Nghiên cứu phân lập và xác lập môi trường nuôi cấy vi nấm cộng sinh phân lập từ rễ cây thông đỏ tại vùng Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng - Đàm Sao Mai

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 84-89 84 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ XÁC LẬP MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI NẤM CỘNG SINH PHÂN LẬP TỪ RỄ CÂY THÔNG ĐỎ TẠI VÙNG LẠC DƯƠNG, TỈNH LÂM ĐỒNG Đàm Sao Mai1*, Võ Trung Âu2 1Trường Đại học Công nghiệp tp. Hồ Chí Minh, *damsaomai@foodtech.edu.vn 2Trường Đại học Szent István, Hungary TÓM TẮT: Nghiên cứu này đề cập đến vi nấm nội cộng sinh có khả năng sinh taxol, được phân lập từ các cây thông đỏ (Taxus wallichiana) mọc tự nhiên tại vùng Lạc Dương, Lâm Đồng. Kết quả nghiên cứu cho thấy, trên các cây thông đỏ khảo sát chủ yếu tồn tại vi nấm nội cộng sinh Fusarium oxysporum, loài này đã được xác lập và phát triển tốt trên môi trường MMN cải tiến có bổ sung vitamin B1 (0,05 mg), KH2PO4 (0,9 g), NH4+, (0,15 g), dung dịch FeCl3 1% (1,8 mL); sau 30 ngày nuôi cấy, thu nhận được 10,85 g sinh khối/l môi trường (theo khối lượng khô). Nấm F. oxysporum còn được xác định phát triển rất tốt trên môi trường PDB có bổ sung 0,1 g vitamin B1/l môi trường; sau 16 ngày nuôi cấy, thu nhân được 9,71 g sinh khối/l môi trường (theo khối lượng khô). Lượng taxol thu nhận được là 250,98 mg/kg khối lượng khô. Từ khóa: Fusarium oxysporum, Taxus wallichiana, nấm cộng sinh. MỞ ĐẦU Vi nấm cộng sinh với rễ thực vật nhằm hỗ trợ và cung cấp dinh dưỡng, sự giúp đỡ qua lại đó giúp cả hai sinh trưởng và phát triển. Cây trồng phải thông qua giai đoạn cộng sinh mới hoàn thành vòng đời hoặc chu kỳ sống của mình. Vì vậy, hiện tượng cộng sinh là giai đoạn phát triển không thể thiếu để chúng tồn tại và sinh sản [1, 7, 8]. Các nhà khoa học đã xác định được một số hình thức cộng sinh, trong đó, quá trình cộng sinh chủ yếu là giữa nấm và rễ cây, được gọi là nấm rễ cộng sinh. Harley & Smith (1983) [4] cho biết có đến 70-90% trong số các loài thực vật sống trên đất tham gia vào việc hình thành cộng sinh nấm rễ (arbuscular mycorrhizae-AM). Thông đỏ (Taxus wallichiana) thuộc họ Thanh tùng (Taxaceae), từ vỏ và lá cây thông đỏ chiết xuất được taxol và các hoạt chất, dùng để chữa bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư não và có triển vọng xử lý u hắc tố. Hiện nay, ở Việt Nam, thông đỏ chỉ tồn tại ở một số vùng rừng của Lâm Đồng với số quần thể và cá thể rất ít và cũng đang đối diện với nguy cơ biến mất. Đã có một số nghiên cứu thành công liên quan đến cây thông đỏ như: nhân giống hữu tính, vô tính; nuôi cấy tế bào thông đỏ [5]. Mục tiêu của nghiên cứu này là định tên và xác định vi nấm nội cộng sinh có khả năng kết hợp tốt nhất với thông đỏ, xác lập môi tường nuôi cấy thích hợp của vi nấm, đồng thời định lượng taxol tạo thành khi nuôi cấy trong môi trường nghiên cứu. