụ tinh ống nghiệm
Lô tinh
Số trứng
khảo sát
Tỷ lệ hình thành tiền
nhân đực – MPN (%)
Tỷ lệ đơn tinh trùng (%)
Tỷ lệ đa tinh trùng
(%)
TL1 94 76 (75,31 ± 6,88) 43 (40,84 ± 5,03) 32 (33,52 ± 5,64)
TL2 201 122 (57,03 ± 6,83) 78 (39,61 ± 3,7) 44 (17,42 ± 5,71)
Bảng 2. Ảnh hưởng của các lô tinh tới sự phát triển tiếp theo của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm
Lô tinh Số phôi giả định Tỷ lệ phôi chia (%)
Tỷ lệ hình thành phôi
dâu/phôi nang (%)
TL1 179 101 (51,49 ± 5,77) 62 ( 29,96 ± 7,26)
TL2 164 84 (52,99 ± 8,13) 31 (16,69 ± 4,31)
Tác giả Zăhan và cs, (2006) [13] cũng nghiên
cứu về ảnh hưởng của nồng độ tinh tới thụ
tinh ống nghiệm ở lợn. So với tác giả Zăhan
và cs, (2006) thì kết quả về tỷ lệ thụ tinh bình
thường (đơn tinh) của chúng tôi là tương
đương. Theo tác giả, nồng độ tinh tối ưu là
7,5 x105 tinh trùng/ml và 10 x105 tinh
trùng/ml cho tỷ lệ thụ tinh bình thường là
41,94% và 41,38%, theo thứ tự. Kết quả này
xấp xỉ với kết quả về tỷ lệ đơn tinh của chúng
tôi (40,84 ± 5,03% và 39,61 ± 3,7%) với lô
tinh TL1 và TL2.
Nghiên cứu của tác giả Sherrer và cs, (2004)
[9]. Tỷ lệ tế bào trứng đơn tinh trùng khi thụ
tinh bằng tinh trùng của lợn Boar 18-7 cao
hơn so với tinh của lợn Boar 162 tương ứng là
(47,0 ± 2,3% vs 33,8 ± 2,3%) với P<0,01.
Như vậy, tinh trùng từ lô tinh TL1, TL2 của
chúng tôi cho tỷ lệ đơn tinh trùng là (40,84%
và 39,61%) thấp hơn so với tinh từ lợn Boar
18-7 (47,0 ± 2,3%) nhưng lại cao hơn so với
tinh từ lợn Boar 162 (33,8 ± 2,3%). Cũng
theo Sherrer và cs, 2004, hiện tượng đa tinh
trùng là 24,8 ± 2,5% đối với tinh của lợn Boar
18-7 và 12.9 ± 2,5% đối với tinh của lợn Boar
162. Trong khi đó kết quả của chúng tôi là
33,52 ± 5,64% đối với TL1 và 17,42 ± 5,71%
đối với TL2 cao hơn so với công bố của tác
giả Sherrer và cs, (2004). Trong nghiên cứu
của tác giả Sherrer và cs, (2004) thì yếu tố cá
thể lợn cũng ảnh hưởng tới tỷ lệ đơn tinh, đa
tinh. Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng
tôi, không có sự khác biệt giữa hai lô tinh
TL1, TL2.
Nhìn chung, kết quả của chúng tôi về tỷ lệ thụ
tinh, tỷ lệ đơn tinh trùng và đa tinh trùng
không có sự khác biệt lớn so với kết quả trong
công bố của các tác giả Sherrer và cs, 2004
[9]. Tỷ lệ tế bào trứng được thụ tinh bằng tinh
trùng lô TL1 cao hơn so với lô TL2 (75,31 ±
6,88% so với 57,03 ± 6,83%), nhưng tỷ lệ đa
tinh trùng tương ứng cũng cao hơn (33,52 ±
5,64 so với 17,42 ± 5,71%), P>0,05.
Như vậy, xét về phương diện hoạt hóa tế bào
trứng ở thời điểm 8 - 10 giờ sau thụ tinh thì cả
hai lô tinh TL1 và TL2 đều có thể sử dụng
trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn.
