Nghiên cứu hàm lượng lipit, protein và nhân gen chịu hạn Chaperonin tế bào chất đơn vị δ ở một số giống đậu tương nhập từ Úc

T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007 101 NGHIÊN CỨU HÀM LƯỢNG LIPIT, PROTEIN VÀ NHÂN GEN CHNU HẠN CHAPERONIN TẾ BÀO CHẤT ĐƠN VN δ Ở MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG NHẬP TỪ ÚC Nguyễn Văn Phú - Hoàng Thị Thu Yến (Khoa KH Tự nhiên & Xã hội – ĐH Thái Nguyên) Luân Thị Đẹp (Trường ĐH Nông lâm – ĐH Thái Nguyên) 1. Đặt vấn đề Đậu tương là giống cây trồng công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao và có tác dụng nhiều mặt trong sản xuất nông nghiệp. Ở nước ta, diện tích trồng cây đậu tương còn chưa phổ biến mới chỉ đạt khoảng 200000 ha và năng suất bình quân đạt khoảng 1,4 tấn/ha. So với các nước như Trung Quốc, Ấn Độ hay Mỹ và Braxin, tình hình sản xuất đậu tương ở nước ta vẫn ở mức thấp [3], [11]. Hiện nay, để tăng năng suất và chất lượng đậu tương chúng ta đã tiến hành cải tạo giống, đưa những giống có chất lượng vào sản xuất, chủ yếu là giống đột biến, giống lai và giống nhập ngoại. Tại Thái Nguyên nhóm nghiên cứu do PGS.TS. Luân Thị Đẹp, Trưởng Khoa Nông học, ĐHNL, ĐH Thái Nguyên làm chủ đề tài đã trồng thử nghiệm một số giống đậu tương được nhập từ Úc và đã cho năng suất khá cao [8]. Vấn đề đặt ra cho nghiên cứu này là xác định hàm lượng lipit, protein và nhân gen chịu hạn Chaperonin tế bào chất đơn vị δ ở một số giống đậu tương nhập từ Úc để góp phần chọn tạo giống đậu tương. 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu * Vật liệu, hóa chất, thiết bị Hạt của các giống đậu tương DT84(6), E085 -10, E085 -3, E036 - b(6), do cô giáo PGS.TS. Luân Thị Đẹp, Trưởng Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên chọn tạo các giống nhập từ Úc cung cấp. Giống đối chứng Bắc Kạn (BK) do cô giáo ThS. Nguyễn Thu Hiền, Khoa Khoa học cơ bản, Trường ĐH Y Khoa Thái Nguyên cung cấp để sử dụng nghiên cứu. Các hóa chất và thiết bị sử dụng được lưu giữ ở Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên và Xã hội; Phòng Di truyền học hiện đại, Khoa Sinh - KTNN, ĐHSP Thái Nguyên; Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học. * Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp xác định hàm lượng lipit, protein được tiến hành theo tài liệu của Phạm Thị Trân Châu [2]. - ADN tổng số được tách chiết và tinh sạch từ lá theo phương pháp của Becker và các cộng sự (1998) [1]. - Nhân gen chaperonin tế bào chất đơn vị δ bằng kỹ thuật PCR theo Karry Mulis (1985) với cặp mồi: + Mồi xuôi (forward primer) chap_N: 5’- GCC ATA TGT CGG CAA TCG CGG CCC C- 3’ + Mồi ngược (reverse primer) chap_C: 5’- CGG GAT CCC TAC CTC ACA GTT ACA ATA TCA TC-3’. - Phân tích sản phNm PCR bằng enzyme giới hạn theo Sambrook và cộng sự 2001 [9]. T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007 102 3. Kết qủa và thảo luận * Hàm lượng lipit và protein Chỉ tiêu về hình dạng, kích thước hạt chỉ là những đánh giá sơ bộ bên ngoài, chưa phản ánh được chính xác chất lượng của hạt. Nghiên cứu hàm lượng protein, lipit sẽ đánh giá