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Rễ cây thông đỏ được lấy từ các cây thông đỏ tại 5 địa điểm khác nhau ở vùng núi thuộc Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng tại độ cao trên 1.600 m so với mặt nước biển. Các mẫu thu nhận được rửa sạch bằng ethanol 70% (v/v) trong 1 phút và HgCl2 0,1% (v/v) trong 8 phút, sau đó được rửa lại 6 lần bằng nước cất trước khi đem đi phân lập vi nấm nội cộng sinh. Sử dụng môi trường MMN (0,067 g CaCl2.2H2O; 0,025 g NaCl; 0,5 g KH2PO4; 0,25 g (NH4)2)HPO4; 0,15 g MgSO4.7H2O; 0,1 g Thiamin.HCl; 1,2 mL FeCl3(1%); 3,0 g Malt extract; 10 g D-glucose; 15 g Agar) và môi trường PDA (0,23 l dịch chiết khoai tây, 20 g dextrose; 0,77 l nước, 15 g Agar) của Difco để nhân giống và phân lập vi nấm. Chọn lọc vi nấm nội cộng sinh phù hợp cho nghiên cứu tiếp. Xác định môi trường tối ưu của vi nấm nội cộng sinh chọn lọc qua môi trường MMN dạng lỏng và môi trường PDB có bổ sung vi lượng (bảng 1). Dam Sao Mai, Vo Trung Au 85 Bảng 1. Thành phần môi trường của các công thức khảo sát trên môi trường MMN Thành phần môi trường (g) (*) Công thức Glucose (g) MgSO4. 7H2O (g) CaCl2. 2H2O (g) NaCl (g) VTB1 (mg) Malt (g) NH4+ (g) KH2PO4 (g) FeCl3 1% (mL) CT Cơ bản 10 0,15 0,067 0,025 0,1 3 0,25 0,5 1,2 NT1 10 0,15 0,067 0,025 0,15 1 0,15 0,1 0,6 NT2 10 0,15 0,067 0,025 0,05 5 0,15 0,1 0,6 NT3 10 0,15 0,067 0,025 0,05 1 0,35 0,1 0,6 NT4 10 0,15 0,067 0,025 0,15 5 0,35 0,1 0,6 NT5 10 0,15 0,067 0,025 0,05 1 0,15 0,9 0,6 NT6 10 0,15 0,067 0,025 0,15 5 0,15 0,9 0,6 NT7 10 0,15 0,067 0,025 0,15 1 0,35 0,9 0,6 NT8 10 0,15 0,067 0,025 0,05 5 0,35 0,9 0,6 NT9 10 0,15 0,067 0,025 0,05 1 0,15 0,1 1,8 NT10 10 0,15 0,067 0,025 0,15 5 0,15 0,1 1,8 NT11 10 0,15 0,067 0,025 0,15 1 0,35 0,1 1,8 NT12 10 0,15 0,067 0,025 0,05 5 0,35 0,1 1,8 NT13 10 0,15 0,067 0,025 0,15 1 0,15 0,9 1,8 NT14 10 0,15 0,067 0,025 0,05 5 0,15 0,9 1,8 NT15 10 0,15 0,067 0,025 0,05 1 0,35 0,9 1,8 NT16 10 0,15 0,067 0,025 0,15 5 0,35 0,9 1,8 NT17 10 0,15 0,067 0,025 0,1 1 0,25 0,5 1,2 NT18 10 0,15 0,067 0,025 0,1 5 0,25 0,5 1,2 NT19 10 0,15 0,067 0,025 0,1 3 0,15 0,5 1,2 NT20 10 0,15 0,067 0,025 0,1 3 0,35 0,5 1,2 NT21 10 0,15 0,067 0,025 0,1 3 0,25 0,1 1,2 NT22 10 0,15 0,067 0,025 0,1 3 0,25 0,9 1,2 NT23 10 0,15 0,067 0,025 0,1 3 0,25 0,5 0,6 NT24 10 0,15 0,067 0,025 0,1 3 0,25 0,5 1,8 NT25 10 0,15 0,067 0,025 0,05 3 0,25 0,5 1,2 NT26 10 0,15 0,067 0,025 0,15 3 0,25 0,5 1,2 *Công thức môi trường của các công thức thí nghiệm được xác lập qua phần mềm Modde 5 (tối ưu hóa thực nghiệm). Sử dụng môi trường PDB cơ bản (0,23 l dịch chiết khoai tây, 20 g dextrose; 0,77 l nước) có bổ sung vitamin B1 với lượng lần lượt là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 g/l. Vi nấm được nuôi cấy lắc (160rpm) sau 16 ngày trong môi trường PDB có bổ sung thiamin, tại nhiệt độ 24-28oC; sau đó được xử lý bằng phương pháp siêu âm trong thời gian 5h ở nhiệt độ phòng với ethyl acetate theo