Ảnh hưởng của các lô tinh đông lạnh tới sự
phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn
sau thụ tinh ống nghiệm
Để đánh giá chất lượng của các lô tinh, chúng
tôi còn dựa vào tỷ lệ chia của phôi ở ngày thứ
hai và tỷ lệ thình thành phôi nang ở ngày thứ
6. Kết quả thể hiện ở bảng 2.
Bảng 2 cho thấy, tỷ lệ chia của phôi (Hình 1-
d) thu được từ hai lô tinh là TL1, TL2 tương
đương (51,49 ± 5,77% so với 52,99 ± 8,13%),
P > 0,05. Kết quả của chúng tôi tương đương
với kết quả công bố của tác giả Nguyễn Việt
Linh và cs, 2009 (51,9 ± 7,7%) [12] ở mức
nồng độ cystein là 0,2 mM và Sherrer và cs,
2004 (51,6 ± 3,1%) với tinh từ lợn Boar 162
và thấp hơn so với tinh từ Boar 18-7 (63,0 ±
3,1%). Cũng theo tác giả, nồng độ tối ưu sử
dụng là 0,5 x 106 tinh trùng/ml, tỷ lệ chia có
thể đạt tới 70,2 ± 6,2%.
Nguyễn Thị Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 101 - 106
105
Hình 1. a-tế bào trứng lợn thành thục (mũi tên chỉ sự xuất hiện thể cực thứ nhất),
b-tế bào trứng lợn đơn tinh với tiền nhân đực và tiền nhân cái, c- đa tinh-có trên một tiền nhân đực,
d-phôi 2-4 tế bào, e-phôi dâu, f-phôi nang
Kết quả về tỷ lệ hình thành phôi dâu (Hình 1-
e), phôi nang (Hình 1-f) với lô tinh TL1 cao
hơn so với lô tinh TL2 tương ứng là 29,96 ±
7,26 % và 16,69 ± 4,31%, P>0,05. Kết quả
này của chúng tôi cao hơn so với công bố của
tác giả Sherrer và cs, 2004 [9], với tỷ lệ hình
thành phôi nang đạt khoảng 3%, nhưng thấp
hơn so với công bố của tác giả Nguyễn Việt
Linh và cs, 2009 [12], với tỷ lệ hình thành
phôi nang từ 14,8% - 24,3% tùy vào mức
nồng độ của cystein trong môi trường nuôi
thành thục.
Tùy hệ thống nuôi, nồng độ tinh, môi trường
nuôi, mà kết quả về tỷ lệ chia, tỷ lệ hình
thành phôi nang có sự khác nhau giữa các
nghiên cứu trên thế giới. Kết quả nghiên cứu
của chúng tôi về tỷ lệ chia, tỷ lệ hình thành
phôi nang sử dụng lô tinh đông lạnh TL1,
TL2 ở nồng độ tinh 105 tinh trùng/ml cho tỷ lệ
chia khoảng 50% và tỷ lệ phôi dâu/phôi nang từ
16-30% là hoàn toàn chấp nhận được. Từ đó
chứng tỏ các lô tinh đông lạnh trên đủ tiêu
chuẩn dùng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn.
KẾT LUẬN
Xét về khả năng hoạt hóa tế bào trứng sau thụ
tinh ở thời điểm 8-10 giờ sau thụ tinh. Lô tinh
TL1 cho tỷ lệ hình thành tiền nhân cao hơn so
với TL2. Tuy nhiên tỷ lệ thụ tinh bình thường
(đơn tinh) thì lại ngang nhau (khoảng 40%).
Xét về khả năng phát triển của phôi, hai lô
tinh TL1, TL2 cho tỷ lệ phân chia khoảng
50%. Tỷ lệ phôi dâu/phôi nang của lô tinh
TL1, TL2 từ 16-30%. Qua đó, chúng tôi có
thể kết luận rằng cả hai lô tinh TL1,TL2 đều
đủ tiêu chuẩn dùng trong thụ tinh ống nghiệm
ở lợn.
Lời cảm ơn: Công trình này được hoàn thành
với sự tài trợ kinh phí của Quĩ phát triển Khoa
học và Công nghệ Quốc gia cấp cho đề tài mã
số 106.12-2012.93 “Nghiên cứu ảnh hưởng
của giọt noãn bào chất đơn tinh lên sự hoạt
hóa trứng và sự phát triển của phôi”. Các tác
giả xin trân trọng cảm ơn đóng góp quý báu
của GS. Kazuhiro Kikuchi trong các thí
nghiệm và hoàn thành bài báo này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Thị Ước, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn
Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu, Đặng Nguyễn Quang
Thành, Nguyễn Thị Mến, Trần Thị Thơm, Nguyễn
Trung Thành, Bùi Linh Chi, Dương Đình Long,
Nguyễn Khắc Tích, Phan Ngọc Minh, và Bùi
Xuân Nguyên - Sản xuất phôi lơn mini nội địa
bằng tổ hợp công nghệ ống nghiệm và nhân bản
Nguyễn Thị Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 101 - 106
106
vô tính. Tạp chí Công nghệ sinh học - số chuyên
san 6 (4A) (2008) 625-635.
2. Abeydeera LR. In vitro fertilization and embryo
development in pigs. Reproduction Suppl 58
(2001) 159-173.