được chất lượng của hạt. Kết quả phân tích hàm lượng protein và lipit trong hạt của 5 giống đậu tương được trình bày ở bảng 3.1 . Bảng1. Hàm lượng protein và lipit của các giống đậu tương STT Tên giống Hàm lượng lipit % so khối lượng chất khô Hàm lượng protein % so khối lượng chất khô 1 BK 20,70 ± 0,18 33,82 ± 0,25 2 E085 -3 21,35 ± 0,32 27,34 ± 0,34 3 E085 -10 24,67 ± 0,72 29,57 ± 0,46 4 DT84(6) 24,87 ± 0,34 30,04 ± 0,64 5 E036 -b(6) 22,78 ± 0,51 28,49 ± 0,43 Qua bảng 3.1 cho thấy hàm lượng lipit của các giống đậu tương dao động trong khoảng (20,70 ± 0,3)% đến (24,87 ± 0,34)% giống có hàm lượng lipit cao nhất là DT84(6) và thấp nhất là BK. Thứ tự sắp xếp các giống lần lượt theo thứ tự là: BK < E085 -3 < E036 - b(6) < E085 -10 < DT84(6). Hàm lượng protein là yếu tố quan trọng hàng đầu trong đánh giá chất lượng hạt, hạt càng nhiều protein thì sẽ cho đậu phụ với tỷ lệ đạm càng cao. Bảng 3.1 cho thấy hàm lượng protein tan của 5 giống đậu tương dao dộng trong khoảng 27,34% đến 33,82%. Trong đó giống có hàm lượng protein cao nhất là BK và thấp nhất là E085 - 3. Hàm lượng protein được sắp xếp theo thứ tự tăng dần là: E085 -3 < E085 -10 < E036 -b(6) < DT84(6) < BK So với các tác giả khác nghiên cứu về đậu tương thì hàm lượng protein và lipit của các giống được chúng tôi nghiên cứu phù hợp với các tài liệu về hàm lượng trong hạt đậu tương [3], [6],[7]. * Tách chiết ADN tổng số từ các giống đậu tương Dựa trên chỉ tiêu hóa sinh: lipit, protein; năng suất của các giống đậu tương E085-3, E085- 10, E036-b(6), DT84(6) và BK. Vì vậy, chúng tôi tiến hành phân tích di truyền ở mức độ phân tử các giống đậu tương này. Mẫu lá được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng để kìm hãm hoạt động phân hủy của nuclease, ADN tổng số được chiết ra khỏi tế bào bằng dung dịch đệm có chứa Tris HCl 10 mM pH=8,0; EDTA 10 mM; NaCl 10 mM; SDS 2,1%; và proteinase K với nồng độ 10 µg/ml. Ngay sau khi nghiền, protein và các phức enzym trong tế bào chịu sự tác động của các chất hoạt hóa bề mặt có trong dung dịch đệm và bị proteinase K phân huỷ. Vì vậy, ADN tổng số ít bị phân hủy, đặc biệt đối với đậu tương, tế bào của chúng chứa nhiều protein nên chúng tôi xử lý dịch Hình 1: Ảnh điện di tinh sạch ADN tổng số M. Maker 1 kb 3. DT84(6) 1. BK 4. E036- b(6) 2. E085- 3 5. E085- 10 T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007 103 chiết nhận được bằng chlorofom và isoamyl ancohol để đảm bảo loại protein ra khỏi chế phNm ADN. Thêm cồn tuyệt đối (100%) và để ở nhiệt độ thấp, hầu như toàn bộ ADN và ARN đều kết tủa. Sau khi rửa lại bằng cồn 70% và làm khô mẫu, chúng tôi đã hòa mẫu trong nước khử ion vô trùng, sau đó lấy một lượng chế phNm thích hợp đem điện di kiểm tra ADN thu được trên gel agarose. Từ kết quả điện di thu được ADN tổng số có kích thước và trọng lượng phân tử lớn nhất. Các phân tử ADN bị đứt gãy và ARN sẽ di chuyển nhanh hơn tạo thành vệt sáng cách xa về phía dưới băng ADN tổng số. Vì vậy, để đảm bảo cho những nghiên cứu tiếp theo chúng tôi tiến hành tinh sạch ADN, và thu được kết quả trên hình 