tỷ lệ 3:1 (v/v). Dịch thu nhận được cô quay, sau đó, hòa tan trong 10 mL MeOH 100% (v/v). Xác định lượng taxol hình thành từ vi nấm nội cộng sinh bằng HPLC, với đầu dò PAD, phổ hấp thụ là 230 nm, cột C18, tốc độ dòng là 0,5 mL/phút với hệ methanol-nước (65:35, v/v), thể tích tiêm mẫu là 10 µl, với taxol chuẩn. Phân tích số liệu Kết quả trong các công thức thí nghiệm được trình bày là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của 3 lần lặp (sai số≤5%). Dữ liệu được phân tích bằng phương pháp phân tích phương sai một chiều (ANOVA) bằng phần mềm Statgraphic phiên bản 3.0. Sự khác biệt giữa các mẫu có ý nghĩa về mặt thống kê với p<0,05. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 84-89 86 Phân lập và chọn lọc chủng vi nấm cộng sinh 25 mẫu thực vật được lấy từ rễ của 10 cây thông đỏ mọc tự nhiên ở các địa điểm khác nhau, tại vùng Lạc Dương, Lâm Đồng (hình 1), tổng số lượng khuẩn lạc thu được là 100. Sau đó các mẫu được phân lập, quan sát và chọn lọc chủng vi nấm nội cộng sinh phù hợp dựa theo khả năng sinh taxol, và sự phân bố của vi nấm trong các mẫu thu nhận. Kết quả cho thấy, lượng khuẩn lạc xuất hiện trên mỗi mẫu không nhiều, từ 3-5 khuẩn lạc/mẫu. Các khuẩn lạc thu nhận được phân lập, nhân sinh khối và kiểm tra lượng taxol. Các khuẩn lạc có màu đỏ phát triển nhanh và mạnh, khả năng lan rộng mạnh; các khuẩn lạc này có cùng một dạng hình thái (hình 2) được xác định thuộc chi Fusarium và có khả năng sinh taxol. Hình 1. Cây thông đỏ tự nhiên: cây con (a), gốc cây lớn (b) Hình 2. Phân lập vi nấm nội cộng sinh (AM) từ rễ cây thông đỏ (a); (b). hình vi nấm quan sát dưới kính hiển vi (1000) Định danh chủng vi nấm nội cộng sinh Vi nấm nội cộng sinh trước tiên được định danh qua hình thái, các chủng hiện diện từ các mẫu thu nhận được xác định thuộc các chi khác nhau là Fusarium, Trichoderma, Aspergilus, Phomopsis và Pezicula. Vi nấm nội cộng sinh được chọn lựa định danh là các chủng có khả năng sinh taxol. Mẫu định danh theo phương pháp giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH. Kết quả giải trình tự gen của chủng có khả năng sinh taxol cao nhất trong các mẫu thu nhận có trình tự sau: GAAGTTGGGGTTTAACGGCGT GGCCGCGACGATTACCAGTAACGAGGGTTTT ACTACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCG CCAATCAATTTGAGGAACGCGAATTAACGCG AGTCCCAACACCAAGCTGTGCTTGAGGGTTG AAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAG AATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAG ATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCAC ATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATC GATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAA AGTTTTGATTTATTTATGGTTTTACTCAGAAG a b a b Dam Sao Mai, Vo Trung Au 87 TTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTC TGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGCGGG CTGATCCGCCGAGGCAACAAGTGGTATGTTC ACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAAT GATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCT TGTTACGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCGA GTTTGGAGAGCTTTCCGGCCCTGAGTGGTAG TTGCCCACCTCTCTGGGCCAGTCCGGACGCC TCACTGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACG GGCGGTGTGTACAAA. Kết quả định danh đã xác định đây là chủng Fusarium oxysporum F-H.6.5-030318-02. Theo Stoner (1981) [9], F. oxysporum là vi nấm đa dạng và dễ thích nghi đã được tìm thấy trong các loại đất khác nhau, từ sa mạc Sonoran, rừng nhiệt đới và ôn đới, đồng cỏ. F. oxysporum gây phản ứng như là một tác nhân gây bệnh cây trồng, bệnh héo cây. Gordon & Martyn (1997) [3] đã xác định F. oxysporum có thể liên kết với các vi nấm ngoại cộng sinh, từ đó có thể xâm nhập vào các tế bào trong rễ và định cư ở các hệ thống rễ, lúc này các triệu chứng cây héo có thể giảm, đồng thời tạo một số chất mới trong cây. Như vậy, với các cây thông đỏ, sẽ là giải pháp tốt nếu kết hợp vi nấm ngoại cộng sinh trong quá trình chăm sóc và trồng trọt từ đó giảm thiểu bệnh cho cây và tăng khả năng phát triển cây cũng như tăng lượng các chất hình thành trong cây. Xác định môi trường tối ưu cho chủng vi nấm nội cộng sinh Kết quả thử nghiệm thành phần môi trường trong bảng 1 và hình 3 cho thấy, công thức 8, 16 và 24 cho kết quả ổn định nhất trong suốt quá trình nuôi cấy. Tất cả các công thức này đều có lượng NH4- > 0,25 g/l. Như vậy NH4- tác động đến quá trình tăng trưởng của vi nấm này. Công thức 8, 10, 11, 14 và 15 cho kết quả vượt trội sau 30 ngày nuôi cấy, trong đó, có thể thấy với công thức 14 có sự tăng đột ngột của lượng sinh khối tạo thành. Trong công thức này, các nguyên tố vi lượng cần bổ sung, cụ thể là: vitamin B1 (0,05 mg), KH2PO4 (0,9 g), NH4 - (0,15 g), dung dịch FeCl3 1% (1,8 mL). Lượng vi nấm có thể đạt là 10,85 g/l môi trường (tính theo khối lượng khô). Hình 3. Tác động của các nguyên tố vi lượng đến sự phát triển của F. oxysporumtrên môi trường MMN MMN là môi trường tốt cho F. oxysporum phát triển, tuy nhiên, để giảm giá thành và tăng hiệu quả kinh tế, môi trường PDB được khảo sát với việc bổ sung thêm vitamin B1. Hình 4 cho thấy, tác động của vitamin B1 đến sự phát triển của F. oxysporum trên môi trường PDB hoàn toàn phù hợp cho F. oxysporum phát triển. Từ các hình 3 và 4 có thể thấy, F. oxysporum phát triển trên môi trường MMN tốt hơn trên môi trường PDB. Tuy nhiên, thời gian phát triển của vi nấm trên môi trường PDB ngắn hơn. Lượng vi nấm đạt được sau 16 ngày tăng trưởng đã gần tương đương với công thức phát triển tốt nhất là NT14 sau 30 ngày tăng trưởng. Kết quả ANOVA thể hiện tỷ lệ F (F ratio), trong trường hợp này bằng 22,06. Với giá trị P<0,05, dẫn đến có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị của 10 thực nghiệm ở mức độ tin cậy 95%. Công thức K hố i l ư ợn g vi n ấm (g /L ) TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 84-89 88 Hình 4 còn cho thấy, với lượng