3. Annadie K., Eric S., Pieter L., Jos V., Ben C., Mart
B. The effect of oviductal epithelial cell co-culture
during in vitro maturation on sow oocyte
morphology, fertilization and embryo development.
Theriogenology 59 (2003) 1889-1903.
4. Hunter R. H. F. Fertilization of pig eggs in vivo
and in vitro. J Reprod Fertil (Suppl) 40 (1990)
211–226
5. Kashiwazaki N., Kikuchi K., Suzuki K.,
Noguchi J., Nagai T., Kaneko H., and Shino M.
Development In Vivo and In Vitro to Blastocysts
of Porcine Oocytes Matured and Fertilized In
Vitro. Journal of Reproduction and Development
47 5 (2001) 303-310.
6. Kątska, Książkiewicz L. Pig embryo production
by in vitro maturation and fertilization of ovarian
oocytes. A review. J Anim Sci 15 (2006) 525-542.
7. Kikuchi K., Onishi A., Kashiwazaki
N., Iwamoto M., Noguchi J., Kaneko H., Akita
T., Nagai T. Successful piglet production after
transfer of blastocysts produced by a modified in
vitro syste. Biol Reprod 66 4 (2002) 1033-41.
8. Leibfried L and First N.L. Characterization of
bovine follocular oocytes and their ability invitro.
Journal of Animal Science 48 (1979) 76-86.
9. Sherrer E. S., Rathbun T. J and. Davis D. L.
Fertilization and blastocyst development in
oocytes obtained from prepubertal and adult pigs.
Journal of Animal Science. 82 (2004) 102-108
10. Sirard M. A., Dubuc A., Bolamba D., Zheng
Y., Coenen K. Follicule oocyte-sperm interactions
in vivo and in vitro in pigs. J Reprod Fertil (Suppl)
48 (1993) 3-16
11. Suzuki H., Saito Y., Kagawa N., and Yang X.
In vitro fertilization and polyspermy in the pig:
Factors affecting fertilization rates and
cytoskeletal reorganization of the oocyte.
Microscopy Research and Technique 61 (2003)
327-334
12. Viet Linh N., Thanh Quang D. N., Nguyen B.
X., Manabe N. and Nagai T. Effect of Cystein
During In Vitro Maturation of Porcine Oocytes
Under Low Oxygen Tension On Their Subsequent
In Vitro Fertilization and Development. J.Reprod.
Dev. 55 6 (2008) 594-598.
13. Zăhan M., Miclea V., Man C., Miclea I.,
Roman I. The Influence of Sperm Concentration
on Swine In Vitro Fertilization. Buletinul USAMV-
CN 62 (2006) 319.
SUMMARY
THE EFFECT OF FROZEN SPERM FACTOR ON DEVELOPMENTAL
COMPETENCE OF PORCINEOOCYTE MATURED, FERTILIZED IN VITRO
Nguyen Thi Hiep1, Nguyen Thi Uoc1, Hua Nguyet Mai2, Nguyen Viet Linh1*
1Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology.
2College of Science -TNU
In vitro fertilization (IVF) is a major technique producing in vitro embryos for biomedical
researches and biodiversity conservation in pigs. Main materials in this case are sperm frozen –
thawed and oocytes. In this study, we evaluated effect of frozen semen on the ability to form male
pronuclei and subsequent development of porcine oocytes matured and fertilized in vitro. Sperm
freezing and IVF was carried out according to the method of Kikuchi et al., 2002. The parameters
for the evaluationare the incidence of male pronuclei formation, monospermy, cleavage and the
morula- blastocyst rates. Frozen sperm from two Landrace porcine TL1 and TL2 stored in nitrogen
liquid is used. There was no difference (P>0,05) in male pronuclei formation rate and monospermy rate
between TL1 and TL2 groups(85,7 ± 14,3 and 57,03 ± 6,83, respectively), (53,48 ± 5,52 and 39,61 ±
3,7, respectively). The cleavage, morula/blastocyst rates did not differ between TL1 and TL2 (51,49 ±
5,77 and 29,96 ± 7,26, respectively) and (52,99 ± 8,13 và 16,69 ± 4,31, respectively). The results show
that the frozen semens are available for using in pig IVF system.
Key words: In vitro fertilization, frozen semen, porcine oocyte, male pronuclei, monospermy,
morula-blastocyst
Ngày nhận bài:30/7/2014; Ngày phản biện:07/8/2014; Ngày duyệt đăng:20/8/2014
Phản biện khoa học: TS. Nguyễn Thị Hải Yến – Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên
* Tel: 0949 492281, Email: nvlinh@ibt.ac.vn
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- brief_48464_52379_10920151055515_5215_2046577.pdf