1. * Nhân gen chaperonin tế bào chất đơn vị δ các giống đậu tương nghiên cứu Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, và chu trình nhiệt 94oC: 3 phút, 32 chu kỳ (94oC: 1 phút; 55oC: 1 phút 10 giây; 72oC: 1 phút 20 giây) kéo dài 8 phút ở 72oC sau đó giữ ở 4oC. Sau 32 chu kỳ phản ứng, sản phNm của phản ứng được bảo quản ở 4oC và được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% hình 2: Trên ảnh điện di đồ cho thấy, sản phNm PCR chỉ xuất hiện một băng ADN đặc hiệu có kích thước khoảng 1,6 kb. Kết quả này tương tự với kết quả mà Trần Thị Phương Liên và cộng sự (1998) Hoàng Thị Thu Yến và cộng sự (2003, 2004) đã công bố khi nghiên cứu nhân gen chaperonin ở một số giống đậu tương khác của Việt Nam [5], [10]. Đồng thời sản phNm PCR nhận được có kích thước phân tử giống với đoạn tương ứng cDNA của gen chaperonin giống đậu tương Nhật Bản [4]. Điều đó chứng tỏ sản phNm PCR chúng tôi thu được có thể chính là gen chaperonin mã hóa tiểu đơn vị δ. Như vậy kết quả sản phNm PCR chúng tôi thu được phù hợp với tính toán lý thuyết. * Phân tích sản ph/m PCR bằng enzim giới hạn Sau khi sử dụng phần mềm Bioedit để phân tích các trình tự gen chaperonin đơn vị δ đã công bố [5], [10], chúng tôi nhận thấy trình tự gen chaperonin có các điểm nhận biết cho enzyme giới hạn SacI. Như vậy, để có thể khẳng định sản phNm PCR thu được là gen chaperonin và nghiên cứu sự sai khác trình tự nucleotit ở trình tự nhận biết của enzyme SacI giữa gen chaperonin tiểu đơn vị δ thu được với các trình tự đã công bố, chúng tôi tiến hành xử lý sản phNm PCR bằng enzyme cắt SacI, sau đó điện di trên gel agarose 1,5% và thu được kết quả trên hình 3. Kết quả điện di cho thấy 3 giống nhập ngoại DT84(6), E036- b(6) và E085- 10 cho 5 băng AND tương ứng 5 đoạn ADN có kích thước tương ứng khoảng 260, 189, 198, 630, 387 bp. Kết quả này tương tự với các giống M103 và ML61 đã được đánh giá là có khả năng chịu nóng và chịu hạn. Trong khi đó kết quả cắt bằng enzim SacI ở giống đậu tương BK chỉ thấy xuất hiện 4 băng có kích thước tương ứng khoảng 260, 323, 387, 630. Kết quả này tương tự với giống Cúc Vàng và Bonminori. Như vậy, sản phNm PCR chúng tôi thu được chính là gen mã hóa chaperonin tế bào chất đơn vị δ. Hình 2: Ảnh điện di sản ph/m PCR các giống đậu tương nghiên cứu M. Maker 1 kb 3. DT84(6) 1. BK 4. E036- b(6) 2. E085- 3 5. E085- 10 T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007 104 KẾT LUẬN - Hàm lượng lipit 5 giống đậu tương nghiên cứu dao động từ 20,7% tới 24,87%. Giống có hàm lượng lipit thấp nhất đạt 20,7 là BK, cao nhất đạt 24,87% là DT84(6).Giống có hàm lượng protein cao nhất là BK, giống có hàm lượng protein thấp nhất là E085 -3 - Đã nhân được gen chaperonin tế bào chất đơn vị δ có kích thước phân tử khoảng 1,6 kb từ các giống đậu tương nhập ngoại và giống nội BK bằng kỹ thuật PCR. - Đã phân tích sản phNm PCR thu được bằng enzyme giới hạn SacI. ĐỀ NGHN Để có thể đưa ra những kết luận đầy đủ và chính xác về cấu trúc gen chaperonin của các giống đậu tương nhập từ Úc, cần phải xác định trình tự nucleotit