vitamin B1 vừa phải, khoảng 0,1-0,2 g/l phù hợp cho sự phát triển của vi nấm. Với môi trường MMN, lượng vitamin B1 sử dụng phù hợp là 0,05 mg/l. Sau 16 ngày nuôi cấy, kết quả thu được tốt nhất khi sử dụng môi trường PDB có bổ sung 0,1mg vitamin B1 là 9,71 g/l (tính theo khối lượng khô). Số lượng này thấp hơn so với việc sử dụng môi trường MMN công thức 14 (đạt được 10,85 g/l) sau 30 ngày nuôi cấy, sự khác biệt có thể chấp nhận được. Hình 4. Tác động của vitamin B1 đến sự phát triển của F. oxysporum trên môi trường PDB Định lượng taxol hình thành từ vi nấm nội cộng sinh đã chọn lọc Lượng taxol hình thành từ F. oxysporum phân lập được là 250,98 mg/kg khối lượng khô (tương đương 2,437 mg/l môi trường). Đây là lượng taxol thu được khi nuôi cấy vi nấm sau 16 ngày ở môi trường PDB, ở 24-28oC có bổ sung thiamin. So sánh với một số nghiên cứu khác về các chủng vi nấm nội cộng sinh và khả năng tổng hợp taxol từ các chủng này, cụ thể M. anisopliae H-27 (846,1 g/l), Cladosporium sp MD2 (800 g/l), Phyllostica cittricarpa (265 g/l), Botrytis sp. HD181-23 (206,34 g/l), Alternaria alternate (84,5 g/l), Trichoderma Tax-23 (19,586 g/l), Fusarium mairei UH23 (20 g/l), Fusarium F2 (31,5 g/l) và Fusarium solani (1,6 g/l), chủng Fusarium oxysporum F- H.6.5-030318-02 (tổng hợp được 2,437 mg/l) thu nhận từ nghiên cứu này cho kết quả khá khả quan [2, 6, 10, 11]. Mặc dù lượng taxol thu được từ vi nấm nội cộng sinh không cao như với thực vật cộng sinh, nhưng với thời gian nuôi cấy ngắn, tỷ lệ tăng trưởng cao, thời gian sinh trưởng ngắn, việc sản xuất taxol theo công nghệ vi sinh có thể thực hiện được. Tuy nhiên, cùng với quá trình nuôi cấy, F. oxysporum có thể bị thoái hóa, vì vậy, việc khảo sát quá trình hình thành taxol cần được nghiên cứu tiếp với các chất cảm ứng nhằm tăng và ổn định lượng taxol tạo thành. KẾT LUẬN Nghiên cứu bước đầu đã xác lập được chủng F. oxysporum thường hiện diện trên cây thông đỏ ở vùng Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng và khả năng sinh tổng hợp taxol của chủng này. Từ các kết quả của nghiên cứu trên, chúng tôi nhận thấy, môi trường PDB có bổ sung 0,1 mg vitamin B1 phù hợp cho F. oxysporum F-H.6.5- 030318-02 phát triển. Lượng sinh khối thu nhận cao nhất sau 16 ngày nuôi cấy tại nhiệt độ 24- 28oC là 9,71 g/l (tính theo khối lượng khô); lượng taxol thu nhận từ vi nấm là 250,98 mg/kg khối lượng khô của sinh khối là khá khả quan. Cần nghiên cứu tiếp với các chất cảm ứng và thay đổi các điều kiện sống của vi nấm, nhằm tăng lượng taxol thu nhận. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Carroll G., 1988. Fungal endophytes in stems and leaves: from latent pathogens to mutualistic symbiont. Ecology, 69: 2-9. doi:10.2307/1943154. 2. Chakravarthi B. V., Das P., Surendranath K., Karande A. A., Jayabaskaran C., 2008. Production of paclitaxel by Fusarium solani isolated from Taxus celebica. J. Biosci., 33: 259-267. 3. Gordon T. R., Martyn R. D., 1997. The Evolutionary Biology of Fusarium oxysporum. Annual Review of Phytopathology, 35: 111-128. 4. Harley J. L., Smith S. E.,1983. Mycorrhizal symbiosis. Academic Press, London. 5. Vương Chí Hùng, Nguyễn Tiến Hùng, Nguyễn Văn Tôn, Trần Công Luận, 2014. Phát triển nguồn gen thông đỏ (Taxus wallichianna Zucc) tại Lâm Đồng tạo nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc ung thư. Tạp chí Y Dược học quân sự, 2: 9-16. Dam Sao Mai, Vo Trung Au 89 6. Liu K., Ding X., Deng B., Chen W., 2009. Isolation and characterization of endophytic taxol-producing fungi from Taxus chinensis. J. Ind. Microbiol. Biotenol., 36: 1171-1177. 7. Miller J. D., Mackenzie S., Foto M., Adams G. W., Findlay J. A., 2002. Needles of white spruce inoculated with rugulosin-producing endophytes contain rugulosin reducing spruce budworm growth rate. Mycol. Res., 106: 471-479. doi:10.1017/S095375620200 5671. 8. Paul N. C., Kim W. K., Woo S. K., Park M. S., Yu S. H., 2007. Fungal endophytes in roots of Aralia species and their antifungal activity. Plant Pathol. J., 23: 287-294. 9. Stoner M. F., 1981. Ecology of Fusarium in noncultivated soils. Fusarium: Diseases, Biology, and Taxonomy. P. E. Nelson, T. A. Toussoun and R. J. Cook, eds. The Pennsylvania State University Press, University Park. pp. 276-286. 10. Wang J., Li G., Lu H., Zheng Z., Huang Y., Su W., 2000. Taxol from Tubercularia sp strain TF 5 an endophytic fugus of Taxus chinensis var. mairei Prikl. Biokhim Mikrobiol., 43: 490-494. 11. Zhou X., Zhu H., Liu L., Lin J., Tang K., 2010. A review: recent advances and future prospects of taxol producing endophytic fungi. Appl. Microbiol. Biotechnol., 86: 1707-1717. A STUDY ON ISOLATING THE ENDOSYMBIOTIC FUNGI FROM THE ROOTS OF Taxus wallichiana Zucc IN LAC DUONG, LAM DONG PROVINCE AND SURVEYING THE SUITABLE MEDIUM FOR THE RESEARCHED FUNGI Dam Sao Mai1, Vo Trung Au2 1Industrial University of Ho Chi Minh city 2Szent István University, Hungary SUMMARY This research focused on the mycorrhizal fungi (arbuscular mycorrhizae) which can synthetize taxol. Those fungi were isolated from Taxus wallichiana Zucc that grows in the natural forest in Lac Duong, Lam Dong province. According to the research, Fusarium oxysporum is mostly presented as endosymbiotic fungus (arbuscular mycorrhizae). The result showed that Fusarium oxysporum grew well on modified MMN medium supplemented with vitamin B1 (0.05 mg), KH2PO4 (0,9 g), NH4 (0.15 g), FeCl3 1% (1.8 mL); the received dried biomass was 10.85 g/l medium after 30 days of culture. Moreover, this fungus also developed very well on PDB medium supplemented with vitamin B1 of 0.1 g/l medium; the received dried biomass was 9.71 g/l medium after 16 days of culture. The received taxol was 250.98 mg/kg dried biomass. Keywords: Fusarium oxysporum, Taxus wallichiana, arbuscular mycorrhizae. Ngày nhận bài: 15-7-2013