của gen. Cần có những nghiên cứu tiếp theo để đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập từ Úc. SUMMARY Study Lipit and Protein content, multiply Chaperonin drought -resistant gene in several kinds of bean imported from Australia. The lipid content is from 20,7% to 24,87% of dry weight. The cultivars which had the lowest content of lipid were E085- 5 reaching 20,7%, the highest was DT84 (6) which reached 24.87%. The protein content of these cultivars ranged from 24, 11 to 33, 82% of dry weight. The cultivars that had the highest content of protein were BK. The cultivars that had the lowest content of protein were E085-3. The complete coding region of a cytosolic chaperonin gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the total genomic DNAs isolated from the leaves of soybean cultivars E085-3, E085-10, E036-b(6), DT84(6) and native cultivars (BK). These PCR products were analysed by enzyme SacI. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Becker., Shutov A. D., Nong Van Hai, Senyuk V. I., Jung R., Horstmann C., Fischer J., Nielsen N. C., Muntz K (1995), Purification, cDNA cloing and characterization of prsoteinase B an asparagine - specific endopeptidase, Eur. J. Biochem, vol. 288, pp. 456-463. [2]. Phạm Thị Trân Châu (1998), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội. Hình 3: Ảnh điện di sản ph/m cắt các giống đậu tương nghiên cứu M. Maker 1 kb 3. DT84(6) 1. BK 4. E036- b(6) 2. E085- 3 5. E085- 10 T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007 105 [3]. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. [4]. Nong Van Hai, Arahia M. Phan Van Chi, Zhang D., Fukazawa C.Eur.(1998), Cloning and characterization of soybean cytosolic chaperonin, a δ-subunit homologue ofchperonin containing t- complex polypeptide-1(CCT), European Juournal of Biochemistry. [5].Tran Thi Phuong L., Le Thi Thu H., Nguyen Dang T., Cao Xuan H., Nong Van H. and Le Thi M., Cloning of a cytosolic chaperonin gene from high-temperature tolerant soybean cultivar M103, Submitted (28-OCT-1998) Nong V., Applied DNA Technology Lab, Institute of Biotechnology (IBT), NCST, Nghiado, Caugiay, Hanoi, Viet Nam (AJ012318). [6]. Chu Hoàng Mậu (2001), Luận án Tiến sĩ Sinh học,. [7]. Trần Quang Minh (2004), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, hoá sinh hạt và đặc điểm phản ứng của kiểu gen một số giống đậu tương trồng tại Nam Định, Khoá luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Thái Nguyên,. [8]. Nguyễn Văn Nam (2006), Khảo nghiệm một số giống đậu tương vụ xuân trồng tại Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Khóa luận tốt nghiệp. [9].Sambrook, Russell D.W., Maniatis T. (2003), Molecular cloning, A labotatory manual. Cold sping Harbor laboratory press, 2001. [10]. Hoàng Thị Thu Yến, Nghiêm Ngọc Minh, Nông Văn Hải, Chu Hoàng Mậu, Trịnh Đình Đạt, Phân lập gen chaperonin ở các dòng đậu tương đột biến ML10, ML48 và ML61, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, NXB khoa học kỹ thuật, tr: 1073-1076. [11]. www.google/Fao/faostap.